Untersuchungen zur Interaktion des Alzheimer Demenz : assoziierten Proteins Presenilin 1 mit dem Cytoskelett

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Wechselwirkung des AD-assoziierten Proteins PS1 mit dem Cytoskelett in verschiedenen biochemischen und immuncytochemischen Modellen zu untersuchen. Auf diese Weise sollten Hinweise für das Verständnis der bisher nur in Grundzügen bekannten physiologischen Funktion von PS1 erhalten werden. Ausgehend vom Nachweis der Anreicherung endoproteolytischer PSI-Fragmente in Cytoskelett-Fraktionen aus Hirngewebe wurde die spezifische Assoziation des Proteins mit Mikrofilamenten, Mikrotubuli und Neurofilamenten untersucht. Alle durchgeführten biochemischen und immuncytochemischen Experimente zeigen übereinstimmend die spezifische Assoziation von PS1 mit Mikrofilamenten. So konnten PSI-Fragmente über zwei Depolymerisations/ Polymerisations-Zyklen zusammen mit Actin aus Rattenhirn aufgereinigt werden. Die spezifische Spaltung von Actin-Filamenten durch Gelsolin in cytoskelettreichen Fraktionen aus Hirngewebe führte zur Freisetzung kürzerer Filamente, die nach Zentrifugation zusammen mit PS1- Fragmenten im Überstand erschienen. In immuncytochemischen Färbungen kolokalisierte PS1 mit Actin-Filamenten in primären Gliazellen und der neuronalen Zelinie NT2. Eine vor kurzem veröffentlichte Arbeit zeigte außerdem die Kolokalisation von PS1 und Mikrofdamenten in primären Hippocampus-Neuronen. Die fehlende Kosedimentation von in-vitro translatiertem PS1 und Deletionskonstrukten von PS1 mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Actin-Filamenten, das Fehlen konservierter Actin-Bindungsmotive in der Aminosäuresequenz von PS1 sowie bekannte Interaktionen von PS1 mit Actin-bindenden Vertretern der Filamin- und Armadillo-Proteinfamilien lassen auf eine indirekte Assoziation von PS1 mit Mikrofdamenten schließen. Die vorliegende Arbeit konnte die Frage, welche Rolle Mikrotuli oder Neurofilamente bei der Cytoskelett-Assoziation von PS1 spielen, nicht abschließend Mären. PS1-Fragemente wurden im ersten, nicht jedoch im zweiten Depolymerisations/Polymerisations-Zyklus zusammen mit Tubulin aus Rattenhirn aufgereinigt. In dem gleichen Versuchsansatz kosedimentierte in-vitro translatiertes PS1 nicht mit Mikrotubuli. Immuncytochemische Färbungen zeigten dagegen die Kolokalisation von PS1 mit Mikrotubuli in primären Hippocampus-Neuronen, die auch von zwei aktuellen Arbeiten in primären Hippocampus-Neuronen und murinen Embryonen bestätigt wurde. Die spezifische Depolymerisation von Mikrotubuli in cytoskelettreichen Fraktionen war unter den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bedingungen nicht erfolgreich, so daß aus diesem Experiment keine Aussagen zur Assoziation von PS1 mit Mikrotubuli abgeleitet werden konnten. Es Iäßt sich die Hypothese aufstellen, daß sehr kleine PSI-haltige Vesikel über andere Proteine als PS1 mit Mikrotubuli verbunden sind, so daß PS1 mit Mikrotubuli scheinbar kolokalisiert ist. Hochauflösenden lichtmikroskopische bzw. elektronenmikroskopische Aufnahmen oder biochemische Versuche, die nicht zur Zerstörung der Vesikel durch Detergens führen, könnten für die Überprüfung dieser Hypothese herangezogen werden. In-vitro translatiertes PS1 sowie Deletionskonstrukte von PS1 kosedimentierten nicht mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Neurofilamenten, und in primären Hippocampus-Neuronen kolokalisierte PS1 nicht mit Neurofilamenten. Es wäre jedoch wünschenswert, die Experimente mit geeigneten Positiv-Kontrollen für die Kosedimentation und geeigneteren Antikörpern, die bei einem besseren Signal/Hintergrund-Verhältnis eine stärkere Vergrößerung der Immunfluoreszenzen erlauben, zu wiederholen. Im transgenen Tiermodell beeinträchtigten pathogene Mutationen von PS1 nicht, zumindest nicht quantitativ, die Fähigkeit von PS1, an Cytoskelett-Elemente zu binden. Es wäre jedoch möglich, daß es Unterschiede in der Cytoskelett-Assoziation von wt PS1 und PS1 mit pathogenen Mutationen gibt, die nur im Gewebe von FAD-Patienten zu detektieren sind, nicht aber im transgenen Tiermodell, da die bisher bekannten AD-Tiermodelle nicht alle Aspekte der Erkrankung reproduzieren. Die vorliegenden Ergebnisse können die Basis bilden für weitergehende Untersuchungen zur Funktion von PS1 und der Bedeutung von PS1-Cytoskelettinteraktionen in der Alzheimer Demenz. Aktuelle Arbeiten fokussieren dabei stark auf die Interaktion von PS1 mit Mikrofilament-bindenden Vertretern der Armadillo-Proteinfamilie, die bei Zell-Zell-Adhäsionsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Im Diskussionsteil wurde ausgeführt, daß aber, gerade im Hinblick auf die Neurodegeneration bei der Alzheimer Demenz, ein möglicher Einfluß von PS1 auf den schnellen axonalen Transport ein interessanter Ansatz für weitere Versuche sein kann

Multifunctional bakery bio-ingredients and nutritional supplements by fermentation of co-cultures of lactic acid bacteria and proprionibacteria

Oral presentatio

Novel bio-ingredient containing folate and B12 by fermentation of co-cultures of lactic acid bacteria and propionibacteria for use in bakery products

Oral presentationThere has been a dramatic increase in number and range of foods products which are fortified with chemically synthesized folic acid. However this practice exposes the population to higher levels of folic acid, and unmetabolized folic acid in the circulation may lead to long-term risks with adverse outcomes. Recent data have also emphasized the importance of physiological balance between folate and vitamin B12 intake due to their interdependent metabolisms. Innovative solutions targeting natural approaches and including both vitamins folate and B12 are therefore needed. In the present project a co-culture technology was used to simultaneously produce high yields of folate and vitamin B12 aimed to fortify foods with natural vitamins or as nutritional supplements (1). High folate producer Lactobacillus plantarum SM39 (5’-formyltetrahydrofolate (monoglutamate)) was co-cultured with vitamin B12-producer, Propionibacterium freudenreichii DF13 in a cereal-based medium, containing maltose and supplemented with yeast extract, and with addition of vitamin precursors, cobalt chloride (5 mg/L), 5,6-dimethylebenzimidazole (DMBI, 15 mg/L), and para-aminobenzoic acid (pABA, 10 mg/L). A two-step fermentation under optimal conditions, i.e. pH 6.1, temperature of 33°C, three days anaerobic/four days aerobic, led to high vitamin B12 and folate yields, of approximately 1100 ng/mL and 6000 ng/mL, respectively. Folate yields were about 10-fold higher than maximum values reported for natural fermentations and comparable to levels recently achieved using a genetically optimized strain. The fermented medium additionally contained primary metabolites (P. freudenreichii) propionate (ca. 7.5 g/l) and acetate (ca. 4.5 g/l) which have antifungal activity in bread, but no residual sugars and lactic acid (L. plantarum) were detected by HPLC. The controlled addition of precursors offers the possibility to produce a vitamin supplement with a suitable balance of folate and vitamin B12. The bio-ingredient in liquid form was tested in Semmeli breads (Swiss dinner rolls) to assess baking stability and effects on product quality. Dough was enriched with the vitamin fermentate aiming at 25 % RDA (Switzerland). Concentrations of folate and vitamin B12 were determined by microbiological assays in dough, partially- and fully-baked breads, and during storage at 8°C for dough and partially-baked (up to 28 days) and at 25°C for fully-baked breads (one week). Vitamin concentrations slightly increased during dough leavening (10-26 %). In dough supplemented with the ingredient, folate losses during baking were ca 40%, of which a large percentage was endogenous-folate loss, as shown by control breads (70% losse of folate). Vitamin B12 losses were ca 25% . Both vitamins showed good stability in all bread stages during storage. Some quality changes were observed, which would need to be addressed by formulation or process changes. This co-culture technology and vitamin bio-ingredient have high potential for natural fortification of foods, as well as applications as vitamin supplements

Development of multifunctional bakery bio-ingredients containing two important vitamins, folate and B12

Oral presentationBackground and Objectives: Microorganisms and their metabolites produced by biofermentations offer interesting benefits for food applications, e.g. production of specific vitamins; biopreservation and reduction of E-numbers, and improved texture of foods. Two problematic vitamins in nutrition are folate and B12, especially among women of child-bearing age, the aging population and strict vegetarians. This study aimed to develop new, natural sources of these important vitamins as well as other functional substances for adding value to bakery products. Methods: A co-culture technology (a) using strains of Lactobacillus plantarum and Propionibacterium freudenreichii selected for complementary carbon metabolism and high production of folate and Vitamin B12, respectively, was used to produce these vitamins along with anti-microbial compounds, mainly organic acids (propionic, acetic acids and others). The resulting mixture of multifunctional (MF) bio-ingredients was tested in Semmeli breads to assess stability and effects on product quality. Dough, partly- and fully-baked Semmeli were enriched with MF bio-ingredient at 0.1% or 0.2% equivalent propionate, levels shown to exert strong anti-microbial activity in previous work. Results: The MF bio-ingredient contained vitamer 5-formyltetrahydrofolate, known to be metabolically active and shown in baking tests to have higher stability (ca 60% recovery) than endogenous folate (35% recovery) derived from flour. Production of liquid MF ingredient in cereal-based medium using optimal conditions led to levels of folate and B12 as high as ca 6000 ng/ml, and 1000 ng/ml, respectively. Most bread-making and final quality determinations were acceptable for industry applications, as shown by physico-chemical, texture and sensory analyses. Conclusions: This co-culture technology and MF bio-ingredients have good potential for natural food fortification, allowing to reach or exceed vitamin levels required for EU authorized health claims. In addition to bringing innovation to the baking sector, it represents a new source for developing natural food supplements

Membrane fusion mediated by non-covalent binding of re-engineered cholera toxin assemblies to glycolipids

Membrane fusion is essential for the transport of macromolecules and viruses across membranes. While glycan-binding proteins (lectins) often initiate cellular adhesion, subsequent fusion events require additional protein machinery. No mechanism for membrane fusion arising from simply a protein binding to membrane glycolipids has been described thus far. Herein we report that a biotinylated protein derived from cholera toxin, becomes a fusogenic lectin upon crosslinking with streptavidin. This novel reengineered protein brings about hemifusion and fusion of vesicles as demonstrated by mixing of fluorescently labelled lipids between vesicles as well as content mixing of liposomes filled with fluorescently labelled dextran. Exclusion of the complex at vesicle-vesicle interfaces could also be observed indicating the formation of hemifusion diaphragms. We propose that negative membrane curvature, caused by binding of the cholera toxin to the membrane surface, induces formation of a fusion stalk as a result of high bending energies building up between multiple inverted membrane dimples aligned on opposing membranes at the vesicle-vesicle interface. Discovery of this fusogenic lectin complex demonstrates that new emergent properties can arise from simple changes in protein architecture and provides insights towards new mechanisms of lipid-driven fusio