Untersuchung der Gene von Erythropoetin und Erythropoetin-Rezeptor als Kandidatengene für die Variabilität in der Erythropoese beim Schwein

Anämien stellen bei Hausschweinen häufig vorkommende Krankheitssymptome dar. Dabei scheint es rassetypische Unterschiede in der Ausprägung der Anämien zu geben. Allerdings ist über die molekulargenetische Komponente in der Ausbildung noch recht wenig bekannt. Diskutiert werden molekulare Veränderungen in dem bei der Erythrozytenbildung beteiligten Protein Erythropoetin oder dem auf den erythroiden Vorläuferzellen vorkommenden Erythropoetin-Rezeptor. Beim Menschen sind Mutationen bekannt, die zu einer Änderung des Rezeptors, bzw. den an der Signalkaskade beteiligten Proteinen führen, und damit die Ausbildung von Anämien induzieren. Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, genetische Unterschiede in den Genen EPO und EPOR zu detektieren, die mit Varianzen in der Ausprägung des roten Blutbildes beim Schwein assoziiert sind. Anhand einer gut charakterisierten Pietrain-Meishan-Kreuzungspopulation wurden die Gene EPO und EPOR auf ihre genetische Variabilität hin untersucht. Ziel war es, das für die QTL verantwortliche Nukleotid (QTN) auf den Chromosomen 2 und 3 zu detektieren. Mittels vergleichender Sequenzanalyse konnten in EPO und dessen Promotorregion insgesamt 21 SNPs und in EPOR insgesamt 4 SNPs identifiziert werden. Um die 139 F2-Tiere der Pietrain- Meishan-Kreuzungspopulation auf ihre Genotypen hinsichtlich der neu identifizierten SNPs zu charakterisieren, wurde das Verfahren der Pyrosequenzierung angewendet. Anhand der ermittelten Genotypen der Parenteralgeneration und der Lage der SNPs in der Gensequenz wurden insgesamt 7 der 21 SNPs in EPO in die nachfolgende QTL-Analyse einbezogen. Da die F2-Population bei zwei der vier SNPs in EPOR eine Ungleichverteilung der Genotypen aufwies, wurden diese SNPs in der darauffolgenden QTL-Analyse nicht weiter berücksichtigt. Unter Einbeziehung der neu entwickelten SNPs zeigten sich für die bekannten QTL auf den Chromosomen 2 und 3 positive Effekte. Während der Einfluss auf den QTL auf Chromosom 2 vergleichsweiße eher gering war, zeigte sich jedoch für den QTL auf Chromosom 3 eine signifikante Assoziation unter Einbeziehung des SNPs ERE7. Tiere mit dem Meishangenotyp (CC) hatten signifikant höhere Werte für verschiedene Parameter des roten Blutbilds. In einer kommerziellen Population von 90 Hybridsauen (Jungsauen DLxDE) konnte die Assoziation zwischen dem Genotyp CC von ERE7 und den Parametern RBC, Hämatokrit und Hämoglobin ebenfalls hergestellt werden. Auch hier zeigten Tiere mit dem Genotyp CC signifikant höhere Werte. Am deutlichsten wurde dieser Zusammenhang bei der Retikulozytenzahl. Es scheint, als wären die Tiere mit dem Genotyp CC schneller und effizienter in der Lage Erythrozyten nachzubilden. Allerdings war der SNP nicht mit einem Aminosäurenaustausch verknüpft; daher ist ERE7 mit großer Wahrscheinlichkeit nicht der gesuchte QTN sondern wird mit diesem nur gekoppelt vererbt. In der hier vorliegenden Arbeit wurde kein weiterer SNP entdeckt, welcher den gesuchten QTN darstellen könnte. Es ist denkbar, dass der gesuchte QTN im Promotor des EPOR-Gens liegt, da hier elementare Steuerungselemente für die Transkriptionsaktivitiät liegen. Aufgrund der zum Zeitpunkt der Anfertigung der Arbeit nur zum Teil bekannten Sequenzen des Promotors von EPOR, konnte die Untersuchung des Promotors allerdings nur in geringem Umfang realisiert werden. Die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit untermauern dennoch die Hypothese, dass EPOR ein Kandidatengen für die Variabilität in der Ausprägung des roten Blutbilds beim Schwein darstellt. Außerdem unterstreichen sie die Annahme, dass im EPOR-Gen des Schweins wie auch beim Menschen Mutationen auftreten können, die die Bildung reifer Erythrozyten beeinflussen. Die Arbeit zeigt, dass die genetische Variabilität auch in der Hybridpopulation vorhanden ist und somit genetisch unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber Anämien bei Mastschweinen bestehen. In weiteren Untersuchungen sollte nun abschließend geklärt werden, wo der eigentlich gesuchte QTN im EPOR-Gen liegt und welche weiteren Kopplungseffekte mit ERE7 zu erwarten sind. Dann wäre auch eine tierzüchterische Nutzung dieses SNPs im Hinblick auf die Krankheitsresistenz beim Schwein denkbar.Forms of anemia occure frequently in domestic pigs and differences in the manifestation of anemia seem to be existent in different pig breeds. The molecular components of such differences, however, remain unknown. Molecular variation in erythropoietin and the erythropoietin receptor which are involved in the process of erythropoiesis might be candidates for genetic differences between populations and breeds. Mutations inducing anemia because of conformational or regulatory changes of the proteins or the signaling pathways are well known in humans. The aim of the present study was to detect genetic variation in candidate genes EPO and EPOR associated with differences in erythropoiesis in swine. EPO and EPOR were sequenced in a well described Pietrain-Meishan-F2-Family. Both genes were screened for SNPs that could be associated with the effects of two QTL for erythroid traits that had been mapped to porcine chromosomes (SSC) 2 and 3. Twenty one and 4 SNPs were detected in EPO and EPOR, respectively. Based on amino acid substitution, homozygosity and differences between founder breeds, a set of the 7 most promising SNPs was chosen for a screening of the 139 F2-pigs by pyrosequencing. While the influence on the QTL on chromosome 3 was comparatively low, the QTL on SSC2 was significiantly affected by SNP ERE7. Pigs homozygous for the Meishan-allele (C) showed more effective erythrocyte phenotypes. This association could be verified in a commercial cohort of 90 hybrid-sows (gilt German Landrace x German Edelschwein). However, this SNP was not associated with amino acid substitution. Thus, it seems to be linked with, but not the QTN responsible for the genetic variability of erythroid parameters in this population. SNPs in the promotor of EPOR could not bei comprehensively analysed, because the sequences of EPO and EPOR were not available from public resources at the time of this investigation and a BAC with the complete sequence could not be isolated from the screened BAC bank. Further studies are needed to identify the QTN that could help to sceen for pigs with a desirably high efficience in eryhtopoiesis that could help stabilizing pigs adaptional potential to diseases in the future

Atypical APC/C-dependent degradation of Mcl-1 provides an apoptotic timer during mitotic arrest

The initiation of apoptosis in response to the disruption of mitosis provides surveillance against chromosome instability. Here, we show that proteolytic destruction of the key regulator Mcl-1 during an extended mitosis requires the anaphase-promoting complex or cyclosome (APC/C) and is independent of another ubiquitin E3 ligase, SCF Using live-cell imaging, we show that the loss of Mcl-1 during mitosis is dependent on a D box motif found in other APC/C substrates, while an isoleucine-arginine (IR) C-terminal tail regulates the manner in which Mcl-1 engages with the APC/C, converting Mcl-1 from a Cdc20-dependent and checkpoint-controlled substrate to one that is degraded independently of checkpoint strength. This mechanism ensures a relatively slow but steady rate of Mcl-1 degradation during mitosis and avoids its catastrophic destruction when the mitotic checkpoint is satisfied, providing an apoptotic timer that can distinguish a prolonged mitotic delay from normal mitosis. Importantly, we also show that inhibition of Cdc20 promotes mitotic cell death more effectively than loss of APC/C activity through differential effects on Mcl-1 degradation, providing an improved strategy to kill cancer cells