Efeitos tróficos da inervação simpática : Papel da adenosina

Dissertação de Doutoramento em Medicina, área de especialização em Ciências Fisiológicas e Farmacológicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade do Port

Efeitos do retinol (vitamina A) frente à citotoxicidade causada pela 6-hidroxidopamina em células SH-SY5Y

Retinol (vitamina A) é um componente essencial na dieta, devido a suas ações biológicas variadas nos tecidos, incluindo o sistema nervoso central. O retinol age como anti ou como pró-oxidante, a depender do ambiente, uma propiedade chamada redox-ativa. A doença de Parkinson (DP) é uma patologia predominantemente relacionada à idade na qual neurônios dopaminérgicos na substância negra são progressivamente denervados. A 6-hidroxidopamina (6-OHDA) é uma neurotoxina capaz de induzir parkinsonismo in vivo. Neste trabalho, avaliamos se o retinol é capaz de prevenir a injúria causada por 6-OHDA na linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, um modelo de estudo da DP in vitro. As células foram pré-tratadas com retinol 1 e 5 μM 1 h antes de receber 6-OHDA 30 e 50 μM e as análises foram feitas após 24 h. A viabilidade celular foi avaliada pelos ensaios de incorporação de suforrodamina e de atividade de lactato-desidrogenase no meio de cultura; efetuamos ensaio de DCFH para produção de espécies reativas (ER); ELISA e Western blot para o imunoconteúdo de 4-hidroxinonenal (4-HNE) e nitrotirosina (nitroTyr). Além disso, foram realizados ensaios espectrofotométricos para conteúdo de grupos sulfidril (SH) e atividade de catalase (Cat), superóxido-dismutase (SOD), glutationa-peroxidase (GPx) e glutationa-S-transferase (GST). O retinol foi incapaz de prevenir a morte celular provocada pela 6-OHDA, assim como a produção de ER e dano oxidativo. A atividade de Cat e GPx não sofreu alteração em nenhum grupo experimental. A atividade de SOD aumentou no grupo retinol + 6-OHDA em relação ao controle, enquanto a atividade de GST aumentou no grupo somente retinol em relação ao grupo somente 6-OHDA. Concluímos que o retinol é incapaz de conferir neuroproteção neste modelo de estudo da DP, e estudos futuros com outros modelos são necessários para obtermos uma conclusão sobre as propriedades anti ou proneurodegenerativas do retinol em relação à DP.Retinol (vitamin A) is an essential component in diet due to several biological actions in tissues, including central nervous system. Retinol acts either as anti or as prooxidant, depending on the environment, a property called redox-active action. Parkinson’s disease (PD) is a predominantly age-related pathology in which dopaminergic neurons in the substantia nigra are progressively denervated. 6-hydroxydopamine (6-OHDA) is a neurotoxin able to induce parkinsonism in vivo. Here we tested if retinol prevents 6-OHDA-injury in SH-SY5Y human neuroblastoma cell line, a model for PD study in vitro. Cells were pretreated with retinol 1-5 μM 1 h before receiving 6-OHDA 30-50 μM. Analyses were performed after 24 h. We evaluated cell viability by sulforhodamine incorporation and lactate-dehydrogenase activity in culture medium assays; we performed DCFH assay for reactive species (RS) production; ELISA and Western blot for 4-hydroxynonenal (4-HNE) and nitrotyrosine (nitroTyr) immunocontents; and spectrophotometric assays for sulfhydryl (SH) groups content, as well as catalase (Cat), superoxide-dismutase (SOD), glutathione-peroxidase (GPx), and glutathione-S-transferase (GST) activities. Retinol was unable to prevent 6-OHDA-induced cell death, as well as RS production and oxidative damage. Cat and GPx activities did not change in any experimental group. SOD activity was increased in retinol + 6-OHDA group relative to control. GST activity was increased in retinol alone group relative to 6-OHDA alone group. We conclude that retinol is unable to confer neuroprotection in this PD study model, and future studies with other PD models are needed to have a better conclusion about retinol anti or proneurodegenerative properties in PD

Evaluation of dopaminergic degeneration influence on endothelial activity in experimental models of Parkinson's Disease

Parkinson’s disease (PD) is a common neurodegenerative disorder with no known cure. The animal models, in particular the PD models, are important tools in experimental medical science to better understand the mechanisms involved in disease pathogenesis. The ideal animal model for PD should recapitulate most, if not all, features of the human disease. Actual PD animal models available do not show prominent alpha-synucleinopathy, an hallmark of the disease, leading to their restrictive application to undisclosed important molecular mechanisms responsible for PD development. In this way, the implementation of a new model that mimic PD in a more consistent way will be an important step to improve future investigations. In this work, we developed a novel paraquat (PQ)-based chronic PD model by using osmotic minipumps to assure the continuous administration of low doses of PQ for a longer period. Besides the fact that the exposure paradigm mimics in a closer way what happen in humans, this model also reproduces several key characteristics of the human PD, including the important alpha-synucleinopathy. Recent studies have implicated the Blood-Brain Barrier (BBB) as one of the underexplored brain structures in PD. Clinical evidences indicate that BBB dysfunctions are associated with a number of serious CNS diseases. HMGB1 has been shown to be a long-searched-for nuclear danger signal passively released by necrotic cells inducing inflammation. Its receptor, RAGE, is expressed in various cells, including endothelial cells that are largely present in BBB being involved in chronic inflammation and cell proliferation and migration. Despite the importance of this receptor in several diseases such as multiple sclerosis, stroke, brain tumors, AD and cancer, there is no consistent information about this receptor in Parkinson's disease neuroinflammation. In previous studies, another RAGE ligand (S100B) have been reported to be overexpressed in PD patients, despite there are evidences that neuroinflammation associated with PD can compromise the BBB. In this way, it will be of great importance to analyse the expression levels of HMGB1 and RAGE within PD experimental models. Our results revealed an increase of HMGB1 and RAGE expression levels with more significance in vivo models, specifically in PQ and 6-hydroxidopamine models. In this way, the obtained results indicates that a deeper study of the role of both HMGB1 and RAGE in PD will be of great interest to understand they role in PD neuroinflammation and to know if they targeting may serve as a neuroprotective approaches against the development and/or progression of PD.A doença de Parkinson é uma doença neurodegenerativa cujas causas não se encontram totalmente compreendidas. Os modelos animais de Parkinson são ferramentas fundamentais em investigação permitindo o entendimento dos mecanismos envolvidos na patogénese da doença. O modelo animal ideal deve reproduzir muitas, se não todas, as características da doença de Parkinson. Os modelos atuais de Parkinson para além de não mimetizarem os modelos de exposição a toxinas que se pensa ocorrer nos humanos, não apresentam todas as características moleculares e bioquímicas fundamentais da doença de Parkinson, como por exemplo a acumulação de alfa-sinucleína, tornando-se assim restritivos no que se refere à sua aplicação. Deste modo, é necessário o permanente desenvolvimento de novos modelos que mimetizem a doença de Parkinson nos humanos de uma forma mais consistente. Neste projeto, desenvolvemos um novo modelo através da administração crónica de paraquato, via difusão lenta e prolongada de pequenas doses de paraquato assegurada por cápsulas de difusão osmótica. Este modelo desenvolvido por nós reproduz características importantes da doença humana, como é o caso da acumulação de alfa-sínucleina que não se observa nos anteriores modelos animais da doença de Parkinson induzidos por esta toxina. Em paralelo, estudos recentes têm-se focado no estudo da barreira hemato-encefálica que é uma estrutura pouco explorada nesta doença neurodegenerativa. Evidências clinicas demonstram que as disfunções nesta barreira estão associadas a um número elevado de doenças do sistema nervoso central. O HMGB1 tem sido demonstrado como um sinalizador de inflamação, sendo libertado por células necróticas durante estes processos, e tem como recetor, entre outros, o RAGE. Este recetor entre outras células está presente nas células endoteliais, que são o principal componente da barreira hemato-encefálica, e está envolvido em processos inflamatórios através da promoção da proliferação e migração celular. Apesar da importância deste recetor em doenças como AVC, tumores cerebrais e Alzheimer, não existe informação consistente acerca do seu envolvimento na doença de Parkinson. Em estudos anteriores, outro ligando do recetor RAGE (S100B) apresentou-se aumentando em doentes de Parkinson, e existem evidências de que a neuroinflamação observada em Parkinson compromete o funcionamento normal da barreira hemato-encefálica. Deste modo, existem boas indicações para analisar os níveis de expressão de HMGB1 e do recetor RAGE em modelos experimentais de Parkinson. Os resultados obtidos revelam um aumento da expressão de HMGB1 e RAGE com mais significado nos modelos in vivo de PQ e 6-OHDA. Os resultados obtidos sugerem que o papel do ligando HMGB1 tal como do seu recetor na doença de Parkinson, deve ser explorado como forma de perceber se serão marcadores consistentes da neuroinflamação observada nesta doença e se poderão constituir importantes alvos terapêuticos

Implicación del sistema noradrenérgico central en la respuesta hipertensa al estrés por deprivación social

Tesis Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Biología Animal II (Fisiología animal), leída el 02-10-1992Depto. de Genética, Fisiología y MicrobiologíaFac. de Ciencias BiológicasTRUEpu

Estudio del efecto citoprotector y proliferativo del extracto hidroalcohólico de semillas de mucuna urens sobre un cultivo in vitro de células PC-12 tratadas con dosis crecientes de 6-hidroxidopamina

Proyecto de Graduación (Bachillerato en Ingeniería en Biotecnología) Instituto Tecnológico de Costa Rica, Escuela de Biología, 2010.La enfermedad de Parkinson es una patología neurodegenerativa producida por la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra y la disfunción de los circuitos neuronales relacionados con el control de los movimientos. Mucuna urens es una planta (Fabaceae) cuya semillas contienen altas concentraciones de levodopa, utilizada desde hace más de 5000 años para el tratamiento de enfermedades como el Parkinson. El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto citoprotector y proliferativo de diversas concentraciones del extracto hidroalcohólico de las semillas de M. urens sobre un cultivo in vitro de células PC-12 tratadas con dosis crecientes de 6-OHDA. Entre los principales hallazgos obtenidos se encuentra una proliferación considerable (superior a 30% sobre el control positivo) de las células incubadas a concentraciones de 0.05 y 1mg/mL del extracto. Además, se observó un efecto de citoprotección, presumiblemente de carácter antioxidante, en células preincubadas con 0.25mg/mL de extracto ante concentraciones de 0.20 y 0.30 mmol/L de neurotoxina. Con este estudio se logró comprobar la capacidad proliferativa y citoprotectora in vitro del extracto hidroalcohólico de M. urens; el cual podría tener implicaciones en tanto en el tratamiento regenerativo como en el preventivo; respectivamente. Así mismo se logró estandarizar el modelo experimental de la línea celular PC-12, ampliamente utilizada a nivel internacional para la investigación de los mecanismos moleculares y celulares de las enfermedades neurodegenerativas y la búsqueda de nuevos tratamientos contra las mismas

Efecto del Consumo de Astaxantina en la Salud

El presente trabajo trata de una recopilación de los artículos más relevantes publicados sobre la astaxantina y la mejora o prevención de enfermedades, enfatizando su rol como antioxidante y antiinflamatorio. Se ha realizado una extensa búsqueda de publicaciones científicas en las siguientes bases de datos electrónicas especializadas: PubMed central (PMC)-NBCI, Elsevier Journal, Scielo España, Scirus, Science Direct, para establecer el estado actual del potencial efecto de la astaxantina en el control de algunas enfermedades. Se ha demostrado su efecto, en líneas celulares y en animales, contra el cáncer, enfermedades crónicas inflamatorias, síndromes metabólicos, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales y del hígado, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades oculares, y en enfermedades de la piel. En humanos se ha mostrado su efecto en mejora de parámetros antioxidantes, antiinflamatorios, disminución de especies reactivas de oxígeno y mejora de la proporción de lípidos en sangre, mejoría en parámetros oculares, aumento de la resistencia al ejercicio, y mejora en la fertilidad masculina. En los estudios clínicos realizados hasta ahora no se han demostrado efectos adversos por lo que se podría utilizar la astaxantina como terapia preventiva. Tenemos una sociedad polimedicada y el uso de principios activos procedentes de alimentos, como la astaxantina, puede ser una buena alternativa o complemento

Estudo do efeito da suplementação cronica com ácidos graxos poliinsaturados da família omega-3 (n-3) sobre aspectos motores e bioquímicos em modelo animal de doença de Parkinson

Orientadora: Anete Curte FerrazDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 03/12/2008Inclui bibliografia e anexoÁrea de concentração: FisiologiaA doença de Parkinson (DP) é uma patologia neurodegenerativa caracterizada pela progressiva morte das células dopaminérgicas do sistema nigroestriatal, com conseqüente redução da concentração de dopamina no estriado, levando à manifestação de sintomas clínicos como tremor de repouso, rigidez, bradicinesia e disfunção na marcha. Neste trabalho investigamos o efeito da suplementação crônica com óleo de peixe (OP), rico em ácidos graxos poliinsaturados da família ômega-3 (n-3), sobre o comportamento motor e dosagens bioquímicas, em modelo animal de doença de Parkinson. Para isso, 4 µg de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) ou 2 µL de líquido cefalorraquidiano artificial foram administrados unilateralmente ou bilateralemente, no feixe prosencefálico medial dos animais, diariamente suplementado com OP (4 g/kg/dia), a partir do 21° ao 90° dia de vida, assim como em animais controles (não suplementados). A análise do perfil lipídico, no córtex cerebral e na substância negra, realizada através de cromatografia líquida de alta precisão (HPLC) indicou que os suplementados com OP apresentaram incorporação do ácido graxo docosahexaenóico (DHA) em ambas as estruturas, mas não alterou o nível de peroxidação lipídica, determinado pelo método de avaliação das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs). No entanto, no grupo lesado, os animais controles mostraram significante aumento nos níveis de peroxidação lipídica na substância negra comparado aos suplementados com OP, os quais mantiveram níveis similares ao grupo falso operado não suplementado. Tal efeito neuroprotetor, porém, não foi suficiente para a preservação dos neurônios dopaminérgicos, nem para sua manutenção fenotípica, uma vez que a avaliação imunohistoquímica para a enzima tirosina hidroxilase mostrou redução da densidade óptica, na substância negra parte compacta (SNpc) e na área tegmentar ventral. Além disso, a suplementação com OP não alterou a concentração de DA e seus metabólitos (DOPAC e HVA) no estriado, depletados nos animais lesados com a neurotoxina 6- OHDA, em ambos os grupos experimentais. De acordo com os testes comportamentais, que avaliaram ambulação e tremor de mandíbula, o OP não se mostrou eficaz em minimizar os déficits motores originados da lesão no sistema nigroestriatal. Por outro lado, foi hábil em reduzir o comportamento rotacional, induzido por apomorfina, sugerindo assim, um efeito neuroprotetor sobre as discinesias, muito embora, através de mecanismos que ainda necessitam ser elucidados. Baseados no resultados acima mencionados, estudos futuros sobre ação do óleo de peixe em protocolos que mimetizem fases iniciais da doença de Parkinson fazem-se necessários.Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative pathology characterized by progressive death of dopaminergic cells from the nigro-striatal system, with consequent reduction of dopamine concentration in the striatum, leading to the manifestation of clinical symptoms such as resting tremor, rigidity, bradykinesia, and gait dysfunction. In the present work, we investigated the effect of chronic supplementation with fish oil (FO), rich in polyunsaturated fatty acids from the omega-3 (n-3) family, on motor behavior and on biochemical dosage in an animal model of Parkinson’s disease. For that matter, 4 µg of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or 2 µL of artificial cerebrospinal fluid was unilaterally or bilaterally administered into the medial forebrain bundle of animals daily supplemented with FO (4 g/kg/day), from their 21° to their 90° day of life, as well as of control animals (not supplemented). Cerebral cortex and substantia nigra lipidic profile analysis, performed through high performance liquid chromatography (HPLC), indicated that animals supplemented with FO presented docosahexaenoic acid (DHA) incorporation in both structures but no altered lipidic peroxidation level, determined by the thiobarbituric acid reactive substances (TBARs) assay. Nevertheless, in the lesioned group, the control animals showed significantly increased levels of lipidic peroxidation in the substantia nigra compared to the ones supplemented with FO, whose levels were similar to those of sham-operated non-supplemented animals. Such neuroprotective effect, however, was not enough for the preservation of dopaminergic neurons, neither to their phenotypical maintenance, since tyrosinehydroxylase immunohistochemical evaluation showed reduction of optical density in the substantia nigra pars compacta (SNpc) and in the ventral tegmental area. Besides that, FO supplementation did not alter the concentration of dopamine and its metabolites (DOPAC and HVA) in the striatum, depleted in animals lesioned with the neurotoxin 6-OHDA, in both experimental groups. According to the behavioral tests, which evaluated ambulation and jaw tremor, FO was not able to minimize motor deficits originated from the lesion into the nigro-striatal system. On the other hand, it was able to reduce the rotational behavior induced by apomorphine, therefore suggesting a neuroprotective effect on dyskinesias, even though the mechanisms through which it occurs still need to be elucidated. Based on the aforementioned results, future studies about the action of fish oil on protocols that simulate initial stages of Parkinson’s disease are necessary

Importancia dopaminérgica en farmacodinamia de cocaína evaluada por alteraciones de GABA y glutamato en el núcleo accumbens de ratas

The aim of the present study was to investigate the role of dopamine in cocaine pharmacodynamics in rats. To test this hypothesis, we measured GABA and glutamate level changes in the accumbens nucleus. This approach is supported by the preponderance of evidence which has consistently shown alterations in dopaminergic activity after cocaine administration. Furthermore, GABA and glutamate have considerable irnportance in cocaine's acute and chronic effects. The relationship between GABA and glutamate with dopaminergic activity in the nucleus accumbens is well-known. A 16-day study was designed for the administration of cocaine chlorhydrate (IP) at 30 mglkglday increasing by 5 mglkglday each 4 days to animals which had been stereotaxically injured in the nucleus accumbens with 6-OH-dopamine (6-OHDA) neurotoxin dissolved in ascorbic acid. A base group was formed which received ascorbic acid diluted in 0.9% saline solution stereotaxically in the nucleus accumbens, and was treated with an equal volume of 0.9% saline solution (IP). The control group received 6- OHDA (diluted in ascorbic acid) stereotaxically in the nucleus accumbens and was given 0.9% saline solution as treatment. GABA and glutamate levels were determined by enzymatic assays. The results of this work show a significant decrease of GABA levels in the group that received chronic cocaine administration in comparison to the base and control group. Glutamate levels were significantly higher in the cocaine group than in the base group, but not significantly different from the control group. In conclusion, the results of the present work suppofi the idea of the great irnportance of dopaminergic activity in cocaine pharmacotherapy. This dopamine role could be either through GABA or glutamate level alterations or both. Direct action of increased cocaine level on the so-called reward system could be another explication.Este trabajo se propuso demostrar la importancia del sistema dopaminérgico en la farmacodinamia de cocaína en el SNC de ratas. Este postulado se verificó evaluando las alteraciones de GABA y glutamato en el núcleo accumbens. Este enfoque se sustenta en la gran cantidad de evidencias que muestran, consistentemente alteraciones en la actividad dopaminérgica por cocaína. Además, el GABA y el glutamato tienen gran importancia en los efectos agudos y crónicos por cocaína. Es bien conocida la interrelación de GABA y glutamato con la actividad dopaminérgica en el núcleo accumbens. Se diseñó un estudio por 16 días de administración de cocaína a ratas a la dosis inicial de 30 mglkgldía (IP) con incremento de 5 mglkg cada 4 días, a las cuales se les había lesionado la actividad dopaminérgica en el núcleo accumbens con la neurotoxina 6- hidroxidopamina en ácido ascórbico. Además, se conformó un grupo basal que recibió estereotáxicamante, en el núcleo accumbens, ácido ascórbico en solución salina 0,9% y se trató con un volumen correspondiente de solución salina (IP) y, un grupo control, al cual estereotáxicamente, en el núcleo mencionado, se le administró 6-OHDA (en ácido ascórbico), recibiendo posteriormente como tratamiento solución salina (IP). La determinación de los niveles de GABA y glutamato se realizó por métodos enzimáticos. Se observó que la administración crónica de cocaína produce una disminución significativa en el nivel de GABA en el núcleo accumbens del grupo problema, con relación a los grupos basal y control. En tanto, el nivel de glutamato en el grupo problema mostró un incremento significativo con relación al grupo basal, pero, no con relación al grupo control. En conclusión, los resultados de este trabajo sostienen la hipótesis del papel importante que tiene la dopamina en la farmacoterapia de cocaína a través de las alteraciones en los niveles de GABA y glutamato o alteraciones en forma directa. Además, la cocaína podría alterar por sí misma la actividad gabaérgica y glutaérgica

Utilización de derivados de quinazolinas para enfermedades neurodegenerativas

Peer reviewedConsejo Superior de Investigaciones CientíficasT3 Traducción de patente europe

O Papel do Flavonoide Apigenina em um modelo in vitro da Doença de Parkinson na linhagem celular SH-SY5Y

Doença de Parkinson (DP) é a segunda desordem neurodegenerativa mais comum no mundo. A neuroinflamação crônica, o estresse oxidativo associado a disfunção mitocondrial e a morte dos neurônios dopaminérgicos da susbstância negra são características típicas da fisiopatologia da desordem. Por outro lado, estudos tem sugerido que o uso de compostos bioativos naturais, como a apigenina (APG), podem atenuar tais características fisiopatológicas e a progressão da desordem. O objetivo do estudo foi verificar o papel da APG em modelo in vitro da DP. Para isso, foi utilizado um modelo de estudo da DP por meio de dano induzido pela 6-hidroxidopamina (6-OHDA) na linhagem celular SH-SY5Y submetida à um protocolo de diferenciação neural de screening rápido. Os resultados obtidos sugerem que o modelo apresenta importantes características neurais não observadas em estudos similares. Em todas as situações investigadas, a APG apenas demonstrou atenuar os efeitos sob viabilidade celular quando em co-tratamento com o dano realizado pela 6-OHDA. Dessa forma, a APG não revelou-se como um agente neuroprotetor efetivo neste modelo da DP. Cabe ressaltar que este é o primeiro estudo a investigar o papel deste fitoterápico em um modelo da DP induzido por 6-OHDA.Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder. Chronic neuroinflammation, oxidative stress associated with mitochondrial dysfunction and dopaminergic neuron loss in the substantia nigra are typical characteristics of the disorder. On the other hand, studies suggest that therapeutic phytochemicals, such as apigenin (APG), may attenuate both physiopathological characteristics and the disorder progression. The aim of the study was to investigate the effects of APG in an in vitro model of PD. In order to achieve this, we used a model of 6-hidroxidopamine (6-OHDA) induced damage in the SH-SY5Y cell strain. Cells underwent differentiation into neural cells using a screening protocol. The results indicate that the model presents key characteristics that differ from similar studies in the literature. In every investigated situation, APG seems to solely attenuate the harmful effects to cell viability when administered simultaneously with 6-OHDA. In this sense, our study does not reveal APG as having a neuroprotective effect in this PD model. It is noteworthy that this is the first study to investigate the role of APG in a 6-OHDA induced model of DP