Desarrollo de herramientas bioinformáticas aplicadas al Diagnóstico Genético mediante Secuenciación Masiva

La extraordinaria evolución tecnológica de una nueva generación de plataformas de secuenciación, que reciben el nombre de ‘Next-Generation Sequencing’ o NGS, unida al desarrollo de sistemas de captura de regiones específicas del genoma han permitido superar las limitaciones técnicas y económicas que impedían realizar el cribado de un gran número de genes o incluso del exoma completo de manera rutinaria. El análisis de los datos procedentes de este tipo de estudios es complejo no solo por la enorme cantidad de información que se genera por muestra sino también por las peculiaridades asociadas a cada una de las combinaciones posibles entre plataforma de secuenciación y sistema de captura. Actualmente, existe un amplio abanico de posibles piezas de software orientadas a resolver pasos muy concretos del extenso flujo de análisis necesario para el procesamiento de este tipo de datos. Sin embargo, la combinación de diferentes herramientas así como la elección de diferentes parámetros en su ejecución producen resultados muy dispares ofreciendo distintos grados de incertidumbre en los resultados cuya repercusión debe ser determinada para poder trasladar a la práctica clínica este tipo de tecnologías. Esta tesis muestra el desarrollo y la validación de diferentes protocolos de trabajo para el análisis integral de datos procedentes de estudios de resecuenciación dirigida mediante tecnologías NGS a partir de muestras controladas con el objetivo de identificar las variables más importantes del sistema en estudio y describir un método robusto y eficiente de análisis que permitan realizar un diagnóstico sólido. Las diferentes rutinas de trabajo generadas abarcan desde el análisis inicial del dato bruto hasta la identificación de las mutaciones causantes de la enfermedad o la priorización de genes candidatos. El primero de los protocolos desarrollados fue aplicado al estudio del exoma completo de un individuo con Anemia de Fanconi cuyo diagnóstico, tras la secuenciación de varios genes por Sanger, seguía siendo una incógnita. A través del análisis del exoma de este único individuo fue posible identificar un nuevo gen responsable de su enfermedad demostrándose así no solo la eficiencia de sistema de análisis desarrollado sino también la idoneidad de esta técnica en este tipo de casos. Este mismo protocolo actualizado fue aplicado con éxito en el análisis de un panel de genes diseñado ‘ad hoc’ para el diagnóstico de diferentes cardiomiopatías en un grupo controlado de pacientes demostrando su idoneidad en este tipo de enfermedades, difícilmente abordables por técnicas tradicionales desde el punto de vista económico debido a su alta heterogeneidad genética. Finalmente, una nueva adaptación de este último protocolo a los datos procedentes de mini-secuenciadores con tecnología NGS demostró su idoneidad y precisión en el estudio de los genes BRCA1 y BRCA2 en un grupo de muestras control. Paralelamente, esta tesis hace una profunda reflexión sobre la aplicación de la secuenciación masiva al Diagnóstico Genético señalando sus ventajas y limitaciones para su uso en las prácticas clínicas de rutinaria

CD5 and CD6 as immunoregulatory biomarkers in non-small cell lung cancer

Background: The study of immune surveillance in the tumour microenvironment is leading to the development of new biomarkers and therapies. The present research focuses on the expression of CD5 and CD6 - two lymphocyte surface markers involved in the fine tuning of TCR signaling - as potential prognostic biomarkers in resectable stages of non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods: CD5 and CD6 gene expression was analysed by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RTqPCR) in 186 paired fresh frozen tumour and normal tissue samples of resected NSCLC. Results: Patients with higher CD5 expression had significantly increased overall survival (OS, 49.63 vs. 99.90 months, p=0.013). CD5 expression levels were correlated to CD4 infiltration and expression levels, and survival analysis showed that patients with a higher CD5/CD4+ ratio had significantly improved prognosis. Multivariate analysis established CD5 expression as an independent prognostic biomarker for OS in early stages of NSCLC [HR=0.554; 95% CI, 0.360-0.853; p=0.007]. Further survival analysis of NSCLC cases (n=97) from The Cancer Genome Atlas (TCGA) database, confirmed the prognostic value of both CD5 and CD6 expression¸ although CD6 expression alone did not reach significant prognostic value in our NSCLC training cohort. Conclusions: Our data support further studies on CD5 and CD6 as novel prognostic markers in resectable NSCLC and other cancer types (i.e., melanoma), as well as a role for these receptors in immune surveillance

Expanded CTG repeats trigger miRNA alterations in Drosophila that are conserved in myotonic dystrophy type 1 patients

Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is caused by the expansion of CTG repeats in the 3' untranslated region of the DMPK gene. Several missplicing events and transcriptional alterations have been described in DM1 patients. A large number of these defects have been reproduced in animal models expressing CTG repeats alone. Recent studies have also reported miRNA dysregulation in DM1 patients. In this work, a Drosophila model was used to investigate miRNA transcriptome alterations in the muscle, specifically triggered by CTG expansions. Twenty miRNAs were differentially expressed in CTG-expressing flies. Of these, 19 were down-regulated, whereas 1 was up-regulated. This trend was confirmed for those miRNAs conserved between Drosophila and humans (miR-1, miR-7 and miR-10) in muscle biopsies from DM1 patients. Consistently, at least seven target transcripts of these miRNAs were up-regulated in DM1 skeletal muscles. The mechanisms involved in dysregulation of miR-7 included a reduction of its primary precursor both in CTG-expressing flies and in DM1 patients. Additionally, a regulatory role for Muscleblind (Mbl) was also suggested for miR-1 and miR-7, as these miRNAs were down-regulated in flies where Mbl had been silenced. Finally, the physiological relevance of miRNA dysregulation was demonstrated for miR-10, since over-expression of this miRNA in Drosophila extended the lifespan of CTG-expressing flies. Taken together, our results contribute to our understanding of the origin and the role of miRNA alterations in DM1. © The Author 2012. Published by Oxford University Press. All rights reserved.Fundacion Ramon Areces; Generalitat Valenciana (Prometeo/2010/081); Ministerio de Ciencia e Innovacion (SAF2006-09121) in collaboration with the biotechnology company Sistemas Genomicos S.L.; FIS (FIS09-00660) ; Isabel Gemio Foundation; Accion Especial de Enfermedades Raras ‘Cetegen’ by Genoma Espana Foundation; Generalitat Valenciana; Fundacion Ramon Areces; Banca Civica; Basque Government (AE-BFI-08.164); ISCIII; Ministerio de Economia y CompetitividadPeer Reviewe

"Proteotranscriptomic analysis of advanced colorectal cancer patient derived organoids for drug sensitivity prediction"

Background: Patient-derived organoids (PDOs) from advanced colorectal cancer (CRC) patients could be a key platform to predict drug response and discover new biomarkers. We aimed to integrate PDO drug response with multi-omics characterization beyond genomics. Methods: We generated 29 PDO lines from 22 advanced CRC patients and provided a morphologic, genomic, and transcriptomic characterization. We performed drug sensitivity assays with a panel of both standard and non-standard agents in five long-term cultures, and integrated drug response with a baseline proteomic and transcriptomic characterization by SWATH-MS and RNA-seq analysis, respectively. Results: PDOs were successfully generated from heavily pre-treated patients, including a paired model of advanced MSI high CRC deriving from pre- and post-chemotherapy liver metastasis. Our PDOs faithfully reproduced genomic and phenotypic features of original tissue. Drug panel testing identified differential response among PDOs, particularly to oxaliplatin and palbociclib. Proteotranscriptomic analyses revealed that oxaliplatin non-responder PDOs present enrichment of the t-RNA aminoacylation process and showed a shift towards oxidative phosphorylation pathway dependence, while an exceptional response to palbociclib was detected in a PDO with activation of MYC and enrichment of chaperonin T-complex protein Ring Complex (TRiC), involved in proteome integrity. Proteotranscriptomic data fusion confirmed these results within a highly integrated network of functional processes involved in differential response to drugs. Conclusions: Our strategy of integrating PDOs drug sensitivity with SWATH-mass spectrometry and RNA-seq allowed us to identify different baseline proteins and gene expression profiles with the potential to predict treatment response/resistance and to help in the development of effective and personalized cancer therapeutics

Mutations in ERCC4, encoding the DNA-repair endonuclease XPF, cause Fanconi anemia

BFanconi anemia (FA) is a rare genomic instability disorder characterized by progressive bone marrow failure and predisposition to cancer. FA-associated gene products are involved in the repair of DNA interstrand crosslinks (ICLs). Fifteen FA-associated genes have been identified, but the genetic basis in some individuals still remains unresolved. Here, we used whole-exome and Sanger sequencing on DNA of unclassified FA individuals and discovered biallelic germline mutations in ERCC4 (XPF), a structure-specific nuclease-encoding gene previously connected to xeroderma pigmentosum and segmental XFE progeroid syndrome. Genetic reversion and wild-type ERCC4 cDNA complemented the phenotype of the FA cell lines, providing genetic evidence that mutations in ERCC4 cause this FA subtype. Further biochemical and functional analysis demonstrated that the identified FA-causing ERCC4 mutations strongly disrupt the function of XPF in DNA ICL repair without severely compromising nucleotide excision repair. Our data show that depending on the type of ERCC4 mutation and the resulting balance between both DNA repair activities, individuals present with one of the three clinically distinct disorders, highlighting the multifunctional nature of the XPF endonuclease in genome stability and human disease

Mutations in ERCC4, Encoding the DNA-Repair Endonuclease XPF, Cause Fanconi Anemia

Fanconi anemia (FA) is a rare genomic instability disorder characterized by progressive bone marrow failure and predisposition to cancer. FA-associated gene products are involved in the repair of DNA interstrand crosslinks (ICLs). Fifteen FA-associated genes have been identified, but the genetic basis in some individuals still remains unresolved. Here, we used whole-exome and Sanger sequencing on DNA of unclassified FA individuals and discovered biallelic germline mutations in ERCC4 (XPF), a structure-specific nuclease-encoding gene previously connected to xeroderma pigmentosum and segmental XFE progeroid syndrome. Genetic reversion and wild-type ERCC4 cDNA complemented the phenotype of the FA cell lines, providing genetic evidence that mutations in ERCC4 cause this FA subtype. Further biochemical and functional analysis demonstrated that the identified FA-causing ERCC4 mutations strongly disrupt the function of XPF in DNA ICL repair without severely compromising nucleotide excision repair. Our data show that depending on the type of ERCC4 mutation and the resulting balance between both DNA repair activities, individuals present with one of the three clinically distinct disorders, highlighting the multifunctional nature of the XPF endonuclease in genome stability and human disease.clos

Molecular profiling of advanced solid tumours. The impact of experimental molecular-matched therapies on cancer patient outcomes in early-phase trials: the MAST study

Molecular-matched therapies have revolutionized cancer treatment. We evaluated the improvement in clinical outcomes of applying an in-house customized Next Generation Sequencing panel in a single institution

Promoción de la salud y entornos saludables

Acné juvenil, presentación de 2 casos clínicosAlta ingesta de proteínas y su relación con el aumento de tejido adiposo en preescolaresAnálisis para la integración entre salud y educación para el desarrollo de programas de promociónCalidad de los estilos de vida de funcionarios académicos de la Universidad del BiobíoCambios en el patrón de consumo de alimentos en niños con un kiosco saludableCaracterísticas del sueño habitual y su relación con el nivel de somnolencia diurna en adolescentesCaracterización de información acerca de promoción de salud población urbana de Temuco, Región de la Araucanía, ChileComportamiento sexual durante el embarazo en usuarias de centros de salud, La Florida, Santiago, 2006Estado nutricional y actividad física en escolares de 1º, 5º y 8º básico de Arica¿Están los padres informados si sus hijos tienen miedo a la atención dental?Evaluación cualitativa del componente promocional de un programa psicosocial en población escolar vulnerableEvaluación de la efectividad de la aplicación del Programa Educativo "Quiero mi boca siempre sana"Evaluación estadística del uso de edulcorantes alimentarios en una población de SantiagoEvolución de la prematurez y características sociodemográficas de la población materna en ChileFactores de riesgo asociados a prevalencia de caries en alumnos del Ejército de ChileHábitos alimentarios en escolares de distinto tipo de establecimientos educacionalesNivel de conocimientos de los habitantes de Loncoche sobre enfermedades parasitarias, IX, Región, Chile 2009Nutrición y condiciones socioeconómicas de escolares de la escuela Jesús María Sifontes, Los Teques, VenezuelaRelación entre dificultad para comprar cigarrillos, lugares de venta y curso en adolescente

Promoción de la salud y entornos saludables

Acné juvenil, presentación de 2 casos clínicosAlta ingesta de proteínas y su relación con el aumento de tejido adiposo en preescolaresAnálisis para la integración entre salud y educación para el desarrollo de programas de promociónCalidad de los estilos de vida de funcionarios académicos de la Universidad del BiobíoCambios en el patrón de consumo de alimentos en niños con un kiosco saludableCaracterísticas del sueño habitual y su relación con el nivel de somnolencia diurna en adolescentesCaracterización de información acerca de promoción de salud población urbana de Temuco, Región de la Araucanía, ChileComportamiento sexual durante el embarazo en usuarias de centros de salud, La Florida, Santiago, 2006Estado nutricional y actividad física en escolares de 1º, 5º y 8º básico de Arica¿Están los padres informados si sus hijos tienen miedo a la atención dental?Evaluación cualitativa del componente promocional de un programa psicosocial en población escolar vulnerableEvaluación de la efectividad de la aplicación del Programa Educativo "Quiero mi boca siempre sana"Evaluación estadística del uso de edulcorantes alimentarios en una población de SantiagoEvolución de la prematurez y características sociodemográficas de la población materna en ChileFactores de riesgo asociados a prevalencia de caries en alumnos del Ejército de ChileHábitos alimentarios en escolares de distinto tipo de establecimientos educacionalesNivel de conocimientos de los habitantes de Loncoche sobre enfermedades parasitarias, IX, Región, Chile 2009Nutrición y condiciones socioeconómicas de escolares de la escuela Jesús María Sifontes, Los Teques, VenezuelaRelación entre dificultad para comprar cigarrillos, lugares de venta y curso en adolescente