Environmental Impact of Using Phlebiopsis gigantea in Stump Treatment Against Heterobasidion annosum sensu lato and Screening Root Endophytes to Identify Other Novel Control Agents

Abstract

Scots pine (Pinus sylvestris) and Norway spruce (Picea abies) cover large areas in boreal regions with significant economic importance to Finnish forest industry. Approximately 15% of the spruce trees felled in Finland are rotten and thus commercially less valuable. The majority of this conifer wood decay is due to the root and butt rot pathogen Heterobasidion annosum sensu lato. Extensive logging of conifer forests has changed the environment into favouring this pathogen in stands where it originally has been rare. The saprotrophic fungus Phlebiopsis gigantea has for several years been used as a biocontrol agent against H. annosum s.l. in spruce and pine stumps. A major problem is that, although the effectiveness of P. gigantea as a biocontrol agent has empirically been shown, the long-term biological effect of this fungus on other decomposing wood microbiota has not been proven. The first objective of this thesis is to evaluate the impact of the only biocontrol agent used against root and butt rot fungus (H. annosum s.l.) on other resident microflora of Norway spruce stumps. An additional objective is to screen and identify other potentially novel bioagents that can be deployed for the biocontrol of the conifer pathogen. To find out whether the P. gigantea treatment impacts the overall diversity of other non-target stump microbes we used the 454- pyrosequencing approach. Samples were collected from forest sites previously pre-treated with P. gigantea either one, six or 13 years ago. Similarly samples were collected from untreated stumps within the same forest site over the same period of time. The results revealed that initial application of the biocontrol agent influenced the fungal species composition, but the overall fungal diversity was not affected and no statistical differences were observed between treated and non-treated stumps in the mycobiota. The biocontrol treatment significantly decreased the initial bacterial richness in the stumps, but the bacterial community gradually recovered and the negative effect of P. gigantea was attenuated. In parallel to the above studies, I further explored the potential of finding other novel biocontrol agents for use in managing the disease caused by the root rot pathogen Heterobasidion parviporum. This necessitated isolation studies of fungal root endophytes from forestry sites such as pristine mires and drained peatlands where the spread of H. annosum s.l. species have not been commonly reported. A total of 113 isolates of fungal root endophytes were obtained from non-mycorrhizal P. abies roots, which were assigned to 15 different operational taxonomic units (OTUs). Nineteen of the isolates (17%) inhibited the growth of the conifer root rot pathogen in vitro. From these, two isolates were further used to test the potential inhibitory effects during interaction, in vitro, with H. parviporum. Additionally, the metabolites secreted by the selected root endophytes were extracted and the inhibitory effects on these pathogenic fungi were assayed. The secreted metabolites were further chemically analysed using ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF/MS). These results give new information from the new possibilities to protect the valuable seedling roots from root rot. The results of the thesis provide new information to facilitate better management and protection of these forest sites from H. annosum s.l. as well as support the continued used of P. gigantea for stump pre-treatment in Finnish forests.Mänty (Pinus sylvestris) ja metsäkuusi (Picea abies) yhdessä muodostavat perustan Suomen metsäteollisuudelle. Etelä-Suomessa arviolta 15 20% päätehakkuissa kaadetuista kuusista ovat lahovikaisia. Tämän tyvilahon suurin aiheuttaja on juurikääpä Heterobasidion annosum sensu lato. Saprotrofista sientä, harmaaorvakkaa (Phlebiopsis gigantea), on pitkään käytetty biokontrollina juurikääpää vastaan kantokäsittelyissä. Harmaaorvakka on juurikääpää tehokkaampi puuaineksen kolonisoija, syrjäyttäen tuoreelle kannolle levitettynä juurikääpäsienen. Vaikka harmaaorvakan teho juurikääpää vastaan on todistettu empiirisesti, sen pitkäaikaista vaikutusta havupuiden kantojen muihin sieni- ja bakteerilajeihin ei tunneta vielä kovinkaan hyvin. Väitöskirjatyön tarkoituksena on tutkia juurikäävän torjuntaan käytettävän harmaaorvakan pitkäaikaisia vaikutuksia kuusikantojen sieni- ja bakteerilajeihin. Tätä varten näytteitä kerättiin harmaaorvakalla käsitellyiltä ja käsittelemättömiltä kannoilta yksi, kuusi ja 13 vuotta hakkuiden jälkeen eri koealoilta. Selvittääksemme biokontrollin vaikutuksen kantojen mikrobilajistoon käytimme 454-pyrosekvensointi menetelmää. Tulokset paljastivat, että vaikka harmaaorvakan lisäys kantoon ensimmäisen vuoden jälkeen vaikutti sienilajistoon, ero ei ollut tilastollisesti merkittävä. Bakteerilajistoon harmaaorvakan todettiin vaikuttavan vahingollisesti ensimmäisen vuoden jälkeen. Kuuden ja kolmentoista vuoden jälkeen ei negatiivisia vaikutuksia sieni- tai bakteerilajistoon enää raportoitu ja harmaaorvakka oli hävinnyt kannoista. Toinen tavoite väitöskirjassa on tutkia kuusen juurten edofyyttistä sienilajistoa eri koealoilla ja näiden sienten mahdollisuuksia toimia biokontrolleina juurikääpää vastaan. Juurikäävän ei ole todettu esiintyvän yleisesti suomailla, joten endofyyttisiä sieniä eristettiin mustikkakorvesta, mustikkaturvekankaalta ja mustikkatyypin kangasmetsästä. Eristetyt 113 sientä lajiteltiin viiteentoista taksonomisesti eri yksikköön. Eristetyistä sienistä 19 (17%) pystyi rajoittamaan juurikäävän kasvua in vitro. Jatkotutkimuksiin valittiin kaksi endofyyttistä sientä ja näiden sienten erittämien aineenvaihduntatuotteiden vaikutusta testattiin juurikääpään. Patogeenin kasvun estyminen in vitro johtui selvästi sienten aineenvaihduntatuotteista. Väitöskirjan tulokset tukevat harmaaorvakan jatkuvaa käyttöä eritoten Etelä- ja Länsi- Suomen kesäaikaisissa päätehakkuissa. Uusi informaatio kuusen juurten endofyyteistä mahdollistaa niiden soveltamisen biokontrolleiksi juurikääpää vastaan, erityisesti nuorten taimien juuristojen suojauksessa juurilahottajia vastaan