Environmental Impact of Using Phlebiopsis gigantea in Stump Treatment Against Heterobasidion annosum sensu lato and Screening Root Endophytes to Identify Other Novel Control Agents

Scots pine (Pinus sylvestris) and Norway spruce (Picea abies) cover large areas in boreal regions with significant economic importance to Finnish forest industry. Approximately 15% of the spruce trees felled in Finland are rotten and thus commercially less valuable. The majority of this conifer wood decay is due to the root and butt rot pathogen Heterobasidion annosum sensu lato. Extensive logging of conifer forests has changed the environment into favouring this pathogen in stands where it originally has been rare. The saprotrophic fungus Phlebiopsis gigantea has for several years been used as a biocontrol agent against H. annosum s.l. in spruce and pine stumps. A major problem is that, although the effectiveness of P. gigantea as a biocontrol agent has empirically been shown, the long-term biological effect of this fungus on other decomposing wood microbiota has not been proven. The first objective of this thesis is to evaluate the impact of the only biocontrol agent used against root and butt rot fungus (H. annosum s.l.) on other resident microflora of Norway spruce stumps. An additional objective is to screen and identify other potentially novel bioagents that can be deployed for the biocontrol of the conifer pathogen. To find out whether the P. gigantea treatment impacts the overall diversity of other non-target stump microbes we used the 454- pyrosequencing approach. Samples were collected from forest sites previously pre-treated with P. gigantea either one, six or 13 years ago. Similarly samples were collected from untreated stumps within the same forest site over the same period of time. The results revealed that initial application of the biocontrol agent influenced the fungal species composition, but the overall fungal diversity was not affected and no statistical differences were observed between treated and non-treated stumps in the mycobiota. The biocontrol treatment significantly decreased the initial bacterial richness in the stumps, but the bacterial community gradually recovered and the negative effect of P. gigantea was attenuated. In parallel to the above studies, I further explored the potential of finding other novel biocontrol agents for use in managing the disease caused by the root rot pathogen Heterobasidion parviporum. This necessitated isolation studies of fungal root endophytes from forestry sites such as pristine mires and drained peatlands where the spread of H. annosum s.l. species have not been commonly reported. A total of 113 isolates of fungal root endophytes were obtained from non-mycorrhizal P. abies roots, which were assigned to 15 different operational taxonomic units (OTUs). Nineteen of the isolates (17%) inhibited the growth of the conifer root rot pathogen in vitro. From these, two isolates were further used to test the potential inhibitory effects during interaction, in vitro, with H. parviporum. Additionally, the metabolites secreted by the selected root endophytes were extracted and the inhibitory effects on these pathogenic fungi were assayed. The secreted metabolites were further chemically analysed using ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF/MS). These results give new information from the new possibilities to protect the valuable seedling roots from root rot. The results of the thesis provide new information to facilitate better management and protection of these forest sites from H. annosum s.l. as well as support the continued used of P. gigantea for stump pre-treatment in Finnish forests.Mänty (Pinus sylvestris) ja metsäkuusi (Picea abies) yhdessä muodostavat perustan Suomen metsäteollisuudelle. Etelä-Suomessa arviolta 15 20% päätehakkuissa kaadetuista kuusista ovat lahovikaisia. Tämän tyvilahon suurin aiheuttaja on juurikääpä Heterobasidion annosum sensu lato. Saprotrofista sientä, harmaaorvakkaa (Phlebiopsis gigantea), on pitkään käytetty biokontrollina juurikääpää vastaan kantokäsittelyissä. Harmaaorvakka on juurikääpää tehokkaampi puuaineksen kolonisoija, syrjäyttäen tuoreelle kannolle levitettynä juurikääpäsienen. Vaikka harmaaorvakan teho juurikääpää vastaan on todistettu empiirisesti, sen pitkäaikaista vaikutusta havupuiden kantojen muihin sieni- ja bakteerilajeihin ei tunneta vielä kovinkaan hyvin. Väitöskirjatyön tarkoituksena on tutkia juurikäävän torjuntaan käytettävän harmaaorvakan pitkäaikaisia vaikutuksia kuusikantojen sieni- ja bakteerilajeihin. Tätä varten näytteitä kerättiin harmaaorvakalla käsitellyiltä ja käsittelemättömiltä kannoilta yksi, kuusi ja 13 vuotta hakkuiden jälkeen eri koealoilta. Selvittääksemme biokontrollin vaikutuksen kantojen mikrobilajistoon käytimme 454-pyrosekvensointi menetelmää. Tulokset paljastivat, että vaikka harmaaorvakan lisäys kantoon ensimmäisen vuoden jälkeen vaikutti sienilajistoon, ero ei ollut tilastollisesti merkittävä. Bakteerilajistoon harmaaorvakan todettiin vaikuttavan vahingollisesti ensimmäisen vuoden jälkeen. Kuuden ja kolmentoista vuoden jälkeen ei negatiivisia vaikutuksia sieni- tai bakteerilajistoon enää raportoitu ja harmaaorvakka oli hävinnyt kannoista. Toinen tavoite väitöskirjassa on tutkia kuusen juurten edofyyttistä sienilajistoa eri koealoilla ja näiden sienten mahdollisuuksia toimia biokontrolleina juurikääpää vastaan. Juurikäävän ei ole todettu esiintyvän yleisesti suomailla, joten endofyyttisiä sieniä eristettiin mustikkakorvesta, mustikkaturvekankaalta ja mustikkatyypin kangasmetsästä. Eristetyt 113 sientä lajiteltiin viiteentoista taksonomisesti eri yksikköön. Eristetyistä sienistä 19 (17%) pystyi rajoittamaan juurikäävän kasvua in vitro. Jatkotutkimuksiin valittiin kaksi endofyyttistä sientä ja näiden sienten erittämien aineenvaihduntatuotteiden vaikutusta testattiin juurikääpään. Patogeenin kasvun estyminen in vitro johtui selvästi sienten aineenvaihduntatuotteista. Väitöskirjan tulokset tukevat harmaaorvakan jatkuvaa käyttöä eritoten Etelä- ja Länsi- Suomen kesäaikaisissa päätehakkuissa. Uusi informaatio kuusen juurten endofyyteistä mahdollistaa niiden soveltamisen biokontrolleiksi juurikääpää vastaan, erityisesti nuorten taimien juuristojen suojauksessa juurilahottajia vastaan

The dark septate endophyte Phialocephala sphaeroides confers growth fitness benefits and mitigates pathogenic effects of Heterobasidion on Norway spruce

Forest trees frequently interact with a diverse range of microorganisms including dark septate endophytes (DSEs) and fungal pathogens. Plant defense responses to either individual pathogens or endophytes have been widely studied, but very little is known on the effect of coinfection on host defenses. To study the impact of coinfection or tripartite interaction on plant growth and host defenses, Norway spruce (Picea abies (L.) Karst) seedlings were inoculated with a DSE Phialocephala sphaeroides or with a root pathogen Heterobasidion parviporum Niemela & Korhonen or coinfected with both fungi. The results showed that the DSE promoted the root growth of spruce seedlings. Control seedlings without any inoculum were subjected to sequencing and used as a baseline for identification of differentially expressed genes (DEGs). RNA-seq analysis of seedlings inoculated with P. sphaeroides, infected with H. parviporum or coinfected with both fungi resulted in a total of 5269 DEGs. The majority of DEGs were found in P. sphaeroides-inoculated seedlings. Lignin biosynthesis pathways were generally activated during fungal infections. The pattern was distinct with endophyte inoculation. The majority of the genes in the flavonoid biosynthesis pathway were generally suppressed during fungal infections. A specific transcriptional response to P. sphaeroides inoculation was the increased transcripts of genes involved in jasmonic acid biosynthesis, mitogen-activated protein kinases signaling pathway, plant hormone signal transduction and calcium-mediated signaling. This may have potentially contributed to promoting the root growth of seedlings. Although the coinfection suppressed the induction of numerous genes, no negative effect on the growth of the spruce seedlings occurred. We conclude that the subsequent H. parviporum infection triggered reprogramming of host metabolism. Conversely, the endophyte (P. sphaeroides), on the other hand, counteracted the negative effects of H. parviporum on the growth of the spruce seedlings.Peer reviewe

Forest Tree Microbiomes and Associated Fungal Endophytes: Functional Roles and Impact on Forest Health

Terrestrial plants including forest trees are generally known to live in close association with microbial organisms. The inherent features of this close association can be commensalism, parasitism or mutualism. The term “microbiota” has been used to describe this ecological community of plant-associated pathogenic, mutualistic, endophytic and commensal microorganisms. Many of these microbiota inhabiting forest trees could have a potential impact on the health of, and disease progression in, forest biomes. Comparatively, studies on forest tree microbiomes and their roles in mutualism and disease lag far behind parallel work on crop and human microbiome projects. Very recently, our understanding of plant and tree microbiomes has been enriched due to novel technological advances using metabarcoding, metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics approaches. In addition, the availability of massive DNA databases (e.g., NCBI (USA), EMBL (Europe), DDBJ (Japan), UNITE (Estonia)) as well as powerful computational and bioinformatics tools has helped to facilitate data mining by researchers across diverse disciplines. Available data demonstrate that plant phyllosphere bacterial communities are dominated by members of only a few phyla (Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes). In bulk forest soil, the dominant fungal group is Basidiomycota, whereas Ascomycota is the most prevalent group within plant tissues. The current challenge, however, is how to harness and link the acquired knowledge on microbiomes for translational forest management. Among tree-associated microorganisms, endophytic fungal biota are attracting a lot of attention for their beneficial health- and growth-promoting effects, and were preferentially discussed in this review

Forest Tree Microbiomes and Associated Fungal Endophytes: Functional Roles and Impact on Forest Health

Terrestrial plants including forest trees are generally known to live in close association with microbial organisms. The inherent features of this close association can be commensalism, parasitism or mutualism. The term “microbiota” has been used to describe this ecological community of plant-associated pathogenic, mutualistic, endophytic and commensal microorganisms. Many of these microbiota inhabiting forest trees could have a potential impact on the health of, and disease progression in, forest biomes. Comparatively, studies on forest tree microbiomes and their roles in mutualism and disease lag far behind parallel work on crop and human microbiome projects. Very recently, our understanding of plant and tree microbiomes has been enriched due to novel technological advances using metabarcoding, metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics approaches. In addition, the availability of massive DNA databases (e.g., NCBI (USA), EMBL (Europe), DDBJ (Japan), UNITE (Estonia)) as well as powerful computational and bioinformatics tools has helped to facilitate data mining by researchers across diverse disciplines. Available data demonstrate that plant phyllosphere bacterial communities are dominated by members of only a few phyla (Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes). In bulk forest soil, the dominant fungal group is Basidiomycota, whereas Ascomycota is the most prevalent group within plant tissues. The current challenge, however, is how to harness and link the acquired knowledge on microbiomes for translational forest management. Among tree-associated microorganisms, endophytic fungal biota are attracting a lot of attention for their beneficial health- and growth-promoting effects, and were preferentially discussed in this review

Diplodia tip blight pathogen’s virulence empowered through host switch

Increased drought combined with emerging pathogens poses an increased threat to forest health. This is attributable to the unpredictable behaviour of forest pathosystems, which can favour fungal pathogens over the host under persistent drought stress conditions. Diplodia sapinea (≡ Sphaeropsis sapinea) is one of the most severe pathogens in Scots pine (Pinus sylvestris) causing Diplodia tip blight (conifer blight) under certain environmental conditions. Recently, the fungus has also been isolated from non-conifer hosts, indicating that it has a broader host range than previously known. In this study we compared the impact of different levels of water availability on necrosis length caused by D. sapinea strains isolated as endophytes (eight strains isolated from asymptomatic Scots pine) and pathogens (five strains isolated from symptomatic Scots pine) and five strains isolated from symptomatic non-pine hosts. For all strains the decreased water availability increased the necrosis length in Scots pine shoots. The isolates from non-pine hosts caused the most severe reactions under all water availabilities. The results of the study indicate the likelihood that effects of climatic changes such as drought will drive D. sapinea damage in Scots pine-dominated forests and increase mortality rates in affected trees. Further, the higher necrosis in the Scots pines caused by strains that had performed a host switch are concerning with regard to future scenarios thus increasing infection pressure on Scots pine from unknown sources

Mycobiome analysis of asymptomatic and symptomatic Norway spruce trees naturally infected by the conifer pathogens Heterobasidion spp.

Plant microbiome plays an important role in maintaining the host fitness. Despite a significant progress in our understanding of the plant microbiome achieved in the recent years, very little is known about the effect of plant pathogens on composition of microbial communities associated with trees. In this study, we analysed the mycobiome of different anatomic parts of asymptomatic and symptomatic Norway spruce trees naturally infected by Heterobasidion spp. We also investigated the primary impact of the disease on the fungal communities, which are associated with Norway spruce trees. Our results demonstrate that the structure of fungal communities residing in the wood differed significantly among symptomatic and asymptomatic Heterobasidion-infected trees. However, no significant differences were found in the other anatomic regions of the trees. The results also show that not only each of individual tree tissues (wood, bark, needles and roots) harbours a unique fungal community, but also that symptomatic trees were more susceptible to co-infection by other wood-degrading fungi compared to the asymptomatic ones.Peer reviewe

Allele PaLAR3B in root rot resistance locus does not influence the infection pressure by Heterobasidion parviporum through root contacts

The most destructive root rot pathogen of Norway spruce (Picea abies) in Finland is Heterobasidion parviporum. After primary infection, this pathogen spreads from tree to tree through root contacts and eventually causes high levels of root and stem rot. Locus PaLAR3 has been associated with root rot resistance of Norway spruce, and higher resistance in Norway spruce against H. parviporum has been noted when trees have allele PaLAR3B instead of the more common PaLAR3A. In this study we tested if trees with homo- or heterozygous PaLAR3B allele can better resist the infection through root contacts. The study was established in 2018 in a site where spruce trees had grown at a dense spacing for 10 years. The 72 trees were cut down and a mixture of four H. parviporum strains was inoculated on the stumps. After 3 years, 459 trees surrounding the inoculated stumps were harvested and analysed. Based on the presence of conidiospores, forty percent (40%) of the trees were infected by H. parviporum. The homozygous PaLAR3B genotype was found only in 1% of the trees. There were no differences in infection rates between the genotypes AA and AB (or BB). Similarly, the distance from inoculated stump or the diameter of the tree did not influence the infection rate

Ilmastonmuutoksen ja sään ääri-ilmiöiden vaikutukset luontoon ja luonnonvaratalouteen : Synteesiraportti

Ilmastonmuutoksen vaikutukset koskevat kaikkia luonnonvarataloutemme sektoreita. Suomen ilmasto on lämmennyt merkittävästi tunnetun mittaushistorian aikana. Lämpenemisellä on merkittäviä vaikutuksia luontoon ja siitä riippuvaan talouteen. Merkittäviä tapahtuneita muutoksia ovat mm. kasvillisuusvyöhykkeiden siirtyminen pohjoisemmaksi, kasvukauden pidentyminen, vuosittaisen lämpösummakertymän kasvaminen sekä jää- ja lumipeitteisen ja routaisen ajan lyhentyminen. Lämpenemisen lisäksi ilmastonmuutos lisää sään ääri-ilmiöitä kuten kuivuus- ja sadejaksoja. Kuivuus vaikuttaa negatiivisesti mm. puiden kasvuun, lisää niiden alttiutta hyönteistuhoille ja sienitaudeille sekä kasvattaa metsäpalojen riskiä. Samalla se heikentää satotasoja pelloilla merkittävästi ja lisää kastelupainetta mm. vihannestuotannossa. Metsissä kuivuuden lisäksi vaikuttaa mm. roudattoman ja lumettoman ajan lisääntyminen. Puunkorjuu roudattomaan aikaan ei onnistu märillä kohteilla. Lumeton aika lisää metsäkoneiden aiheuttamia korjuuvaurioita, jotka toimivat tartunta-alustoina sienitaudeille. Roudattomassa maassa puut myös kaatuvat helpommin talven aikana. Lämpötilojen kohoaminen kasvattaa tuhohyönteiskantoja ja vie tuhoriskiä aiempaa pohjoisemmaksi. Puutavaran varastointi vaatii enemmän aktiivisuutta ja tarkkuutta, sillä puutavarapinot toimivat kesäaikaan tuhohyönteisten lisääntymisalustoina. Kuivuus kasvattaa tautipainetta myös taimitarhoilla sekä lisää tarvetta kastelulle. Maltillinen lämpeneminen ja pidentyvä kasvukausi kuitenkin lisäävät puuston kasvua ja edesauttavat jalojen lehtipuiden leviämistä pohjoisemmaksi. Vesistöissä lisääntyvät hellejaksot yhdistettynä rehevöitymisen aiheuttamaan hapen vähyyteen ovat riski luonnon kalakannoille ja kasvatettaville kaloille. Lisääntyvä sateisuus ja valunta aiheuttavat haitallisia vaikutuksia kutualueilla. Niitä voidaan vähentää kiinnittämällä huomiota valuma-alueiden kunnostamiseen, joka parantaa ravinteiden ja humuksen pidätyskykyä. Jääpeitteisyyden muutokset aiheuttavat vaikeuksia perinteiselle jäältä tapahtuvalle talvikalastukselle. Entistä tarkempi kalastuskauden aikainen säätely voi tulla tarpeeseen hellejaksojen aikana. Kalankasvatuksen teknologiset ratkaisut voivat auttaa ilmastonmuutokseen sopeutumisessa. Peltoviljely on altis vallitseville säille, joiden haitoilta suojautuminen edellyttää monipuolisten sopeutumistoimien käyttöönottoa. Kylvöt ovat aikaistuneet parilla viikolla, mikä ei kuitenkaan ole heijastunut korjuuaikoihin. Kasvukauden pidentyminen on mahdollistanut viljelykasvivalikoiman monipuolistamisen kuten myöhäisempien ja satoisampien lajikkeiden käyttöönoton. Ennusteet kasvukauden aikaisista sademäärän muutoksista vaihtelevat lisääntyvästä vähenevään sadantaan. Äärisäiden, erityisesti kuivuuden, haittoja voidaan kuitenkin vähentää ennakoivin ja pitkäjänteisyyttä edellyttävin viljelytoimin. Tällaisia toimia ovat muun muassa monipuolistuva ja alueellisesti laajeneva viljelykasvilajisto sekä maanpeite- ja välikasvien käyttö. Puutarhatuotannossa kasvien menestyminen Suomen talvessa paranee, sillä monivuotisten kasvien pakkasvaurioiden riski pienenee. Monivuotisten puutarhakasvien lajikkeiden menestymisvyöhykkeet siirtyvät pohjoisemmaksi. Samalla Suomessa menestyvien lajikkeiden määrä lisääntyy. Tuhohyönteisten, rikkakasvien, vieraslajien ja kasvitautien määrät voivat kasvaa. Kuivuusjaksot voivat lisätä kastelun tarvetta mm. avomaan vihannestuotannossa. Riista- ja metsälajistoon vaikuttavat mm. lumen määrään ja lumisen ajan pituus, routa, sateisuus, talvien ankaruus, jäiden sulamisajankohta sekä veden laatu. Valkoiseen suojaväriin vaihtavat lajit kärsivät lumen puutteesta, koska se tekee niistä helppoja ja näkyviä saaliseläimiä. Norpat ja hylkeet kärsivät huonoista jääolosuhteista, sillä niille olisi optimaalisinta synnyttää poikasensa jäälle. Yleisesti lajien välinen kilpailu voi lisääntyä, sillä eteläiset lajit, tulokaslajit ja vieraslajit lisääntyvät ja leviävät pohjoisemmaksi. Tämä raportti tiivistää tutkitun tiedon pohjalta tunnettuja ilmastonmuutoksen ja sään ääri-ilmiöiden vaikutuksia luontoomme ja luonnonvaratalouteemme. Tavoite on avata ilmiöitä ja niiden vaikutuksia helposti ymmärrettävässä muodossa, samalla tarjoten runsaasti taustalla olevaa tutkimuskirjallisuutta. Asiasanat: ilmastonmuutos, sopeutuminen, metsät, riista, vesiviljely, kalakannat, kuivuus, maatalous, puutarhatuotanto, sään ääri-ilmiöt, valintajalostu

Biocontrol Potential of Forest Tree Endophytes

Peer reviewe