A Model of Drosophila Larva Chemotaxis

Detailed observations of larval Drosophila chemotaxis have characterised the relationship between the odour gradient and the runs, head casts and turns made by the animal. We use a computational model to test whether hypothesised sensorimotor control mechanisms are sufficient to account for larval behaviour. The model combines three mechanisms based on simple transformations of the recent history of odour intensity at the head location. The first is an increased probability of terminating runs in response to gradually decreasing concentration, the second an increased probability of terminating head casts in response to rapidly increasing concentration, and the third a biasing of run directions up concentration gradients through modulation of small head casts. We show that this model can be tuned to produce behavioural statistics comparable to those reported for the larva, and that this tuning results in similar chemotaxis performance to the larva. We demonstrate that each mechanism can enable odour approach but the combination of mechanisms is most effective, and investigate how these low-level control mechanisms relate to behavioural measures such as the preference indices used to investigate larval learning behaviour in group assays

The Role of Drosophila Odorant Receptors in Odor Coding

Drosophila melanogaster is a powerful genetic model organism, and a promising model system in olfaction. At the onset of my thesis research, the expression patterns of fly’s 62 odorant receptors (ORs) were largely unknown. I set out to understand the rules of connectivity of olfactory sensory neurons and the resulting properties of olfactory circuit. Consequently, we assembled maps of the olfactory neuron projections in the fly brain and characterized the contribution of several ORs to olfactory-guided behavior. We compiled near-complete maps of OR-specific neuronal projections to the antennal lobe glomeruli of adult and larval fly brains. We analyzed expression profiles of 42 ORs, 31 of which are expressed in the adult and 21 in the larva, with an overlap of 10 ORs between the two developmental stages. Our results show surprising complexity in organization of the fly’s olfactory circuit. Four adult olfactory neuron populations co-express two ORs each and another olfactory neuron population expresses one odorant and one gustatory receptor. One glomerulus receives co-convergent input from two separate populations of olfactory neurons. Three ORs label sexually dimorphic glomeruli implicated in sexual courtship, and are thus candidate Drosophila pheromone receptors. The organization of larval antennal lobe is remarkably similar to that of adult flies and mammals; each glomerulus occupies a unique stereotyped position in the antennal lobe. Unlike in adults, each OR is expressed in only one neuron, forming glomeruli with single afferents. The olfactory sensory maps provide experimental framework for relating ORs to olfactory neuroanatomy, and ultimately, to output of the olfactory system. The Drosophila larval olfactory system shows great promise as a behavioral model. Larvae exhibit robust chemotaxis to odors and have a simple olfactory system. We utilized larvae to study response properties of three olfactory neurons to a large panel of odors. Behavioral assays of larvae with single olfactory neurons ablated, showed minimal effects on chemotaxis response, and thus great redundancy in function of olfactory neuron populations. Larvae with only Or42a olfactory neurons functional are able to chemotax robustly, demonstrating that chemotaxis is possible in the absence of the remaining elements of the olfactory circuit

Analysis of signalling pathways required for hemocyte navigation in Drosphila

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011A migração celular é um fenómeno fundamental e altamente regulado, que desempenha um papel activo numa grande variedade de processos biológicos. Por exemplo, é essencial para os processos de gastrulação e organogénese durante o desenvolvimento embrionário e, também, para o estabelecimento e manutenção da homeostasia do organismo durante a vida adulta, onde participa na reparação de feridas e na migração de células imunitárias para locais de inflamação. Falhas nos mecanismos de migração celular podem originar diversas patologias, tais como inflamações crónicas, defeitos congénitos e metastização de tumores. Os processos que permitem a migração celular despertam, por isso, grande interesse do ponto de vista terapêutico. O mecanismo de migração celular direccionada, também designado por quimiotaxia, tem sido principalmente analisado através de estudos em cultura de células imunitárias de mamífero. Estes estudos identificaram vários estímulos quimiotácticos, receptores celulares e vias de sinalização essenciais para a migração celular. Alguns destes estímulos quimiotácticos são compostos por moléculas difusíveis designadas por quimiocinas. Estas moléculas são reconhecidas por receptores que se encontram à superfície dos leucócitos, e que fazem parte de uma vasta família de receptores celulares, os receptores associados a proteínas G ou “G-protein coupled receptors” (GPCRs). Estes promovem respostas por parte da célula através de proteínas a eles associadas, as proteínas G ou “G-proteins”. Outros tipos de estímulos quimiotácticos, tais como factores de crescimento, tem a capacidade de activar outra classe de receptores, os receptores tirosina-cinase ou “receptor tyrosine kinases” (RTKs), que são também importantes na promoção de migração celular. A activação destes receptores leva ao recrutamento de moléculas sinalizadoras, nomeadamente a cinase de fosfatidilinositol (PI3K), importante para o estabelecimento da polaridade celular necessária para a migração celular. Embora estes estudos em culturas celulares tenham contribuído bastante para o nosso conhecimento sobre os mecanismos moleculares da migração celular, pouco se sabe acerca da regulação destes mecanismos no contexto de um organismo. É, portanto, fundamental o recurso a um modelo animal simples, e ao mesmo tempo relevante, para analisar estes processos. As células imunitárias ou hemócitos de Drosophila melanogaster (mosca-da-fruta) partilham muitas características com os seus equivalentes nos mamíferos, tanto em termos de função (fagocitose de microrganismos invasores e de corpos apoptóticos, por exemplo), como no seu desenvolvimento hematopoiético (regulado por factores de transcrição das famílias GATA, RUNX, e friend-of-GATA). Em semelhança aos leucócitos, os hemócitos são expostos a uma elevada variedade de estímulos quimiotácticos que têm de ser integrados para definir a sua direcção de migração. Recentemente, os hemócitos embrionários têm sido utilizados como um excelente sistema para o estudo da migração celular e da inflamação in vivo. Estes estudos revelaram que os componentes moleculares que regulam a migração celular são muito semelhantes aos dos leucócitos. Em D. melanogaster existem receptores da familia dos GPCRs e RTKs que desempenham um papel na migração determinados tipos celulares. Um exemplo importante, é o receptor Pvr, um RTK, que é necessário à migração de hemócitos durante o desenvolvimento embrionário. Além disso, a utilização de D. melanogaster como modelo de estudo permite tirar partido de tecnologias bastante avançadas e úteis como a microscopia confocal, e de vastas bibliotecas de mutantes e transgénicos. Outra vantagem é a utilização do sistema GAL4/UAS, que permite determinar a função e localização de diferentes moléculas especificamente nos tecidos e células em estudo e no estádio de desenvolvimento relevante. Assim, o objectivo deste projecto foi analisar o papel da cinase PI3K, dos GPCRs e dos RTKs no recrutamento de hemócitos para localizações específicas, durante a terceira fase larvar de D. melanogaster. Neste estádio do desenvolvimento, uma parte dos hemócitos encontra-se associada a vários tecidos, nomeadamente, à região anterior do intestino designada “proventriculus” (PV) e ao epitélio dorsal, onde estas células se distribuem por grupos sésseis ao longo do eixo antero-posterior da larva, os “sessile patches” (SP). Em primeiro lugar, estudou-se a função da cinase PI3K através da expressão nos hemócitos de uma forma Dominante Negativa (DN) e de uma forma Constitutivamente Activa (CA) desta proteína. Enquanto a primeira bloqueia a acção de PI3K, a segunda mantém-la constantemente activada. Quando se expressou a forma DN de PI3K especificamente nos hemócitos, observou-se um aumento na população de hemócitos no PV, ao passo que nos SP foi observada uma diminuição no número destas células. O efeito da forma DN de PI3K na população de hemócitos do PV é semelhante aos resultados recentemente obtidos em modelos de ratinho para colite, o que demonstra alguma semelhança entre estes dois modelos. Por outro lado, o fenómeno oposto foi detectado após a expressão da forma CA de PI3K. Isto é, quando constitutivamente activa, a cinase PI3K leva à diminuição do número de hemócitos no PV e ao seu aumento nos SP. Verificou-se ainda que as alterações no número de hemócitos são independentes de um potencial efeito da cinase PI3K na proliferação e apoptose destas células, confirmado através da utilização de imunomarcação com o anticorpo anti-fosfo histona H3 e da técnica de TUNEL. Estes resultados revelam que a cinase PI3K poderá ter um papel na regulação da migração de hemócitos em ambas regiões da larva mas a diferentes níveis. Para além disso, verificou-se que a modulação dos níveis de activação de PI3K leva a alterações na morfologia e propriedades adesivas dos hemócitos, o que indica que PI3K também pode ter um papel na regulação das propriedades adesivas destas células. Resumindo, a cinase PI3K parece ser necessária para o controlo e manutenção do tamanho destas populações de hemócitos possivelmente através da regulação da sua migração e/ou adesão aos tecidos adjacentes. Para analisar o papel de receptores envolvidos no recrutamento e na manutenção destas populações de hemócitos, preferencialmente a montante da cinase PI3K, efectuou-se um rastreio genético baseado na utilização de RNAi para silenciar a expressão de potenciais candidatos. Uma vez que existem cerca de 270 GPCRs e 21 RTKs em D. melanogaster, optou-se por se estudar apenas RTKs e GPCRs (e suas proteínas G associadas) que se sabe serem expressos nos hemócitos. Através deste rastreio genético foi possível identificar vários genes com diferentes funções na migração e/ou manutenção das populações de hemócitos: GRHR, btl, Pvr, e GRHRII. GRHR é um GPCR que parece ser importante para a homeostasia dos hemócitos. Blt é um RTK que poderá ser necessário para a regulação negativa do número de hemócitos nos SP. Pvr é também um RTK que poderá desempenhar uma função homeostática, mas ao mesmo tempo ser necessário para a migração dos hemócitos para o PV e SP, uma vez que se observou uma diminuição no número de hemócitos em ambas as localizações quando silenciada a sua expressão. Finalmente, identificou-se o gene GRHRII, que poderá funcionar a montante da cinase PI3K, uma vez que a expressão de RNAi contra este receptor provocou um efeito semelhante ao observado através da expressão da forma DN de PI3K. Dos quatro candidatos identificados, Pvr e GHRHII parecem ser os receptores mais relevantes. Sendo estes resultados preliminares, a próxima etapa deste projecto será validar os fenótipos observados através de outros métodos de análise. Por exemplo, para confirmar a função destes genes pode recorrer-se à utilização de mutantes e a análises epistáticas para determinar se o gene GRHRII actua a montante da cinase PI3K. Em conclusão, estes resultados revelam o papel crucial de diferentes proteínas na regulação das populações de hemócitos durante a terceira fase larvar de D. melanogaster. Em particular a cinase PI3K, que poderá controlar o número de hemócitos através dois processos distintos: i) através da regulação da sua migração, e/ou ii) através da regulação das propriedades adesivas da célula. O rastreio genético realizado permitiu ainda identificar receptores que poderão estar envolvidos na regulação da migração dos hemócitos destas duas regiões, nomeadamente GRHRII e Pvr. De facto, GRHRII poderá funcionar a montante da cinase PI3K e ter um papel na regulação dos números de hemócitos do PV e dos SP. Estes resultados são especialmente interessantes. Se se confirmar o papel deste GPCR no recrutamento de hemócitos, esta será uma descoberta relevante em termos evolutivos, uma vez que demonstra, pela primeira vez, que, à semelhança do que ocorre em mamíferos, os GPCRs desempenham uma função na migração das células imunitárias em D. melanogaster. Estes resultados também apoiam a ideia de que estas células necessitam de integrar diferentes informações provenientes de regiões diferentes para definirem a sua direcção de migração. Desta forma, este estudo fornece novos conhecimentos acerca das vias de sinalização necessárias durante o recrutamento de hemócitos para regiões específicas durante a terceira fase larvar em D. melanogaster e de como estas populações são mantidas. Estes conhecimentos poderão representar um importante contributo para o estabelecimento dos hemócitos como modelos para o estudo de migração celular.Cell migration is an essential and highly regulated mechanism that plays a role in a wide variety of biological processes throughout an organism‟s life. The dysregulation of cell migration can lead to several pathologies such as chronic inflammatory diseases, congenital defects and tumour cell metastasis. Directed cell migration or chemotaxis has been intensively analyzed through cell culture studies, mainly utilizing mammalian immune cells. These models identified several guidance cues, receptors and signalling pathways important for migration of leukocytes to target tissues and to sites of inflammation and damaged epithelia. However, a simple but reliable in vivo system is needed to uncover the mechanisms underlying immune cell migration within the organism. Drosophila melanogaster hemocytes share many important similarities with their mammalian counterparts in terms of function and haematopoiesis. Embryonic hemocytes are an established model to study cell migration in vivo, due to their amenability to live imaging and the array of genetic techniques that allow for functional analysis of molecular processes in specific cell types. The aim of this project was to analyze the role of Phosphoinositide 3-kinase (PI3K), G Protein Coupled Receptors (GPCRs) and Receptor Tyrosine Kinases (RTKs) in hemocyte recruitment to specific tissue targets in Drosophila third instar larvae, namely the intestine and dorsal epithelium. Here we show that PI3K is important for regulating the size and maintenance of these tissue-associated hemocyte populations, possibly by regulating hemocyte response to external signals and/or by modifying their adhesive properties possibly through Cadherin regulation. In addition, in a candidate screen we identified two receptors, a GPCR and an RTK, potentially required for the recruitment and/or maintenance of hemocytes at these locations. In the future, these results could help to better understand innate immune cell migration and to further establish hemocytes as models for in vivo cell migration

Live calcium imaging of Aedes aegypti neuronal tissues reveals differential importance of chemosensory systems for life-history-specific foraging strategies.

BackgroundThe mosquito Aedes aegypti has a wide variety of sensory pathways that have supported its success as a species as well as a highly competent vector of numerous debilitating infectious pathogens. Investigations into mosquito sensory systems and their effects on behavior are valuable resources for the advancement of mosquito control strategies. Numerous studies have elucidated key aspects of mosquito sensory systems, however there remains critical gaps within the field. In particular, compared to that of the adult form, there has been a lack of studies directed towards the immature life stages. Additionally, although numerous studies have pinpointed specific sensory receptors as well as responding motor outputs, there has been a lack of studies able to monitor both concurrently.ResultsTo begin filling aforementioned gaps, here we engineered Ae. aegypti to ubiquitously express a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6s. Using this strain, combined with advanced microscopy, we simultaneously measured live stimulus-evoked calcium responses in both neuronal and muscle cells with a wide spatial range and resolution.ConclusionsBy coupling in vivo live calcium imaging with behavioral assays we were able to gain functional insights into how stimulus-evoked neural and muscle activities are represented, modulated, and transformed in mosquito larvae enabling us to elucidate mosquito sensorimotor properties important for life-history-specific foraging strategies

Controlling Airborne Cues to Study Small Animal Navigation

Small animals such as nematodes and insects analyze airborne chemical cues to infer the direction of favorable and noxious locations. In these animals, the study of navigational behavior evoked by airborne cues has been limited by the difficulty of precisely controlling stimuli. We present a system that can be used to deliver gaseous stimuli in defined spatial and temporal patterns to freely moving small animals. We used this apparatus, in combination with machine-vision algorithms, to assess and quantify navigational decision making of Drosophila melanogaster larvae in response to ethyl acetate (a volatile attractant) and carbon dioxide (a gaseous repellant).Physic

Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis

The ability to respond to chemical stimuli is fundamental to the survival of motile organisms, but the strategies underlying odour tracking remain poorly understood. Here we show that chemotaxis in Drosophila melanogaster larvae is an active sampling process analogous to sniffing in vertebrates. Combining computer-vision algorithms with reconstructed olfactory environments, we establish that larvae orient in odour gradients through a sequential organization of stereotypical behaviours, including runs, stops, lateral head casts and directed turns. Negative gradients, integrated during runs, control the timing of turns. Positive gradients detected through high-amplitude head casts determine the direction of individual turns. By genetically manipulating the peripheral olfactory circuit, we examine how orientation adapts to losses and gains of function in olfactory input. Our findings suggest that larval chemotaxis represents an intermediate navigation strategy between the biased random walks of Escherichia Coli and the stereo-olfaction observed in rats and humans

Hybrid Microfluidic Devices For On-Demand Manipulation and Screening of Neurons and Organs of Small Model Organisms

Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster are widely used model organisms for neurological and cardiac studies due to their simple neuronal and cardiac systems, genome similarity to humans, and ease of maintenance in laboratories. However, their 50m-1mm sizes and continuous mobility impede their precise spatiotemporal manipulation, thereby, reducing the throughput of biological assays. By integrating glass capillaries into microfluidic devices and using 3D-printed fixtures for precise control, we have developed hybrid lab-on-a-chip devices to facilitate the processes of animal manipulation and stimuli control, using modules for single-organism selection, orientation, imaging and chemical stimulation. These microdevices enabled us to manipulate organisms individually and to orient them at any desired direction for imaging purposes. The applications of these hybrid microdevices were demonstrated in the optical and fluorescent imaging of C. elegans cells as well as cardiac screening of Drosophila larvae. This technique can be applied in fundamental biology, toxicology, and drug discovery

Sensorimotor pathway controlling stopping behavior during chemotaxis in the Drosophila melanogaster larva.

Sensory navigation results from coordinated transitions between distinct behavioral programs. During chemotaxis in the Drosophila melanogaster larva, the detection of positive odor gradients extends runs while negative gradients promote stops and turns. This algorithm represents a foundation for the control of sensory navigation across phyla. In the present work, we identified an olfactory descending neuron, PDM-DN, which plays a pivotal role in the organization of stops and turns in response to the detection of graded changes in odor concentrations. Artificial activation of this descending neuron induces deterministic stops followed by the initiation of turning maneuvers through head casts. Using electron microscopy, we reconstructed the main pathway that connects the PDM-DN neuron to the peripheral olfactory system and to the pre-motor circuit responsible for the actuation of forward peristalsis. Our results set the stage for a detailed mechanistic analysis of the sensorimotor conversion of graded olfactory inputs into action selection to perform goal-oriented navigation

The wiring diagram of a glomerular olfactory system.

The sense of smell enables animals to react to long-distance cues according to learned and innate valences. Here, we have mapped with electron microscopy the complete wiring diagram of the Drosophila larval antennal lobe, an olfactory neuropil similar to the vertebrate olfactory bulb. We found a canonical circuit with uniglomerular projection neurons (uPNs) relaying gain-controlled ORN activity to the mushroom body and the lateral horn. A second, parallel circuit with multiglomerular projection neurons (mPNs) and hierarchically connected local neurons (LNs) selectively integrates multiple ORN signals already at the first synapse. LN-LN synaptic connections putatively implement a bistable gain control mechanism that either computes odor saliency through panglomerular inhibition, or allows some glomeruli to respond to faint aversive odors in the presence of strong appetitive odors. This complete wiring diagram will support experimental and theoretical studies towards bridging the gap between circuits and behavior.This is the final version of the article. It first appeared from eLife via http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14859