Untersuchungen über die funktionelle Rolle des Neurotrophinrezeptors p75NTR

Neurotrophine sind für die Entwicklung und Funktion des Nervensystems von Wirbeltieren unabdingbar. Sie entfalten ihre vielfältigen Funktionen über zwei Typen von Transmembranrezeptoren. Einerseits binden sie an die Trk-Rezeptoren, andererseits an den Neurotrophinrezeptor p75NTR. Obwohl p75NTR der erste klonierte Neurotrophinrezeptor war, wird die Wirkungsweise von Trk-Rezeptoren heute besser verstanden als von p75NTR. Erstens besitzen Trk-Rezeptoren als Rezeptortyrosinkinasen im Gegensatz zu p75NTR eine intrinsische enzymatische Aktivität, was die Aufklärung ihrer Signaltransduktionsmechanismen bedeutend erleichtert hat. Zweitens vermitteln Trk-Rezeptoren die klassische trophische Funktion der Neurotrophine, p75NTR hingegen neuartige Funktionen von Neurotrophinen, die zuvor noch nicht bekannt waren. Diese nicht-klassischen Funktionen, wie beispielsweise die Zelltod auslösende Wirkung von NGF, werden erst seit den letzten Jahren untersucht. Drittens konnte die Funktion der Trk-Rezeptoren in vollständigen Deletionsmutanten der Maus analysiert werden, wohingegen von p75NTR erst seit kurzem ein vollständiger Knockout existiert. In unserem Labor war nämlich gefunden worden, dass eine Spleißvariante von p75NTR in der bereits beschriebenen Deletionsmutante noch exprimiert wird. Am Beginn dieser Doktorarbeit stand die nähere Charakterisierung dieser Spleißvariante im Vordergrund. Um ihre physiologische Relevanz zu klären, wurde zunächst versucht, die Spleißvariante als endogenes Protein zu detektieren. Dies gelang in Kulturen aus primären Schwannzellen. Wie zudem gezeigt wurde, ist diese Rezeptorisoform in einer in unserem Labor generierten Deletionsmutante von p75NTR nicht mehr vorhanden. Darüber hinaus wurde ein erheblich stärkerer Schwannzellphänotyp in der neuen Deletionsmutante gefunden im Vergleich zur bereits beschriebenen. Letztere stellt somit einen Hypomorph dar. Die Funktion von p75NTR konnte nunmehr erstmals mit Hilfe eines vollständigen Knockouts untersucht werden. Wurde p75NTR zunächst lediglich eine die Trk-Rezeptoren modulierende Funktion zugeschrieben, war bei Beginn dieser Doktorarbeit in mehreren Ansätzen gezeigt worden, dass p75NTR unabhängig von den Trk-Rezeptoren eigenständige Signalaktivität besitzt, die zudem derjenigen der Trk-Rezeptoren entgegengerichtet sein kann. Für eine detaillierte molekulare Analyse der Funktion von p75NTR ist ein In-vitro-Assay unverzichtbar. Ein zentrales Ziel dieser Arbeit war deshalb die Etablierung eines solchen Assays. Ein In-vitro-Assay für p75NTR unter Verwendung der vollständigen Deletionsmutante konnte in cerebellären Körnerzellen etabliert werden. Aktivierung von p75NTR mit NGF führt zu einer Erhöhung der RhoA-Aktivität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch TNFR, wie p75NTR ein Mitglied der TNFR-Überfamilie, RhoA aktiviert, obgleich mit einer klar unterschiedlichen Kinetik. Die TNFa-vermittelte Regulation von RhoA hemmte das Auswachsen von Neuriten. Im cerebellären Kultursystem konnte jedoch kein Effekt von NGF auf das Neuritenwachstum festgestellt werden. Weil Rho aber auch die Transkription steuern kann, wurde die Wirkung von NGF auf das Genexpressionsmuster von Körnerzellen mit einem ‘Gene-Profiling’-Experiment analysiert. Es wurden 69 Gene, die durch NGF entweder hoch- oder hinunterreguliert werden und zum Teil ‘Cluster’ bilden, gefunden. Mit Hilfe der vollständigen Deletionsmutante wurden bisher GAP-5 und GluR2 als neue Zielgene von p75NTR identifiziert. GluR2 kodiert für eine der vier AMPA-Rezeptor-Untereinheiten und spielt eine zentrale Rolle für die synaptische Plastizität. Da in einem unabhängigen Ansatz ein Defekt bei der Ausprägung von hippocampalem LTD (‘long term depression’), einer Form von synaptischer Plastizität, im vollständigen Knockout von p75NTR gefunden worden war, wurde der weitere Schwerpunkt dieser Arbeit auf den AMPA-Rezeptor gelegt. Die weitere Untersuchung aller AMPA-Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus ergab, dass neben GluR2 auch GluR3 ein Zielgen von p75NTR ist und dass zudem GluR2 wie auch GluR3, jedoch nicht GluR1 und GluR4, in vivo im p75NTR-Knockout im Vergleich zum Wildtyp in ihrer Expression signifikant verändert sind. Diese Befunde legen eine veränderte Stöchiometrie des AMPA-Rezeptors im p75NTR-Knockout nahe und liefern einen Erklärungsansatz für das veränderte LTD in der p75NTR-Deletionsmutante. Zudem erweitern sie das Konzept der Bedeutung von Neurotrophinen für die synaptische Plastizität im Allgemeinen und der von p75NTR im Speziellen

Untersuchungen über die funktionelle Rolle des Neurotrophinrezeptors p75NTR

Neurotrophine sind für die Entwicklung und Funktion des Nervensystems von Wirbeltieren unabdingbar. Sie entfalten ihre vielfältigen Funktionen über zwei Typen von Transmembranrezeptoren. Einerseits binden sie an die Trk-Rezeptoren, andererseits an den Neurotrophinrezeptor p75NTR. Obwohl p75NTR der erste klonierte Neurotrophinrezeptor war, wird die Wirkungsweise von Trk-Rezeptoren heute besser verstanden als von p75NTR. Erstens besitzen Trk-Rezeptoren als Rezeptortyrosinkinasen im Gegensatz zu p75NTR eine intrinsische enzymatische Aktivität, was die Aufklärung ihrer Signaltransduktionsmechanismen bedeutend erleichtert hat. Zweitens vermitteln Trk-Rezeptoren die klassische trophische Funktion der Neurotrophine, p75NTR hingegen neuartige Funktionen von Neurotrophinen, die zuvor noch nicht bekannt waren. Diese nicht-klassischen Funktionen, wie beispielsweise die Zelltod auslösende Wirkung von NGF, werden erst seit den letzten Jahren untersucht. Drittens konnte die Funktion der Trk-Rezeptoren in vollständigen Deletionsmutanten der Maus analysiert werden, wohingegen von p75NTR erst seit kurzem ein vollständiger Knockout existiert. In unserem Labor war nämlich gefunden worden, dass eine Spleißvariante von p75NTR in der bereits beschriebenen Deletionsmutante noch exprimiert wird. Am Beginn dieser Doktorarbeit stand die nähere Charakterisierung dieser Spleißvariante im Vordergrund. Um ihre physiologische Relevanz zu klären, wurde zunächst versucht, die Spleißvariante als endogenes Protein zu detektieren. Dies gelang in Kulturen aus primären Schwannzellen. Wie zudem gezeigt wurde, ist diese Rezeptorisoform in einer in unserem Labor generierten Deletionsmutante von p75NTR nicht mehr vorhanden. Darüber hinaus wurde ein erheblich stärkerer Schwannzellphänotyp in der neuen Deletionsmutante gefunden im Vergleich zur bereits beschriebenen. Letztere stellt somit einen Hypomorph dar. Die Funktion von p75NTR konnte nunmehr erstmals mit Hilfe eines vollständigen Knockouts untersucht werden. Wurde p75NTR zunächst lediglich eine die Trk-Rezeptoren modulierende Funktion zugeschrieben, war bei Beginn dieser Doktorarbeit in mehreren Ansätzen gezeigt worden, dass p75NTR unabhängig von den Trk-Rezeptoren eigenständige Signalaktivität besitzt, die zudem derjenigen der Trk-Rezeptoren entgegengerichtet sein kann. Für eine detaillierte molekulare Analyse der Funktion von p75NTR ist ein In-vitro-Assay unverzichtbar. Ein zentrales Ziel dieser Arbeit war deshalb die Etablierung eines solchen Assays. Ein In-vitro-Assay für p75NTR unter Verwendung der vollständigen Deletionsmutante konnte in cerebellären Körnerzellen etabliert werden. Aktivierung von p75NTR mit NGF führt zu einer Erhöhung der RhoA-Aktivität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch TNFR, wie p75NTR ein Mitglied der TNFR-Überfamilie, RhoA aktiviert, obgleich mit einer klar unterschiedlichen Kinetik. Die TNFa-vermittelte Regulation von RhoA hemmte das Auswachsen von Neuriten. Im cerebellären Kultursystem konnte jedoch kein Effekt von NGF auf das Neuritenwachstum festgestellt werden. Weil Rho aber auch die Transkription steuern kann, wurde die Wirkung von NGF auf das Genexpressionsmuster von Körnerzellen mit einem ‘Gene-Profiling’-Experiment analysiert. Es wurden 69 Gene, die durch NGF entweder hoch- oder hinunterreguliert werden und zum Teil ‘Cluster’ bilden, gefunden. Mit Hilfe der vollständigen Deletionsmutante wurden bisher GAP-5 und GluR2 als neue Zielgene von p75NTR identifiziert. GluR2 kodiert für eine der vier AMPA-Rezeptor-Untereinheiten und spielt eine zentrale Rolle für die synaptische Plastizität. Da in einem unabhängigen Ansatz ein Defekt bei der Ausprägung von hippocampalem LTD (‘long term depression’), einer Form von synaptischer Plastizität, im vollständigen Knockout von p75NTR gefunden worden war, wurde der weitere Schwerpunkt dieser Arbeit auf den AMPA-Rezeptor gelegt. Die weitere Untersuchung aller AMPA-Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus ergab, dass neben GluR2 auch GluR3 ein Zielgen von p75NTR ist und dass zudem GluR2 wie auch GluR3, jedoch nicht GluR1 und GluR4, in vivo im p75NTR-Knockout im Vergleich zum Wildtyp in ihrer Expression signifikant verändert sind. Diese Befunde legen eine veränderte Stöchiometrie des AMPA-Rezeptors im p75NTR-Knockout nahe und liefern einen Erklärungsansatz für das veränderte LTD in der p75NTR-Deletionsmutante. Zudem erweitern sie das Konzept der Bedeutung von Neurotrophinen für die synaptische Plastizität im Allgemeinen und der von p75NTR im Speziellen

Collaborating by courier, imaging by mail

Core facilities offer visiting scientists access to equipment and expertise to generate and analyze data. For some projects, it might however be more efficient to collaborate remotely by sending in samples

Nogo receptor is involved in the adhesion of dendritic cells to myelin

BACKGROUND: Nogo-66 receptor NgR1 and its structural homologue NgR2 are binding proteins for a number of myelin-associated inhibitory factors. After neuronal injury, these inhibitory factors are responsible for preventing axonal outgrowth via their interactions with NgR1 and NgR2 expressed on neurons. In vitro, cells expressing NgR1/2 are inhibited from adhering to and spreading on a myelin substrate. Neuronal injury also results in the presence of dendritic cells (DCs) in the central nervous system, where they can come into contact with myelin debris. The exact mechanisms of interaction of immune cells with CNS myelin are, however, poorly understood. METHODS: Human DCs were differentiated from peripheral blood monocytes and mouse DCs were differentiated from wild type and NgR1/NgR2 double knockout bone marrow precursors. NgR1 and NgR2 expression were determined with quantitative real time PCR and immunoblot, and adhesion of cells to myelin was quantified. RESULTS: We demonstrate that human immature myeloid DCs express NgR1 and NgR2, which are then down-regulated upon maturation. Human mature DCs also adhere to a much higher extent to a myelin substrate than immature DCs. We observe the same effect when the cells are plated on Nogo-66-His (binding peptide for NgR1), but not on control proteins. Mature DCs taken from Ngr1/2 knockout mice adhere to a much higher extent to myelin compared to wild type mouse DCs. In addition, Ngr1/2 knockout had no effect on in vitro DC differentiation or phenotype. CONCLUSIONS: These results indicate that a lack of NgR1/2 expression promotes the adhesion of DCs to myelin. This interaction could be important in neuroinflammatory disorders such as multiple sclerosis in which peripheral immune cells come into contact with myelin debris

SatSel: A Satellite Selection Algorithm to reduce delivery time in DTN-Nanosatellite Networks for Internet Access in Rural Areas.

There are some different ways to connect rural areas to the Internet. One of these provides the use of a nanosatellite constellation. This type of network allows people in rural areas to enjoy all services the Internet can offer keeping low the cost of Internet access. One of the critical aspect is related to the delivery time, because LEO satellite links are not always up. This means that the system must be able to deal with periodic disruptions and high delays in the path from the source to the destination, considering that data could be stored in nanosatellite, Internet gateway (also called hot spot), and rural gateway (also called cold spot) buffers also for several seconds or minutes waiting to be forwarded. In the path from rural areas to the Internet, it is possible to reduce data delivery time acting on rural gateways. We propose SatSel: a selection algorithm which allows the cold spots to choose the nanosatellite to whom upload data in order to reduce the data delivery tim

The endogenous caspase-8 inhibitor c-FLIPL regulates ER morphology and crosstalk with mitochondria

Components of the death receptors-mediated pathways like caspase-8 have been identified in complexes at intracellular membranes to spatially restrict the processing of local targets. In this study, we report that the long isoform of the cellular FLICE-inhibitory protein (c-FLIPL), a well- known inhibitor of the extrinsic cell death initiator caspase-8, localizes at the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria-associated membranes (MAMs). ER morphology was disrupted and ER Ca2+-release as well as ER-mitochondria tethering were decreased in c-FLIP-/- mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Mechanistically, c-FLIP ablation resulted in enhanced basal caspase-8 activation and in caspase-mediated processing of the ER-shaping protein reticulon-4 (RTN4) that was corrected by re-introduction of c-FLIPL and caspase inhibition, resulting in the recovery of a normal ER morphology and ER-mitochondria juxtaposition. Thus, the caspase-8 inhibitor c-FLIPL emerges as a component of the MAMs signaling platforms, where caspases appear to regulate ER morphology and ER-mitochondria crosstalk by impinging on ER-shaping proteins like the RTN4

Drosophila Neurotrophins Reveal a Common Mechanism for Nervous System Formation

Neurotrophic interactions occur in Drosophila, but to date, no neurotrophic factor had been found. Neurotrophins are the main vertebrate secreted signalling molecules that link nervous system structure and function: they regulate neuronal survival, targeting, synaptic plasticity, memory and cognition. We have identified a neurotrophic factor in flies, Drosophila Neurotrophin (DNT1), structurally related to all known neurotrophins and highly conserved in insects.By investigating with genetics the consequences of removing DNT1 or adding it in excess, we show that DNT1 maintains neuronal survival, as more neurons die in DNT1 mutants and expression of DNT1 rescues naturally occurring cell death, and it enables targeting by motor neurons. We show that Spa¨ tzle and a further fly neurotrophin superfamily member, DNT2, also have neurotrophic functions in flies. Our findings imply that most likely a neurotrophin was present in the common ancestor of all bilateral organisms, giving rise to invertebrate and vertebrate neurotrophins through gene or whole-genome duplications. This work provides a missing link between aspects of neuronal function in flies and vertebrates, and it opens the opportunity to use Drosophila to investigate further aspects of neurotrophin function and to model related diseases

Sphingosine-1-Phosphate and the S1P3 Receptor Initiate Neuronal Retraction via RhoA/ROCK Associated with CRMP2 Phosphorylation

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) or licensor are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.The bioactive lipid sphingosine-1-phosphate (S1P) is an important regulator in the nervous system. Here, we explored the role of S1P and its receptors in vitro and in preclinical models of peripheral nerve regeneration. Adult sensory neurons and motor neuron-like cells were exposed to S1P in an in vitro assay, and virtually all neurons responded with a rapid retraction of neurites and growth cone collapse which were associated with RhoA and ROCK activation. The S1P1 receptor agonist SEW2871 neither activated RhoA or neurite retraction, nor was S1P-induced neurite retraction mitigated in S1P1-deficient neurons. Depletion of S1P3 receptors however resulted in a dramatic inhibition of S1P-induced neurite retraction and was on the contrary associated with a significant elongation of neuronal processes in response to S1P. Opposing responses to S1P could be observed in the same neuron population, where S1P could activate S1P1 receptors to stimulate elongation or S1P3 receptors and retraction. S1P was, for the first time in sensory neurons, linked to the phosphorylation of collapsin response-mediated protein-2 (CRMP2), which was inhibited by ROCK inhibition. The improved sensory recovery after crush injury further supported the relevance of a critical role for S1P and receptors in fine-tuning axonal outgrowth in peripheral neurons

Adaptive evolution of voltage-gated sodium channels : the first 800 million years

Author Posting. © The Author(s), 2012. This is the author's version of the work. It is posted here by permission of National Academy of Sciences for personal use, not for redistribution. The definitive version was published in Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109 (2012): 10619-10625, doi:10.1073/pnas.1201884109.Voltage-gated Na+-permeable (Nav) channels form the basis for electrical excitability in animals. Nav channels evolved from Ca2+ channels and were present in the common ancestor of choanoflagellates and animals although this channel was likely permeable to both Na+ and Ca2+. Thus, like many other neuronal channels and receptors, Nav channels predated neurons. Invertebrates possess two Nav channels (Nav1, Nav2), whereas vertebrate Nav channels are of the Nav1 family. Approximately 500 MYA in early chordates Nav channels evolved a motif that allowed them to cluster at axon initial segments, 50MY later with the evolution of myelin, Nav channels “capitalized” on this property and clustered at nodes of Ranvier. The enhancement of conduction velocity along with the evolution of jaws likely made early gnathostomes fierce predators and the dominant vertebrates in the ocean. Later in vertebrate evolution, the Nav channel gene family expanded in parallel in tetrapods and teleosts (~9-10 genes in amniotes, 8 in teleosts). This expansion occurred during or after the late Devonian extinction when teleosts and tetrapods each diversified in their respective habitats and coincided with an increase in the number of telencephalic nuclei in both groups. The expansion of Nav channels may have allowed for more sophisticated neural computation and tailoring of Nav channel kinetics with potassium channel kinetics to enhance energy savings. Nav channels show adaptive sequence evolution for increasing diversity in communication signals (electric fish), in protection against lethal Nav channel toxins (snakes, newts, pufferfish, insects), and in specialized habitats (naked mole rats).Much of the work from my laboratory discussed in this article was funded by NIH R01 NS025513

Nogo-Receptors NgR1 and NgR2 Do Not Mediate Regulation of CD4 T Helper Responses and CNS Repair in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Myelin-associated inhibition of axonal regrowth after injury is considered one important factor that contributes to regeneration failure in the adult central nervous system (CNS). Blocking strategies targeting this pathway have been successfully applied in several nerve injury models, including experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), suggesting myelin-associated inhibitors (MAIs) and functionally related molecules as targets to enhance regeneration in multiple sclerosis. NgR1 and NgR2 were identified as interaction partners for the myelin proteins Nogo-A, MAG and OMgp and are probably mediating their growth-inhibitory effects on axons, although the in vivo relevance of this pathway is currently under debate. Recently, alternative functions of MAIs and NgRs in the regulation of immune cell migration and T cell differentiation have been described. Whether and to what extent NgR1 and NgR2 are contributing to Nogo and MAG-related inhibition of neuroregeneration or immunomodulation during EAE is currently unknown. Here we show that genetic deletion of both receptors does not promote functional recovery during EAE and that NgR1 and NgR2-mediated signals play a minor role in the development of CNS inflammation. Induction of EAE in Ngr1/2-double mutant mice resulted in indifferent disease course and tissue damage when compared to WT controls. Further, the development of encephalitogenic CD4+ Th1 and Th17 responses was unchanged. However, we observed a slightly increased leukocyte infiltration into the CNS in the absence of NgR1 and NgR2, indicating that NgRs might be involved in the regulation of immune cell migration in the CNS. Our study demonstrates the urgent need for a more detailed knowledge on the multifunctional roles of ligands and receptors involved in CNS regeneration failure