Retrospective study of the association between neutering status and changes secondary to degenerative mitral valve disease

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaMyxomatous mitral valve disease is the most common cardiovascular disease reported in dogs. Although many patients may remain asymptomatic, some of them progress to left-sided congestive heart failure and develop clinical signs. Little has yet been published regarding the possible influence of the neutering status on changes secondary to myxomatous mitral valve disease. This study aims to assess a possible correlation between neutering status and myxomatous mitral valve disease. A retrospective study was conducted and included all the cases diagnosed with myxomatous mitral valve disease, consulted at the Cardiology service of the University of Liverpool. To help assess the association between neutering status and cardiac remodelling, dogs were categorized into four groups: FE (female entire), FN (female neutered), ME (male entire) and MN (male neutered). Retrospective review of echocardiographic data, signalment, and underlying diseases were performed. Echocardiographic measurements were made through offline analysis. Echocardiographic measurements were then compared between groups. Five hundred and eighty-two dogs (n = 582) were included: female entire (n = 24), female neutered (n = 235), male entire (n = 115) and male neutered (n = 208). Left ventricular internal diameter at end diastole (LVIDd), left atrial dimension to the aortic root diameter (LA:Ao) and left atrium maximal dimension to the aortic root dimension (LAmax:Ao) were significantly different between ME and MN, with ME dogs presenting higher mean values for LVIDd and higher median LA:Ao and LAmax:Ao measurements. Left ventricular internal diameter at end systole (LVIDs) was not significantly different between ME and MN. There were no significant differences between FE and FN groups. This study shows that neutering status may influence the development of myxomatous mitral valve disease in male dogs and that entire male dogs could be at higher risk of developing cardiac remodelling secondary to myxomatous mitral valve disease. On the other hand, neutering status doesn’t seem to have an influence on disease progression in female dogs.RESUMO - Estudo retrospetivo da associação entre a esterilização e alterações secundárias à doença mixomatosa da válvula mitral - A doença mixomatosa da válvula mitral é a doença cardiovascular mais prevalente em cães. Apesar da maior parte dos pacientes permanecerem assintomáticos, alguns podem progredir para insuficiência cardíaca esquerda e desenvolver sinais clínicos. Até hoje, existem poucas publicações sobre o possível efeito que a esterilização possa ter no desenvolvimento da doença mixomatosa da válvula mitral. O objetivo deste estudo é avaliar se existe de facto uma relação entre a esterilização e a doença mixomatosa da válvula mitral. Foi realizado um estudo retrospetivo que incluiu todos os casos diagnosticados com doença mixomatosa da válvula mitral consultados no serviço de Cardiologia da Universidade de Liverpool. Para avaliar a relação entre a esterilização e a presença de remodelação cardíaca, os cães foram categorizados em quatro grupos: FE (fêmeas inteiras), FN (fêmeas esterilizadas), ME (machos inteiros) e MN (machos castrados). A história pregressa e os dados ecocardiográficos dos animais foram revistos retrospetivamente e as medidas ecocardiográficas foram obtidas por medição offline. Estas medições foram depois comparadas entre os diferentes grupos. Quinhentos e oitenta e dois cães (n = 582) foram incluídos: fêmeas inteiras (n = 24), fêmeas esterilizadas (n = 235), machos inteiros (n = 115) e machos castrados (n = 208). Nos resultados obtidos, o diâmetro interno do ventrículo esquerdo no final da diástole (LVIDd), o rácio átrio esquerdo-aorta (LA:Ao) e o rácio diâmetro máximo do átrio esquerdo-aorta (LAmax:Ao) foram estatisticamente significativos entre machos inteiros e machos castrados. Os machos inteiros apresentaram não só um LVIDd médio superior, como também uma mediana de LA:Ao e LAmax:Ao superior aos machos castrados. Ao mesmo tempo, o diâmetro interno do ventrículo esquerdo no final da sístole (LVIDs) não mostrou ser estatisticamente significativo entre machos inteiros e machos castrados e nenhum dos parâmetros ecocardiográficos anteriormente referidos revelou ser estatisticamente significativo entre fêmeas inteiras e fêmeas esterilizadas. Este estudo demonstra que a esterilização poderá influenciar o desenvolvimento da doença mixomatosa da válvula mitral e que os cães machos inteiros poderão apresentar um maior risco de desenvolver remodelação cardíaca secundária a esta doença. No entanto, a esterilização não aparenta influenciar a progressão desta doença em cadelas.N/

Hidrogeis multiestruturais obtidos através de estratégias biomiméticas para aplicações biomédicas

The extracellular matrix (ECM) of load-bearing soft tissues is characterized by a welldefined and complex architecture which is responsible for its high mechanical performance. Inspired by the native ECM of living tissues, we demonstrate the possibility to fabricate tough and cytocompatible hydrogels from a single polymeric precursor formulation and under physiological conditions. The designed systems were synthesized through an adapted Double-network (DN)-based methodology combining chemical and physical crosslinking mechanisms. Such multifunctional devices were able to withstand an impressive compressive stress in the same order of magnitude as the ones found in native load-bearing soft tissues, highlighting their potential for the repair of these tissues. Further improvements on the former DN-based hydrogel were made in order to achieve highly hydrated biomaterials with other advantageous properties for biomedical purposes, including self-healing and injectability. Inspired by the lotus-leaf liquid-repellence, our group proposed a simple, straightforward and cost-effective tool to produce spherical polymeric particles above artificial superantiwetting surfaces. In this thesis, this biomimetic strategy was used to fabricate a large variety of natural-based hydrogel spherical systems with distinct macroscopic structures. First, reversible superamphiphobic (SA) surfaces were fabricated by covering a substrate with specifically designed microcapsules entrapping magnetic particles. The main advantage of using magnetic responsive particles is the ability to control their arrangement and fixation over the substrate by applying an external magnetic field. The produced non-permanent SA surfaces were successfully employed to fabricate water/oil repellent surfaces, liquid marbles and microfluidic channels and, also used as templates for the fabrication of spherical particles. Second, SA surfaces were successfully employed as supports to produce spherical polymeric microparticles with potential as cell and drug carriers. The proposed strategy consists in spraying a hydrogel precursor solution over a SA surface followed by a crosslinking mechanism. Next, hierarchical systems were also created via the assembly of polymeric spherical particles induced by these artificial SA substrates under physiological conditions. Finally, SA surfaces were successfully employed to fabricate ready-to-use and stable liquefied capsules enclosing different objects, such as cells and drugs. All these bioinspired strategies are poised to usher the development of the next generation of engineered hydrogel devices for biomedicine and tissue engineering.A matriz extracelular dos tecidos moles é caraterizada por uma estrutura definida e complexa, sendo responsável pelas suas extraordinárias propriedades mecânicas. Usando a matriz extracelular como inspiração, foi demonstrada a possibilidade de produzir hidrogéis robustos e citocompatíveis sob condições fisiológicas. Os materiais obtidos foram sintetizados através de uma adaptação da metodologia Double-network (DN), combinando mecanismos de reticulação físicos e químicos. Estes sistemas multifuncionais são capazes de suportar tensões mecânicas na mesma ordem de grandeza das encontradas nos tecidos estruturais do corpo, o que reforça o potencial destes biomateriais hidratados para reparar estes mesmos tecidos. Estes géis DN foram melhorados de modo a obter materiais com outras características importantes para aplicações biomédicas, nomeadamente a capacidade de se autorrepararem e serem administrados através de estratégias minimamente invasivas, como por injeção. Adicionalmente, o nosso grupo desenvolveu uma nova metodologia, inspirada pela capacidade de a folha de lótus repelir líquidos, para produzir partículas poliméricas com uma forma esférica. Esta técnica consiste em dispensar uma solução polimérica sobre uma superfície com extrema repelência a líquidos e, de seguida, um processo de reticulação é aplicado à gota polimérica de modo a reter a sua forma esférica. Nesta tese, esta estratégia biomimética foi usada para fabricar diversos sistemas esféricos com variadas estruturas macroscópicas. Primeiro, superfícies reversíveis e superanfifóbicas (SA) foram criadas através da deposição de microcápsulas contendo partículas magnéticas no seu interior sobre um suporte sólido. A principal vantagem de usar partículas sensíveis a campos magnéticos é a possibilidade de controlar a sua posição e fixação a um suporte usando um íman. Estas superfícies SA foram usadas como suportes para produzir partículas esféricas e canais de microfluídica. De seguida, partículas poliméricas com tamanhos na escala micrométrica foram obtidos, pela primeira vez, usando superfícies SA. A estratégia desenvolvida consiste em dispensar, sob uma superfície SA, uma solução polimérica usando um pulverizador e, de seguida, um mecanismo de reticulação é aplicado de modo a obter hidrogéis esféricos. Adicionalmente, foram também criadas partículas multicompartimentalizadas com uma estrutura hierárquica incorporando as micropartículas produzidas anteriormente. Finalmente, as superfícies SA foram também usadas para obter cápsulas esféricas compostas por uma camada externa polimérica e um núcleo no estado líquido. Diferentes objetos como células e moléculas bioativas podem ser encapsulados no interior das partículas anteriores, reforçando o seu potencial biomédico. É antecipado que todas estas estratégias biomiméticas sejam importantes para o desenvolvimento da nova geração de hidrogéis com potencial em biomedicina e engenharia de tecidos.Programa Doutoral em Químic

The use of mycorrhizal fungi as a strategy to increase resistance against grapevine diseases: study of the effect of mycorrhizal symbiosis on Plasmopara viticola ability to express pathogenic effectors

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020Grapevine is one of the most important fruit crops worldwide. In 2019, over 7.4 million hectares of the world cultivated area were dedicated to viticulture, resulting in the production of 77.8 million tonnes of grapes (International Organisation of Vine and Wine, 2020 report). However, the cultivated species Vitis vinifera L., widely used for berry and wine production, is highly susceptible to the pathogenic oomycete Plasmopara viticola (Berk. & M.A. Curtis) Berl. & De Toni, the causal agent of the grapevine downy mildew disease. This disease is one of the most devastating causing up to 75% of grape loss in one season and important economic losses. Nowadays, the method used to control P. viticola relies on multiple applications of chemical fungicides which have a negative impact on the environment as they accumulate in the soil and water. In Europe alone, 68 thousand tonnes of fungicides were used in 2003, but recently the European Union has established a goal to lower the usage of such chemicals in viticulture. Therefore, there is a need to develop new and more sustainable strategies to control downy mildew disease. The use of beneficial microorganisms with biocontrol capabilities, such as the arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), has been pointed out as a viable alternative. With this study we intended to investigate the effect of AMF colonization on the expression of P. viticola effectors during infection of grapevine. Grapevine plants (V. vinifera cv Cabernet Sauvignon) were inoculated with the mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis and root AMF colonization rate and plant growth were assessed. The percentage of root colonization was 10% and mycorrhizal grapevine plants showed a significantly higher shoot biomass compared to non-mycorrhizal plants. Four months post-mycorrhizal inoculation, plants were infected with the pathogen P. viticola. Pathogenicity effectors genes belonging to the RxLR group were analysed and their expression was investigated during the first hours of infection using quantitative real time PCR analysis. Results showed that mycorrhizal inoculation altered the expression of several P. viticola effectors, namely PvRxLR28 and PvRxLR67 that presented an expression decrease in mycorrhizal plants at the two time points post-infection tested, and PvRxLR18 and PvAVH52 that presented an expression increase. These results suggest that the pre-inoculation of grapevine with AMF may interfere with pathogen capabilities to infect the plant by pathogenicity effectors expression modulation. These results further support the hypothesis that AMF can be used to promote more sustainable agriculture, particularly viticulture, practices

Sono percebido, esforço para dormir e pensamentos pré-sono em idosos

Mestrado em Psicologia - Psicologia Clínica e da SaúdeO presente estudo teve como objectivos examinar, em idosos, o comportamento psicométrico das escalas BaSIQS (Escala Básica de Insónia e Qualidade do sono, de Gomes, 2005), GSES (Glasgow Sleep Effort Scale, de Broomfield e Espie, 2004) e GCTI (Glasgow Content of Thougths Inventory, de Harvey e Espie, 2004), nas versões portuguesas de (Marques et al. 2013a e Marques 2013b). Pretendeu também explorar aspetos de insónia, qualidade de sono, esforço para adormecer e pensamentos antes de domir, quer examinando as suas associações com o declínio cognitivo e a sintomatologia depressiva, quer comparando idosos institucionalizados e não institucionalizados. A BaSIQS avalia queixas de insónia e qualidade de sono; a GSES avalia o esforço que os indivíduos fazem para dormir, enquanto que a GCTI avalia os pensamentos intrusivos antes de adormecer. A análise foi realizada numa amostra de 60 adultos idosos portugueses, 30 institucionalizados e 30 não institucionalizados, com idades compreendidas entre os 66 e os 89 anos (M= 77.78; DP= 1.98), sendo 65% do sexo masculino e 35% do sexo feminino. Os resultados revelaram, quanto à consistência interna da BaSIQS, a GSES e a GCTI, valores de coeficientes alfa de Cronbach de α=0,734, α =0,759 e α=0,763, respetivamente. Constatou-se ainda que a BaSIQS, a GSES e a GCTI se associaram significativamente entre si. Após a comparação entre o grupo de idosos institucionalizados e não institucionalizados, observou-se a ausência de diferenças significativas entre ambos os grupos nas variáveis de sono estudadas. No presente estudo avaliou-se ainda o comprometimento cognitivo através do MoCA (Montreal Cognitive Assessment, Nasreddine et al., 2005), versão portuguesa de (Freitas et al., 2011), e a sintomatologia depressiva através da GDS (Geriatric Depression Scale, Yesavage et al., 1983), verão portuguesa de (Barreto et al., 2003). Constatou-se que existe um maior declínio cognitivo nos idosos institucionalizados, comparativamente aos não institucionalizados. Relativamente à sintomatologia depressiva não se verificaram diferenças. Por fim, observou-se que a sintomatologia depressiva (mas não o declínio cognitivo) se associou significativamente às variáveis de sono. Em conclusão, os resultados sugerem que as escalas de sono BaSIQS, GSES e GCTI possuem qualidades psicométricas adequadas na nossa amostra de idosos. Constatou-se que pior sono percebido nas três escalas se associou a sintomatologia depressiva, o mesmo não sucedendo quanto ao declínio cognitivo. Por fim, o sono de idosos institucionalizados e não institucionalizados apresentou-se semelhante nos aspetos estudados. No entanto, dada a reduzida dimensão da amostra, mais estudos serão necessários.The aims of the present work were to analyze the psychometric behaviour of three sleep scales in elderly people: the BaSIQS (Basic Insomnia and Sleep Quality Scale, Gomes, 2005); the GSES (Glasgow Sleep Effort Scale, Broomfield and Espie, 2005) and the GCTI (Glasgow Content of Thoughts Inventory, Harvey and Espie, 2004), Portuguese versions (Marques et al., 2013a and Marques, 2013b). Then, to explore insomnia complaints, perceived sleep quality, sleep effort and thoughts before falling asleep, in elderly people, by considering cognitive decline and depressive symptoms, and by comparing institutionalized and non-institutionalized elderly. The BaSIQS addresses complaints of insomnia and poor sleep quality. The GSES evaluates the efforts that people make in order to try to fall asleep. The GCTI evaluates recurrent intrusive thoughts that may arise before people fall asleep. Participants consisted of 60 elderly people, 30 institutionalized and 30 non-institutionalized, with ages between 66 and 89 years old (M=77.78; SD=1.98), 65% women and 35% men. As to internal consistency, Chronbach alpha coefficients were α= 0.734, α=0.759 and α= 0.763, respectively for the BaSIQS, GSES and GCTI. The three scales correlated significantly to each other. Comparing the non-institutionalized and institutionalized groups on those sleep measures, there were no significant diferences between them. As to cognitive decline measured by MoCA (Montreal Cognitive Assessment, Nasreddine et al., 2005, Portuguese version by Freitas et al., 2011), and depressive symptoms assessed by GDS (Geriatric Depression Scale, Yesavage et al., 1983), Portuguese version by (Barreto et al., 2003), the institutionalized elders had more cognitive decline comparing to non-institutionalized, but as regards to depressive symptoms no differences were found between groups. Depressive symptoms were associated to higher sleep difficulties in all three scales, but none of the sleep measures correlated with cognitive decline. In conclusion, the results suggest that the BaSIQS, GSES and GCTI have acceptable psychometric properties in our sample of older adults. Depressive symptoms, but not cognitive decline, were associated with poorer sleep. Similarities in sleep measures were found between institutionalized and non-institutionalized elderly. However, given the small sample size, further studies are needed in this population

Ecohydraulics of pool-type fishways for the Iberian Barbal (Luciobarbus Bocagei Steindachner, 1864)

Doutoramento em Engenharia Florestal - Instituto Superior de AgronomiaThis study analyses the impact of different hydraulic conditions on the Iberian barbel’s upstream movements in a pool-type fishway. Developed in an experiment pool-type fishway prototype and including fish of different sizes, this study investigates: i) the efficiency of passage through submerged orifices or notches; ii) the effect of velocity, turbulence and Reynolds shear stress on this species’ behaviour; iii) the suitability of straight and offset orifices to fish’s passage and, finally, iv) the efficiency of offset and straight orifices with a deflector bar for this specimens’ movements. The fishways was found to be efficient to the upstream passage of this species. Submerged orifices were preferentially used by specimens, mainly by small fish which, although their higher rheotatic capacity, showed strong difficulties to pass through the fishway. The behaviour of the latter was also the most affected by turbulence and Reynolds shear stress, which seemed to be the variables affecting fish’ movements the most. Straight orifices were found not be adequate to fish passage, even when added of a deflector bar. The results are discussed in terms of future research delineation

Resveratrol production strategies: their influence on cell physiology and plasmid stability

Resveratrol (3, 5, 4’–trans-hydroxystilbene) has been used since immemorial times in traditional medicine as an antimicrobial and antioxidant compound. Recent discoveries demonstrated other health benefits for this phytoalexin, such as anticancer and anti-ageing activities, making it desirable for the pharmaceutical, nutraceutical and cosmetic industries. This polyphenolic is a plant secondary metabolite mainly produced by peanuts and grapevines. Although plant cells were traditionally used as a biological alternative for resveratrol production, in recent years, recombinant microorganisms, such as yeast and bacteria, were proposed to improve resveratrol production. The present work describes resveratrol production in two recombinant microorganisms – Escherichia coli (E. coli) and Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) – its optimization of production in bioreactor using Design of Experiments (DoE) and the impact on cell physiology and plasmid stability, which was assessed by flow cytometry and real-time qPCR, respectively. For resveratrol quantification, a liquid-liquid extraction from culture media was performed using ethyl acetate and then a method for quantification in High Performance Liquid Chromatography – Diode Array Detector (HPLC-DAD) was validated. In order to assess which recombinant microorganism yielded higher resveratrol production, the influence of medium composition, pH, temperature, agitation, precursor concentration and optical density (OD600) at the addition of precursor were evaluated for resveratrol production in shake flask using E. coli and S. cerevisiae. The data obtained were used to create a DoE approach in order to optimize resveratrol production in bioreactor. The bioprocess was monitored using the HPLC-DAD method for resveratrol quantification, flow cytometry to assess cellular viability and real-time qPCR to evaluate plasmid segregational instability. Shake flasks screening assays revealed a 30 times higher resveratrol yield by E. coli (about 100 μg/mL) when compared to S. cerevisiae (3.17 μg/mL), which led to the choice of the first microorganism for the scale-up optimization studies. Only the factors that had the highest impact on resveratrol production were considered for the DoE approach: temperature, pH, precursor concentration and optical density (OD600) at the addition of precursor. A Central Composite Design, rotatable and full fractioned was used, which allowed the obtention of 159.96 μg/mL of resveratrol. The population of depolarized cells varied according to the conditions used, which sometimes resulted in a 10 % difference between higher and lower production assays. Plasmid segregational instability had also been observed and variations in the values of plasmid copy number (PCN) were noticed between 22 and 30 hours of fermentation, with the highest PCN values obtained at 30 hours, when also the highest amounts of resveratrol were obtained. It is possible to conclude that cellular viability and plasmid segregational instability affect significantly resveratrol production. In sum, this work outlines the optimization of resveratrol production in bioreactors using flow cytometry and real-time qPCR for bioprocess monitoring. It was demonstrated that using the appropriate tools to optimize and monitor resveratrol production process, solutions can be found for mass production of this compound, providing an effective alternative to chemical synthesis and avoiding the depletion of natural sources.A saúde e a alimentação são assuntos que suscitam grande interesse para a população em geral. O anti-envelhecimento e a proteção contra doenças são o objeto de inúmeras investigações, muitas delas envolvendo compostos naturais produzidos por plantas. As plantas são os mais antigos medicamentos do Homem e, atualmente, alguns dos compostos por elas produzidos são usados em várias indústrias, como a cosmética e a farmacêutica. Um dos compostos que tem suscitado bastante interesse devido às suas propriedades benéficas para a saúde é o resveratrol. O resveratrol (3, 5, 4’–trans-hidroxistilbeno) é um polifenol e uma fitoalexina (metabolito secundário de plantas) pertencente à família dos estilbenos. Este composto pode ser encontrado em forma livre ou glicosilada – e ambas existem nas formas isoméricas cis e trans. cis-Resveratrol tem um máximo de absorção aos 286 nm, enquanto no isómero trans o máximo é atingido aos 306 nm. Esta fitoalexina não-flavonóide é produzida em plantas como resposta ao stress biótico (infeções por fungos ou bactérias) e abiótico, como radiação UV, calor ou lesão. Está presente em várias famílias de plantas e em pelo menos 72 espécies, mas encontra-se sobretudo nas uvas e amendoins. É encontrado frequentemente nos vinhos tintos, que pela ação antioxidante do resveratrol, são muitas vezes reconhecidos como cardioprotectores. O resveratrol reduz a morte celular e a sua atividade anti-inflamatória leva ao decréscimo das espécies reativas de oxigénio, sendo por isso eficaz no combate ao stress oxidativo, protegendo os componentes celulares. Este composto polifenólico demonstra ainda benefícios noutras áreas, agindo como agente antimicrobiano. O resveratrol possui também propriedades anticarcinogénicas; porém, a sua ação mais conhecida é provavelmente a ação anti-envelhecimento. Ainda há poucos dados sobre o metabolismo de resveratrol nos humanos, mas os últimos estudos em animais indicam que o resveratrol é facilmente absorvido após toma oral sobretudo no intestino delgado. No entanto, ainda é necessário mais informação sobre as doses e correlações com os efeitos. Numa tentativa de criar formas alternativas à síntese química de resveratrol, alguns bioprocessos têm sido desenvolvidos para a sua produção em células de plantas e microrganismos recombinantes. Atualmente, o resveratrol pode ser produzido através de culturas de células vegetais, que têm a vantagem de serem totipotentes. Um dos sistemas de produção é a cultura de células suspensas, um sistema com boa reprodutibilidade e que não necessita de modificações genéticas. O máximo produzido por esta técnica foi 280 mg/L; porém, adicionando elicitores à cultura, pode atingir-se 5027 mg/L. Outra alternativa é a cultura de raízes e também a cultura de calos, ambas de rápido crescimento e bioquimicamente estáveis, mas com rendimentos relativamente baixos (1.5 mg/g DW e 33 mg/g, respetivamente). Desta forma, tendo como objectivo a produção de maiores quantidades, recorre-se aos microrganismos recombinantes, sendo os mais estudados a bactéria Escherichia coli (E. coli) e a levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Tendo fácil manipulação e sendo largamente estudada, a bactéria E. coli foi o microrganismo que até à data produziu a maior quantidade de resveratrol de forma recombinante (1380 mg/L), enquanto a S. cerevisiae, que cresce rapidamente e é um organismo eucariota, produz menores quantidades de resveratrol: o seu máximo foi 391 mg/L. Desta forma, a E. coli é preferida como sistema recombinante para a produção de resveratrol. Embora o máximo produzido tenha sido atingido em culturas de células suspensas, os organismos recombinantes são geralmente preferidos devido à fácil manipulação e baixos custos associados. Os microrganismos recombinantes E. coli e S. cerevisiae são cultivados, numa fase inicial, em balão, sendo importante a definição das condições de cultura como a temperatura, pH e agitação, assim como a composição dos meio de cultura, que deve ir de encontro aos requisitos nutricionais dos microrganismos em questão. No entanto, para obter um maior rendimento e controlo, este processo pode ser efetuado em bioreator. Por vezes, numa tentativa de otimizar as condições de cultura, testam-se vários fatores, um a um, até definir quais os pontos que mais favorecem a produção. Esta abordagem pode posteriormente ser aproveitada para fazer um desenho experimental (como o Central Composite Rotatable Design), no qual se conjugam vários fatores para determinar quais são os mais relevantes e influentes na produção do composto de interesse. A resposta do modelo gerado é submetida a uma análise estatística, obtendo-se uma resposta de superfície, que quantifica a relação entre os fatores a testar e as respostas obtidas. Muitas vezes são usados métodos de monitorização paralelamente aos ensaios de produção. Neste caso, para avaliar a viabilidade celular e a instabilidade segregacional dos plasmídeos é usada a citometria de fluxo e real-time qPCR, respetivamente. Estes dois parâmetros são muito importantes no processo, uma vez que baixo crescimento celular ou células metabolicamente pouco ativas, assim como uma partição incorreta de plasmídeos para as células filhas podem levar a uma grande diminuição na produtividade final. A citometria de fluxo fornece em tempo real informação sobre a viabilidade celular, atividade enzimática ou conteúdo em ácidos nucleicos. É muitas vezes necessário recorrer a fluoróforos, como o BOX bis-(1,3-ácidodibutilbarbitúrico)trimetina oxonol, que avalia o potencial de membrana (se está ou não despolarizada), ou o iodeto de propídeo (PI), que avalia a permeabilidade da membrana. Estes dois compostos foram usados neste estudo para averiguar, através de citometria de fluxo, a viabilidade celular de fermentações em bioreator. Outro ponto que é necessário avaliar é a estabilidade segregacional dos plasmídeos, que é verificada usando real-time qPCR através da monitorização do número de cópias de plasmídeo (PCN). Esta técnica permite uma rápida quantificação de qualquer sequência alvo num curto espaço de tempo. Desta forma, avaliando-se parâmetros adicionais à fermentação, pretende-se maximizar a produção de resveratrol. Devido ao elevado número de aplicações e também à elevada procura das indústrias por este composto, o objetivo geral deste estudo é produzir resveratrol em bioreatores usando microrganismos recombinantes (E. coli e S. cerevisiae), ao mesmo tempo que se monitoriza o processo para verificar a fisiologia celular (através de citometria de fluxo) e a instabilidade segregacional, medindo o número de cópias de plasmídeo através de real-time qPCR. Embora a levedura S. cerevisiae não tenha sofrido transformação, a bactéria E. coli BW27784 foi transformada com os plasmídeos pAC-4CL1 e pUC-STS. Para analisar as quantidades de composto produzidas em fermentações, são geralmente usados métodos cromatográficos (cromatografia líquida ou gasosa) após as amostras terem sido submetidas a extração. De forma a quantificar o resveratrol nas amostras de meio de cultura, o método cromatográfico foi validado segundo regras internacionais. A extração de resveratrol foi efetuada usando uma extração líquido-líquido com acetato de etilo, sendo as amostras posteriormente injetadas num aparelho de cromatografia líquida de altíssima performance (HPLC) acoplado a um detetor de diode array (DAD). Foi usada uma coluna Zorbax C-18 a 25 ºC, tendo como fase móvel água, acetonitrilo e ácido acético nas proporções 66:33:0.1, a pH 3.4 e a um caudal de 1 mL/min. A curva de calibração foi feita com 7 pontos entre a concentração de 0.1 a 10 µg/mL, tendo-se obtido uma correlação superior a 0.99 usando uma ponderação estatística de . A eficiência de extração foi de aproximadamente 100 % para os valores 0.1 e 10 µg/mL e o máximo desvio padrão obtido em todas as análises foi ± 0.41. Concluiu-se deste modo que, como os valores se encontravam dentro dos parâmetros definidos internacionalmente, o método é reprodutível, preciso e rigoroso, devido à pequena variação entre os valores analisados e obtidos. O método também é reprodutível devido ao baixo erro associado à precisão intradia (cujo valor máximo de desvio padrão foi de ± 0.22, podendo ser utilizado para a quantificação de resveratrol neste tipo de amostras. De seguida, foram efetuados ensaios de screening para avaliar qual o microrganismo recombinante que permitia a obtenção de maiores níveis de produção de resveratrol. Para estes ensaios foram usados os dois microrganismos recombinantes em estudo, tendo sido avaliados vários parâmetros que poderiam influenciar a produção de resveratrol: temperatura, composição do meio, densidade ótica (OD600) na altura da indução, concentração de indutor (ácido p-cumárico), agitação e, para a bactéria, foi também avaliada a influência do pH. No ensaio das concentrações de indutor, foram avaliadas 6 concentrações: 0, 1 ou 2, 5, 10, 15 e 20 mM. A produção máxima de resveratrol em E. coli foi atingida com 10 Mm de indutor, obtendo-se 105.65 µg/mL de resveratrol; enquanto 5 mM foi a concentração de indutor que levou a uma maior produção em S. cerevisiae; no entanto, devido ao caráter tóxico do solvente usado para preparar o indutor (DMSO), tanto a E. coli como a S. cerevisiae deixaram praticamente de crescer e produzir acima de 10 Mm. Quanto à densidade ótica na altura da indução, verificou-se que, em E. coli, a indução a densidades óticas inferiores a 0.2 tinha um impacto negativo na produção. Na levedura, este ensaio não demonstrou ter impacto na produção, embora o melhor resultado se tenha obtido a uma densidade de 1. No estudo da influência da temperatura na produção de resveratrol, foram feitos ensaios a 25 ºC, 30 ºC, 37 ºC e 42 ºC, tendo sido verificado que a temperatura que permite a obtenção de concentrações mais elevadas de resveratrol é 30 ºC para ambos os microrganismos, onde se atingiu a produção máxima (83.10 µg/mL para a E. coli e 1.23 µg/mL para a S. cerevisiae). A influência da agitação na produção de resveratrol também foi avaliada (150, 200, 250 e 300 rpm) e concluiu-se que a agitação ótima para os dois microrganismos é diferente, sendo que para a E. coli é 250 rpm e para a S. cerevisiae é 200 rpm. No entanto, a agitação é um fator sem grande impacto na produção final, pois não existe grande variação nos valores da produção tendo em conta a mudança na agitação. Nos ensaios com diferentes composições do meio de cultura, foi testada a influência do tipo de fontes de carbono e azoto, tendo-se verificado que ambos os microrganismos utilizaram as maiores quantidades de nutrientes em detrimento da produção de resveratrol, que apesar das elevadas densidades óticas atingidas, apenas ficou próxima aos 100 µg/mL. Como nos ensaios anteriores a S. cerevisiae produziu sempre menores concentrações de resveratrol que a E. coli, esta foi seleccionada para os ensaios subsequentes. Desta forma, os estudos sobre o pH incidiram apenas neste microrganismo, e no ensaio realizado para o estudo da influência do pH na produção de resveratrol, verificou-se que o ponto óptimo de produção foi atingido a pH 7. Após realização dos ensaios preliminares, os resultados foram usados para criar uma grelha de ensaios de design experimental (Design of Experiments, DoE). Uma vez que nem todos os fatores testados influenciaram de igual forma a produção de resveratrol em balão, para o desenho experimental foram apenas considerados os fatores temperatura, pH, concentração de indutor e a densidade ótica na altura da indução. Apesar de, estatisticamente, o modelo não ter sido validado, foi possível retirar conclusões acerca da produção de resveratrol nesta estirpe recombinante de E. coli. O máximo de produção obtido foi de 159.96 µg/mL, a maior concentração descrita até ao momento para esta estirpe. As condições para obtenção deste valor foram 4 mM de ácido p-cumárico adicionado à densidade ótica de 0.8, sendo o pH de 6.5 e a temperatura de 28 ºC. Este estudo revelou também que, embora haja fatores que influenciam grandemente a produção de resveratrol e crescimento bacteriano (como a temperatura e pH), verificou-se que a influência e interação com outros fatores têm um peso importante no resultado final, pois obtiveram-se concentrações elevadas de resveratrol quando alguns dos fatores do ensaio estavam mais distantes do ideal. Quanto aos resultados de fisiologia celular, pode concluir-se que cerca de 26 % das células se encontravam despolarizadas e 4 % estavam mortas no final de 30 horas de fermentação. Os elevados valores de células despolarizadas podem ser devido à falta de nutrientes no meio, que levou à quebra das funções básicas de manutenção nas células, como a manutenção do potencial de membrana. No entanto, elevadas concentrações de DMSO no indutor mostraram ter um efeito adverso na viabilidade celular. Quanto à análise da instabilidade segregacional, pode concluir-se que o PCN aumenta em ambos os plasmídeos das 22 às 30 horas, como se pode verificar no ensaio 8, em que os valores para as 22 e 30 horas oscilaram entre os 215 e os 1541 para o pAC-4CL e os 72 e 89 para o pUC-STS. Esta pode ser uma explicação para a produção mais elevada de resveratrol obtida às 30 horas de fermentação. Concluiu-se também que o plasmídeo pUC-STS é mais instável, pois as temperaturas usadas não favoreceram a sua indução, além de que contém um gene de resistência à ampicilina que favorece o aumento da instabilidade segregacional. No geral, os valores de PCN são mais baixos relativamente a outros estudos devido à carga metabólica imposta pelos plasmídeos, o que resulta em menores taxas de crescimento e aumenta a instabilidade segregacional. Em suma, neste estudo foi possível a produção de elevadas quantidades de resveratrol em bioreator a partir de microrganismos recombinantes e recorrendo a ferramentas adequadas de monitorização. Este estudo pode ser um possível ponto de partida para a produção industrial deste composto e uma alternativa viável em relação à síntese química e ao consumo dos recursos naturais

Bridging the gap to nontoxic fungal control

Doutoramento em Biologia - Instituto Superior de AgronomiaBlad is an edible, Lupinus cotyledon-derived 173 amino acid residue polypeptide which occurs naturally and undissociated as part of a soluble 210 kDa oligomer, hereby termed Bladcontaining oligomer (BCO). BCO is isolated during growth of Lupinus seedlings and is a breakdown product of β-conglutin catabolism. In this work, BCO inherent, potent and wide spectrum antifungal activity was demonstrated under in vitro and greenhouse conditions. Several field trials showed that BCO exhibits an equal or better performance than the conventional chemicals over a large variety of crops/fungal pathogens. BCO antifungal activity was also showed to extend to human pathogens, including both yeasts and filamentous fungi. In vitro tests demonstrated a higher efficacy on a molar basis when compared to the best chemical fungicides tested, with an absence of mammal toxicity or genotoxicity. In addition to the lectin and catalytic activities which allow BCO to target the fungal cell wall, this work revealed other highly complex and multitarget mode(s) of action. BCO enters fungal cells causing several morphological alterations and seems to essentially act through inhibition of metal ion homeostasis resulting in an apoptotic cell death. In an attempt to provide a structural characterization of Blad, data from electronic microscopy, dynamic light scattering, SAXS and X-ray crystallography were obtained from heterologous expressed Blad, however the results were not conclusive. Last but not least, this work also aimed at the development of a “super- Blad”: a fusion protein consisting of Blad and two selected antibacterial peptides, SP10-5 and Sub5. The resulting chimeras not only maintained a strong antibacterial activity but were also able to retain the ability to inhibit the growth of both yeast and filamentous fungi. In summary, the overall approach of this thesis considered phytopathogens and human pathogens as belonging to the same scientific area and therefore aimed at producing a uniform natural multitarget, step-stone antifungal solutionN/

Heat recovery from wastewater: numerical modelling of sewer systems

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia do Ambiente, perfil Engenharia SanitáriaThis thesis was carried as a collaboration of Delft University of Technology (TU Delft) and the companies Waternet and KWR. The main project aims to study the possibility of thermal energy recovery from wastewater, reducing the carbon dioxide (CO2) emissions linked to the energy sector. The present work is based on a previous computational model that was developed to simulate heat recovery from wastewater for constant flow rate and temperature of water. The first goal is to simulate a wastewater discharge. In order to achieve this, a Gaussian function was added to the boundary conditions for water flow rate and water temperature. As a second goal, this work aims to assess the significance of the terms present in the water heat balance and air heat balance equations. Binary coefficients were added in each term of both equations and then all the combinations were computed. The unsteady situation successfully simulated a main discharge and numerical predictions for water temperature and flow rate are presented. The deviations associated with the modified cases for the two equations suggest that the heat flux pipe to water (!!") and heat flux pipe to air (!!") terms are crucial for water and air heat balance predictions,respectively. In order to smooth extra oscillations, the time step (dt) was reduced and a smaller relative size of oscillations was obtained. This work concludes with a section of future developments in order to improve the results obtained. Despite of the fact that the current state of these routines does not allow us to accurately assess heat exchanges in pipes, promising results were obtained, proving that numerical modelling of heat recovery will contribute greatly to the development of the main project