Gene delivery to neural stem cells using minicircles and plasmids without CpG motifs

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Neural Stem Cells (NSC) are multipotent stem cells, capable of proliferating and differentiating in vivo and in vitro into astrocytes, oligodendrocytes and neurons. For this reason they hold a great potential for the development of gene and regenerative therapies for the treatment of neurodegenerative diseases and brain cancer. However, transfection of NSCs has proven to be difficult through conventional methods, and the disadvantages associated with the use of viral vectors make non-viral vectors more suitable for the development of gene delivery assays to NSCs. Apart from the non-viral method, one of the most important factors in gene delivery is the type of used vector. One of the factors that mostly affect the vector efficiency is the presence of CpG motifs. These motifs are responsible for the triggering of innate and acquired immune responses contributing to episomal silencing of the transgene. In this study, gene delivery to NSCs was optimized for the use of microporation technology and transfection efficiency was compared for the use of different transfection vectors with low vs. high CpG content, namely, minicircles, pCMV-GFP and pVAX-eGFP. The optimization of microporation conditions revealed that depending on the electroporation buffer, high number of transfected cells (60 to 75%) and low cell mortality (15-10%) are obtained when using 1500V, 20 ms and 1 pulse or 1800V, 20 ms and 1 pulse as microporation conditions. When comparing the transfection efficiency using different vectors it was evident that Minicircle was the vector that allowed the obtainment of sustained and higher number of transfected cells (75%) without affecting their survival (80-90% of cell viability) and morphology. The quantification of vector copies in the nuclei revealed that the optimal dose to transfect NSCs is around 0.8 μg, and that, although a similar number of Minicircle and pCMV-GFP copies per nucleus is found, the first are the vectors that yield the highest expression levels. Long term analysis also showed Minicircles are less degraded, exhibiting higher number of copies and GFP expression than pCMV-GFP or pVAX-eGFP. Finally, microporation did not seem to affect NSCs differentiation potential. Taken together, these results offer the first insights in the use of microporation and minicircles in non-viral transfection of NSCs, suggesting that microporation is a promising tool for NSCs transfection and that minicircles offer a new model of efficient and safe non-viral gene delivery to NSCs and have unquestionably a potential use for clinical applications and genetic engineering.Células estaminais representam um grupo específico de células indiferenciadas que apresentam a capacidade de se auto-renovar e de se diferenciar, quando estimuladas por determinadas condições, em células várias linhagens distintas. Existem dois tipos distintos de células estaminais: embrionárias e adultas. As células embrionárias apresentam a capacidade de se especificarem em vários tipos celulares no entanto, os problemas éticos muitas vezes associados com o seu isolamento e potencial cancerígeno, limitam o seu uso. Por este motivo, o interesse em células estaminais adultas, que apresentam apenas a capacidade de se especificar em tipos celulares provenientes do seu tecido de origem, tem vindo a aumentar exponencialmente. Células estaminais neurais (Neural stem cells – NSC) representam uma população de células que pode ser isolada a partir de tecido cerebral embrionário, fetal ou adulto. No cérebro em desenvolvimento estas células existem como progenitores neuroepiteliais que se diferenciam em vários progenitores neurais que vão dar origem aos três tipos celulares característicos do sistema nervoso, astrócitos, oligodendrócitos e neurónios. No sistema nervoso adulto, estas células representam uma população de astrócitos que têm a capacidade de se diferenciar em caso de infecção ou inflamação, e habitam nichos específicos na zona subventricular do prosencéfalo e na zona subgranular do hipocampo. A sua capacidade única de se diferenciarem em células do sistema nervoso e de, após enxerto, conseguirem ultrapassar a barreira hematoencefálica, faz com que estas células apresentem um elevado potencial para o desenvolvimento de terapias regenerativas e genéticas para o tratamento de doenças neurodegenerativas e de cancro do cérebro. Em cultura, estas células são aderentes ou formam complexos esféricos de progenitores neurais, apresentam a forma bipolar e expressam factores característicos de células neuronais, tais como nestina, Sox2 e Pax6, e astrogliais, tais como GFAP, GLAST, BLBP e RC2. A capacidade de diferenciação que estas células apresentam e o desenvolvimento de protocolos de diferenciação simples e eficazes fez com que as NSCs tenham sido alvo de diversos estudos de regeneração de tecidos e transferência de genes. Estudos recentes demonstraram que em caso de enxerto, as NSCs conseguem diferenciar-se em neurónios dopaminérgicos e substituir lesões em modelos de doença de Parkinson e conseguem reduzir o processo inflamatório em modelos de esclerose múltipla. Em termos de entrega de genes, os estudos efectuados demonstraram que as NSCs podem ser transfectadas e entregar genes terapêuticos que potenciam o melhoramento de várias doenças de foro neurológico. Um dos grandes problemas até agora tem sido o desenvolvimento de métodos de transfecção eficientes. Até muito recentemente, a transfecção de NSCs era basicamente feita através de métodos virais, no entanto os problemas patogénicos associados a estes vectores e a possibilidade de indução de mutagénese das células transfectadas fez com que a atenção dos cientistas divergisse para as metodologias não virais. Em comparação com as primeiras, estas metodologias oferecem uma série de vantagens, tais como, maior capacidade de empacotamento, menor imunogenicidade, fácil e maior segurança de manuseamento. A entrega de genes usando estes métodos pode ser feita através de tratamentos químicos, como partículas de fosfato de cálcio, biopolímeros biodegradáveis e liposomas catiónicos, e através de tratamentos físicos, tais como sonoporação, bombardeamento de partículas, magnetofecção, electroporação e microporação. Para além do método de transfecção, há que ter em atenção o tipo de vector usado. Após transfecção, os vectores têm que ultrapassar barreiras extra e intracelulares que causam silenciamento episomal do transgene. É por este motivo que têm sido desenvolvidos muitos trabalhos com o intuito de melhorar os vectores. Um dos factores que mais afecta a eficiência de um plasmídeo é o conteúdo deste em motivos CpG. Estes dinucleótidos não-metilados são característicos de genomas bacterianos e, se presentes em plasmídos, são reconhecidos pelo sistema imunitário de mamíferos, mais especificamente por células que expressam TLR9, despoletando reacções imunológicas inatas e secundárias que levam à degradação do vector e posterior silenciamento do transgene. Recentemente têm sido produzidos plasmídeos de conteúdo reduzido em motivos CpG que em relação aos pDNAs convencionais, apresentam eficiência e persistência melhoradas. Para além destes tipos de vectores, o desenvolvimento da tecnologia de minicirculos, que são pequenos vectores desprovidos de sequências bacterianas e de conteúdo CpG reduzido, permitiu um melhoramento de 10 a 10,000x das eficiências de transfecção em relação aos pDNAs convencionais. O objectivo principal deste estudo foi a optimização das condições de transfecção não viral de NSCs (CGR8-NSC) por microporação e a comparação das eficiencias de transfecção de NSCs quando transfectadas com minicirculos e pDNAs com conteúdo em motivos CpG reduzido ou mesmo inexistente. Neste estudo, foram feitas duas optimizações das condições de microporação para o uso de dois tampões de electroporação diferentes, o RB, um tampão de formulação desconhecida, e o HMB, um tampão preparado no laboratório e que já tinha sido utilizado para transfectar células HEK293T e células estaminais mesenquimatosas. A microporação com o tampão RB foi feita transfectando pVAX-eGFP e variando a voltagem (entre 1400 e 1600V), a duração do pulso (20 e 30 ms) e o número de pulsos (1 e 2). A condição que no geral demonstrou ser mais eficaz foi 1500V, 20 ms e 1 pulso (percentagem de células transfectadas ≈ 60%; viabilidade e recuperação celular 85-90%). A optimização com HMB foi feita microporando as NSCs com dois vectores diferentes (pVAX-eGFP e MC-GFP) e variando a voltagem entre 1600 e 1900V. Apesar de, com o aumento da voltagem se ter verificado, em ambos os casos, uma diminuição das viabilidades e recuperações celulares (mais acentuada em células transfectadas com pVAX-eGFP), no geral, a condição que obteve os melhores resultados, exibindo as percentagens de células transfectadas (50 e 75% com pVAX-eGFP e PC-GFP) e rendimentos de transfecção (47 e 69% com pVAX-eGFP e MC-GFP) mais elevadas foi 1800V, 20 ms e 1 pulso. Um outro ensaio de optimização foi efectuado para determinar a quantidade ideal de DNA para transfectar NSCs. Para isto, NSCs foram ressuspendidas em RB e transfectadas com várias quantidades de pVAx-eGFP (0.5, 0.8, 1.0 e 1.5 μg) usando 1500V, 20 ms e 1 pulso como condições de microporação. Apesar de o aumento de DNA não ter afectado a percentagem de células GFP+ (≈50%) e de ter provocado uma diminuição das viabilidades e recuperações celulares, 0.8 μg foi a quantidade de pDNA que exibiu o maior rendimento de transfecção (≈40%), tendo sido por isso considerada a quantidade ideal de vector para transfectar NSCs. Para testar a eficiência de transfecção de minicirculos e outros pDNAs com conteúdo reduzido ou inexistente em CpGs as NSCs foram transfectadas com 2.0 x 1011 moléculas de cada vector. A transfecção com plasmídeos sem motivos CpG (pCpGfree-eGFP) revelou-se muito aquém do esperado, e quando comparando com NSCs transfectadas com pVAX-eGFP, a percentagem de células GFP+ era menor e o decaimento da expressão do transgene ao longo do tempo mais rápido em células transfectadas com pCpG-eGFP, indicando que talvez, o promotor deste plasmídeo não seja tão eficiente como o do pVAX-eGFP. Comparando células transfectadas com minicirculos (MC-GFP) com outros pDNAs (pCMV-GFP – plasmídeo correspondente de MC-GFP, e pVAX-eGFP) verificou-se que usando MC-GFP é possível manter elevados níveis de células transfectadas (≈75%) sem comprometer a viabilidade celular (80-90%) e a morfologia bipolar característica das NSCs em cultura. Adicionalmente, a expressão do gene mantém-se mais alta com MC-GFP ao longo de 10 dias e não afecta a proliferação celular. Testes adicionais foram efectuados para quantificar o número de cópias de vector no núcleo de NSCs transfectadas. Em estudos anteriores tinha-se verificado que há uma certa dose de plasmídeo a partir do qual a expressão do transgene satura. Em NSCs verificou-se que, independente do vector, a partir de 0.8 μg há uma estabilização e posterior decaimento da expressão da GFP, e, quando comparando o número de cópias de cada vector no núcleo, verificou-se que apesar da quantidade de MC-GFP e pCMV-GFP ser semelhante, o nível de expressão do primeiro era mais elevado. Adicionalmente, a análise ao longo de 10 dias da quantidade de cópias do núcleo revelou que o MC-GFP era o vector que se encontrava em maior quantidade no núcleo e o que revelava maiores níveis de expressão do transgene, indicando que este, devido ao seu menor tamanho e conteúdo CpG mais reduzido (≈6%) é menos degradado que os outros plasmídeos. Em comparação, os resultados com pCMV-GFP e pVAX-eGFP, que apresentam conteúdo semelhante em motivos CpG (≈7%), diferem muito entre si, apresentando o pCMV-GFP eficiências e viabilidades celulares mais elevadas. Este facto é difícil de ser explicado mas há três diferenças entre estes dois plasmideos que podem justificar esses valores: i) diferente sinal de poliadenilação dos dois plasmídeos (pVAX-eGFP apresenta o sinal BGH e o pCMV-GFP apresenta o sinal SV40), que como estudos anteriores já demonstraram pode influenciar os níveis de expressão, ii) diferenças na sequência do gene reporter que pode originar uma proteína com maior ou menor intensidade de fluorescência; iii) ou ao nível de purificação de cada plasmídeo. Finalmente, nem o uso de microporação nem a transfecção com plasmídeo afectou a capacidade de diferenciação das NSCs em neurónios. Comparando os resultados obtidos é possível concluir que o uso de microporação como método de transfecção de NSCs dá origem a elevadas eficiências de transfecção. Em comparação com os outros pDNAs, os Minicirculos foram os vectores que demonstraram as melhores eficiências de transfecção e os maiores níveis de expressão do transgene sem comprometer a morfologia e a viabilidade das células. Pode-se concluir que o tamanho destes vectores e que a diferença e 1% no conteúdo em motivos CpG é suficiente para que o silenciamento episomal do transgene seja mais fraco com MC-GFP. Como trabalho futuro, seria interessante avaliar a expressão de TLR9 em NSCs após transfecção para verificar se há realmente silenciamento devido aos motivos CpG e quantificar o RNA mensageiro para avaliar a estabilidade e frequência do transgene. Seria também muito benéfico avaliar a eficiência dos minicirculos através de transfecção por outros métodos não virais, tais como, lipofecção ou magnetofecção, e efectuar estudos in vivo para avaliar o tráfico intracelular de minicirculos, e também clonar um gene de interesse nos minicirculos para avaliar o seu potencial no desenvolvimento de futuras terapias para doenças de foro neurológico. Até à data, ainda não tinham sido efectuados estudos de transfecção em NSCs usando microporação ou minicirculos. Este trabalho representa a primeira perspectiva para o uso destas tecnologias para a transfecção destas células e indica que os minicirculos representam um novo modelo eficiente e seguro de entrega não viral de genes para NSCs e uma alternativa muito promissora para o desenvolvimento de terapias para o tratamento de doenças neurodegenerativas ou cancro do cérebro onde uma expressão transiente de transgene pode ser necessária

Valorisation of the Cider and Brewing Industry By-products as Nutraceutical Ingredients

By-products from the cider and brewing industries, including apple pomace (AP) and brewer’s spent grain (BSG) respectively, constitute major environmental problems due to the large quantities produced every year. They are sources of valuable compounds such as protein, fibre, essential fatty acids, phenolic compounds and minerals, some of them with antioxidant and prebiotic properties. Their high nutritional value leads to their potential use as human food products and several applications have been considered recently. The aims of this work include i) the nutritional and compositional characterisation of AP, BSG and final extruded and baked prototypes containing these by-products and ii) the extraction of the bioactive compounds present using environmentally green methods for potential food applications. The nutritional and compositional characterisation showed that AP contained mainly carbohydrates (51 %) and fibre (42 %) while BSG was composed mainly of fibre (61 %) and protein (21 %) and both were a potential source of antioxidants. The content of fibre and antioxidant properties of baked scones and extruded snacks increased with incorporation of up to 20 % of AP with no loss of nutritional value. The same findings were observed for breadsticks and extruded snacks incorporated with up to 20 % of BSG with an increase also in protein content. AP phenolic extracts with high antioxidant activities were produced by extraction with water and food compatible aqueous organic solvents (40 % methanol and 40 % acetone). Arabinoxylans (AX) -rich extracts from BSG with high prebiotic potential were produced by ultrasound-assisted extraction (UAE), with a significant reduction of time and less energy consumption than the conventional method used. AP and BSG are possible ingredients in enhancing some baked and extruded snacks properties and possible sources for isolating antioxidants and prebiotics

Navigating turbulence: a qualitative phenomenological study exploring successful educational leadership in Central and Eastern Europe’s private and independent schools

In an increasingly volatile world, it is paramount to successfully navigate turbulence. The COVID-19 pandemic (March 2020) emphasized the need to enhance educators’ responsiveness. Exploring and understanding the experiences of the school leaders who established new schools, in Central and Eastern European countries, after the Fall of the Berlin Wall (November 1989), and continued leading them to this day, will increase knowledge about effective responses to turbulence. The purpose of this study will be to investigate the lived experiences of the visionary school leaders who created new private and independent schools in the post-Soviet period, and to reveal common threads. Through the investigation of school leaders’ experiences a more cohesive understanding of educational leadership will emerge. Our research will use a descriptive phenomenological strategy of inquiry, guided by the central question: How do successful educational leaders navigate extreme turbulence? The study will be delimited to school leaders that established their schools from 1990s and continued to lead their schools though the COVID-19 pandemic to the present. Participants will be individuals who have, by virtue of their experience, the potential and ability to inform their understanding of school leadership in turbulence, in a number that falls within the recommended range (5-to-25) for a phenomenological study. The researcher will conduct individual semi-structured and open-ended interviews with participants, lasting approximately one hour, via ZOOM. By analyzing, describing, and presenting the shared experiences and knowledge of those who created and maintained schools in Central and Eastern Europe from the 1990s to this day, this study will provide original valuable insight for educators facing extreme turbulence. Our study’s significance lies in the opportunity to revisit past experiences, and to contemplate successful and unsuccessful attempts to navigate turbulence. Assembling perspectives and experiences through reflection can help to deepen and expand our understanding of educational leadership

Caracterização da dinâmica mitocondrial na deficiência múltipla das acil-CoA desidrogenases

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica ClínicaAs doenças da β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos fazem parte do painel de doenças detetadas no rastreio neonatal na grande maioria dos países desenvolvidos, incluindo Portugal. A deficiência múltipla das acil-CoA desidrogenases é uma das doenças rastreadas, sendo rara e apresentando um padrão de transmissão autossómico recessivo. Esta disfunção no metabolismo dos ácidos gordos é caracterizada por fenótipos bastante distintos, sendo reconhecidas duas formas clínicas: moderada e grave. Estudos anteriores do nosso grupo de investigação revelaram que o proteoma mitocondrial de pacientes homozigotos para a mesma mutação evidencia níveis de expressão diferentes das mesmas proteínas e que os pacientes com formas moderadas da doença apresentam semelhanças e diferenças quando comparados com pacientes com formas graves. O objetivo deste estudo foi relacionar as alterações dos processos biológicos associados à homeostasia mitocondrial com a severidade da doença, associada a mutações no gene que codifica a proteína electron transfer flavoprotein dehydrogenase (ETFDH), traçando semelhanças e diferenças. No geral, o nosso estudo fornece uma perspetiva global da dinâmica mitocondrial nas duas formas da doença. Ambas as formas, moderada e grave, apresentaram biogénese mitocondrial diminuída e adaptação metabólica, suportadas por níveis baixos de peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1 alpha (PGC-1α) e de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), respetivamente, em todos os pacientes com a doença. Os níveis de expressão de sirtuina 3 (SIRT3) e a atividade de ATP sintase foram encontrados diminuídos em quase todos os pacientes, sugerindo uma disfunção mitocondrial. Os níveis reduzidos de SIRT3 foram corroborados pela diminuição dos níveis de PGC-1α. Os níveis de expressão das outras proteínas analisadas foram diversos entre os pacientes e, portanto, sugerem que a correlação entre a severidade da doença e as adaptações mitocondriais não é transversal a todas as formas da doença. De facto, os diferentes resultados obtidos podem explicar, pelo menos em parte, a variedade de fenótipos observados em pacientes com a doença. Neste sentido, são necessários mais estudos para compreender melhor a patogénese da doença. No futuro, seria interessante analisar os efeitos da deficiência de ETFDH noutras células em vez de fibroblastos e pesquisar outros metabolitos energéticos relacionados com estes mecanismos.Mitochondrial fatty acid β-oxidation disorders are some of the many diseases detected by newborn screening in most developed countries, including Portugal. Among screened disorders, multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MADD) is a rare autosomal recessively inherited disorder that presents very distinct phenotypes, being recognized in two clinical forms: mild and severe. Previous studies from our research group showed that the mitochondrial proteome of homozygous patients having the same mutation presents different expression levels of the same proteins and that patients with mild forms of MADD share some proteins with severe forms and at the same time present distinctive expression patterns. The aim of this study was to relate the regulation of biological processes associated to mitochondrial homeostasis with the severity of MADD, due to mutations on the gene that codifies the protein electron transfer flavoprotein dehydrogenase (ETFDH), evidencing similarities and differences. In overall our study provides a global perspective of the mitochondrial dynamics in the two forms of MADD, mild and severe. Both forms presented down-regulation of mitochondrial biogenesis and metabolic adaptation highlighted by lower levels of peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1 alpha (PGC-1α) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), respectively, in all MADD patients. Expression levels of sirtuin 3 (SIRT3) and the activity of ATP synthase were found decreased in almost all patients, suggesting mitochondrial dysfunction. Down-regulation of SIRT3 was corroborated by decreased levels of PGC-1α. The expression levels of the other proteins analyzed were diverse among MADD patients and thus highlighting no straight full correlation between disease severity and mitochondrial adaptations. In fact, the different results obtained may explain, at least in part, the variety of phenotypes observed in MADD patients. So, more studies are needed to better understand MADD pathogenesis. In the future, it would be interesting to analyze the effects of ETFDH deficiency in other cell types rather than fibroblasts and search for other energetic metabolites related with these mechanisms

Schumpeter’s (1934) influence on entrepreneurship (and management) research

Entrepreneurship research has flourished since de 1980s, following the institutional development that created schools and courses, research centers and dedicated journals. This paper examines the impact of Joseph Schumpeter, one of the main “knowledge producers” whose concepts and ideas on the entrepreneur, entrepreneurship and innovation have shaped the discipline and much of the research on entrepreneurship, and has influenced the thought on other areas of management. Methodologically, we conducted a bibliometric study of the articles published in 16 high stature international journals, over a period of 30 years, between 1981 and 2010. On a sample of 412 articles citing Schumpeter, we analyzed and mapped citations, co-citations and research themes. We further establish distinctions between entrepreneurship and management research. This study presents a manner to examine the influence of a scholar, and a set of conceptualizations he has introduced, on a discipline. Schumpeter has had an imprint in the multidisciplinary and wealth of research themes that entrepreneurship scholars have delved upon but also in other management disciplines, where his perspectives on entrepreneurship, the entrepreneur and innovation have contributed to much of the research conducted to date. Although entrepreneurship has remained largely multidisciplinary and drawing from the main management theories there is a growing body of entrepreneurship-specific literature.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Top executive gender and credit risk an analysis for North American firms

Top executive gender and credit risk: An analysis for North American firms This study examines the relationship between the CEO and CFO gender in large, public North American firms and credit risk, through the analysis of filings and delisting for bankruptcy, from 2007 to 2016. Using panel logit regressions for two models with similar specifications to those used by Campbell et al. (2008), I find with some statistical significance that, everything else constant, firms with females in these top positions are only less than 0.02 percentage points more likely to file or be delisted for bankruptcy, thus concluding that gender has relatively no effect on firm creditworthiness

Expanding the magic circle in pervasive casual play

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em InformáticaIn this document we present proposals for merging the fictional game world with the real world taking into account the profile of casual players. To merge games with reality we resorted to the creation of games that explore di-verse real world elements. We focused on sound, video, physiological data, ac-celerometer data, weather and location. We made the choice for these real world elements because data, about those elements, can be acquired making use of functionality already available, or foreseen in the near future, in devices like computers or mobile phones, thus fitting the profile of casual players who are usually not willing to invest in expensive or specialized hardware just for the sake of playing a game. By resorting to real world elements, the screen is no longer the only focus of the player’s attention because reality also influences the outcome of the game. Here, we describe how the insertion of real world elements affected the role of the screen as the primary focus of the player’s attention. Games happen inside a magic circle that spatially and temporally delimits the game from the ordinary world. J. Huizinga, the inventor of the magic circle concept, also leaves implicit a social demarcation, separating who is playing the game from who is not playing the game [1]. In this document, we show how the insertion of real world elements blurred the spatial, temporal and social limits, in our games. Through this fusion with the ordinary world, the fictional game world integrates with reality, instead of being isolated from it. We also present an analysis about integration with the real world and context data in casual en-tertainment.Fundação para a Ciência e a Tecnologia - grant SFRH/BD/61085/200

To what extent does the implementation of a category management program influence retail pharmacies' current model?

As a result of structural changes that affected the retail pharmacy market and completely altered its competitive landscape, pharmacies are now actively seeking to strategically counterpoint these events. ANF, as the national association for pharmacies in Portugal, is an organization that, among other services, provides managerial support to associated pharmacies. By associating themselves with ANF, these pharmacies become part of the Farmácias Portuguesas brand. This study focuses on ANF’s latest project, the creation of a Category Management Program, which is expected to become available to all pharmacies associated to ANF (thus part of the Farmácias Portuguesas’ Channel). By studying the program’s reach and impact on these independent business units, conclusions are reached regarding its results in the current business model followed, and how this may translate into counterpointing competitors’ actions

Marketing plan for the Lisbon Zoo

Lisbon Zoo, “Jardim Zoológico e de Aclimação em Portugal, S.A”, is a Portuguese zoological garden, located at the heart of the Lisbon City. The Lisbon Zoo is a private non-profit institution of public and educative utility. The park first opened the doors to the public in 1884 and it has now one of the finest collections of animals of the world. The main key success factors of the zoo rely on its biodiversity, history, offer in terms of product and service and location. The specialized staff with their profound dedication to the cause of preservation of species and education, make the park a reference of quality and innovation in the sector. The Lisbon Zoo is facing an extremely competitive market, characterized by the economic crisis and reduction of consumer’s buying power. The zoological market has suffered many changes in the last years in terms on enclosures, educational messages, interaction with animals and technology. The consumer’s habits and demands have also changed. In this sense, this project thesis proposes a marketing plan for the Lisbon Zoo with an external, internal and competitive analysis and implementation proposal. This implementation proposal consists on the development of the marketing strategy (strategic options: segmentation, targeting and positioning) and operational plan. The operational plan is the set of recommendations in terms of the marketing-mix: product, price, place and promotion. For the promotion it is proposed a communication plan for the year 2014.O Zoo de Lisboa, "Jardim Zoológico e de Aclimação em Portugal, SA", é um jardim zoológico português, localizado no coração da cidade de Lisboa. O Jardim Zoológico de Lisboa é uma instituição privada sem fins lucrativos de utilidade pública e educativa. O parque abriu pela primeira vez as portas ao público em 1884 e tem hoje uma das melhores colecções de animais do mundo. Os principais factores de sucesso do zoológico estão relacionados com sua biodiversidade, história, oferta em termos de produto e serviço e localização. O staff especializado, com a sua profunda dedicação à causa da preservação das espécies e educação, tornam o Zoo numa referência de qualidade e inovação no sector. O Jardim Zoológico de Lisboa está a enfrentar um mercado extremamente competitivo, caracterizado pela crise económica e a redução do poder de compra do consumidor. O mercado zoológico tem sofrido muitas mudanças nos últimos anos em termos de instalações dos animais, mensagens educativas, interacção com animais e tecnologia. Os hábitos e exigências dos consumidores também se modificaram. Neste sentido, esta tese propõe um plano de marketing para o Jardim Zoológico de Lisboa, com uma análise externa, interna e competitiva e uma proposta de implementação. Esta proposta de implementação consiste no desenvolvimento da estratégia de marketing (opções estratégicas: segmentação, target e posicionamento) e o plano operacional. O plano operacional é o conjunto de recomendações em termos de marketing-mix: produto, preço, distribuição e comunicação. Para a comunicação é proposto um plano de comunicação para o ano de 2014