Towards structural models for the Ebola UTR regions using experimental SHAPE probing data

National audienceNext-Generation Sequencing (NGS) technologies have opened new perspectives to refine the process of predicting the secondary structure(s) of structured non-coding RNAs. Herein, we describe an integrated modeling strategy, based on the SHAPE chemistry, to infer structural insight from deep se-quencing data. Our approach is based on a pseudo-energy minimization, incorporating additional information from evolutionary data (compensatory mutations) and SHAPE experiments (reactivity scores) within an iterative procedure. Preliminary results reveal conserved and stable structures within UTRs of the Ebola Genome, that are both thermodynamically-stable and highly supported by SHAPE accessibility analysis

Functional and Structural Analysis of the Internal Ribosome Entry Site Present in the mRNA of Natural Variants of the HIV-1

The 5′untranslated regions (UTR) of the full length mRNA of the HIV-1 proviral clones pNL4.3 and pLAI, harbor an internal ribosomal entry site (IRES). In this study we extend this finding by demonstrating that the mRNA 5′UTRs of natural variants of HIV-1 also exhibit IRES-activity. Cap-independent translational activity was demonstrated using bicistronic mRNAs in HeLa cells and in Xenopus laevis oocytes. The possibility that expression of the downstream cistron in these constructs was due to alternative splicing or to cryptic promoter activity was ruled out. The HIV-1 variants exhibited significant 5′UTR nucleotide diversity with respect to the control sequence recovered from pNL4.3. Interestingly, translational activity from the 5′UTR of some of the HIV-1 variants was enhanced relative to that observed for the 5′UTR of pNL4.3. In an attempt to explain these findings we probed the secondary structure of the variant HIV-1 5′UTRs using enzymatic and chemical approaches. Yet subsequent structural analyses did not reveal significant variations when compared to the pNL4.3-5′UTR. Thus, the increased IRES-activity observed for some of the HIV-1 variants cannot be ascribed to a specific structural modification. A model to explain these findings is proposed

A conserved structure within the HIV gag open reading frame that controls translation initiation directly recruits the 40S subunit and eIF3

Translation initiation on HIV genomic RNA relies on both cap and Internal Ribosome Entry Site (IRES) dependant mechanisms that are regulated throughout the cell cycle. During a unique phenomenon, the virus recruits initiation complexes through RNA structures located within Gag coding sequence, downstream of the initiation codon. We analyzed initiation complexes paused on the HIV-2 gag IRES and revealed that they contain all the canonical initiation factors except eIF4E and eIF1. We report that eIF3 and the small ribosomal subunit bind HIV RNA within gag open reading frame. We thus propose a novel two step model whereby the initial event is the formation of a ternary eIF3/40S/IRES complex. In a second step, dependent on most of the canonical initiation factors, the complex is rearranged to transfer the ribosome on the initiation codons. The absolute requirement of this large structure for HIV translation defines a new function for a coding region. Moreover, the level of information compaction within this viral genome reveals an additional level of evolutionary constraint on the coding sequence. The conservation of this IRES and its properties in rapidly evolving viruses suggest an important role in the virus life cycle and highlight an attractive new therapeutic target

A new type of IRES within gag coding region recruits three initiation complexes on HIV-2 genomic RNA

Genomic RNA of primate lentiviruses serves both as an mRNA that encodes Gag and Gag-Pol polyproteins and as a propagated genome. Translation of this RNA is initiated by standard cap dependant mechanism or by internal entry of the ribosome. Two regions of the genomic RNA are able to attract initiation complexes, the 5′ untranslated region and the gag coding region itself. Relying on probing data and a phylogenetic study, we have modelled the secondary structure of HIV-1, HIV-2 and SIVMac coding region. This approach brings to light conserved secondary-structure elements that were shown by mutations to be required for internal entry of the ribosome. No structural homologies with other described viral or cellular IRES can be identified and lentiviral IRESes show many peculiar properties. Most notably, the IRES present in HIV-2 gag coding region is endowed with the unique ability to recruit up to three initiation complexes on a single RNA molecule. The structural and functional properties of gag coding sequence define a new type of IRES. Although its precise role is unknown, the conservation of the IRES among fast evolving lentiviruses suggests an important physiological role

RNA secondary structure of the feline immunodeficiency virus 5′UTR and Gag coding region

The 5′ untranslated region (5′UTR) of lentiviral genomic RNA is highly structured, and is the site of multiple RNA–RNA and RNA–protein interactions throughout the viral life cycle. The 5′UTR plays a critical role during transcription, translational regulation, genome dimerization, reverse transcription priming and encapsidation. The 5′UTR structures of human lentiviruses have been extensively studied, yet the respective role and conformation of each domain is still controversial. To gain insight into the structure-function relationship of lentiviral 5′UTRs, we modelled the RNA structure of the feline immunodeficiency virus (FIV), a virus that is evolutionarily distant from the primate viruses. Through combined chemical and enzymatic structure probing and a thorough phylogenetic study, we establish a model for the secondary structure of the 5′UTR and Gag coding region. This work highlights properties common to all lentiviruses, like the primer binding site structure and the presence of a stable stem-loop at the 5′ extremity. We find that FIV has also evolved specific features, including a long stem loop overlapping the end of the 5′UTR and the beginning of the coding region. In addition, we observed footprints of Gag protein on each side of the initiation codon, this sheds light on the role of the sequences required for encapsidation

Mécanisme moléculaire de l'initiation de la traduction des lentivirus (rôle des structures de la région codante et de la région 5' non traduite)

La traduction d un messager eucaryote est initiée par la liaison d un complexe ribosomique 43S sur la coiffe située à l extrémité 5 de l ARN. Puis, ce complexe migre jusqu au codon initiateur où un ribosome fonctionnel est assemblé. Lors d un mécanisme alternatif appelé IRES, la 5 UTR attire directement ou indirectement la sous unité 40S du ribosome sur ou à proximité du codon initiateur. La traduction de l ARN génomique d HIV-2 conduit à la synthèse de la polyprotéine Gag qui est clivée en trois protéines de structure lors de la maturation virale. Trois isoformes de la protéine Gag sont produites par IRES. Etonnamment, la phase codante joue le rôle de site d entrée interne des ribosomes. La 5 UTR inhibe la traduction de gag. Des structures des régions codantes d HIV-1, HIV-2 et SIV ont été modélisées et nous avons pu définir 4 domaines structuraux conservés chez les lentivirus de primates. Par mutations, nous avons mis en évidence l importance d un appariement P2, et de deux domaines P3 et P4. Parallèlement, la 5 UTR interfère avec cette activité IRES. Nous avons défini l importance d une séquence de 27 nucléotides localisés dans la région du PBS. Cette séquence est impliquée dans la dimérisation et dans l initiation de la transcription inverse de l ARN génomique. Le domaine du PBS interagit avec la région codante d HIV-2. Ensuite, nous avons étendu nos travaux à l étude d un autre lentivirus beaucoup moins décrit : FIV, et nous avons modélisé la structure de la 5 UTR et de la phase codante de ce virus, qui ont toutes deux une activité IRES. Les sites d interaction de la poly protéine Gag avec son ARN messager ont également été définis.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Etude de la fonction d'ARN structurés (recherche d'un ribozyme de fonction inédite et initiation de la traduction de l'ARN génomique d'HIV-2)

Dans le but d'étudier le rôle et l'évolution des enzymes ARN, nous cherchons à substituer une enzyme protéique, la S-Adénosyl-Méthionine synthétase par un ARN catalytique. L'originalité de cette démarche impose que l'enzyme agisse en trans par rapport à ces deux substrats, or les techniques de sélection in vitro classiques permettent d'isoler des catalyseurs agissant exclusivement en cis. Les premières étapes de ce projet ont été réalisées : la sélection et la caractérisation de motifs ARN liant l'ATP, l'introduction de ces motifs dans une banque combinatoire pour la sélection du ribozyme et la fonctionalisation de l'extrémité d'un ARN pour donner une indépendance structurale à l'ATP en le liant à la librairie au moyen d'un linker flexible.La traduction d'un messager eucaryote est initiée par la liaison d'un complexe ribosomal 43S sur la coiffe située à l'extrémité 5' de l'ARN. Ce complexe migre ensuite jusqu'au codon initiateur. Alternativement, la 5'UTR de certains ARN attire la sous unité 40S du ribosome grâce à un site d'entrée interne des ribosomes (IRES). L'ARN génomique d'HIV2 code la polyprotéine Gag. En collaboration avec l'équipe de T.Ohlmann (U412 INSERM), nous avons découvert que trois isoformes de Gag sont produites par entrée interne des ribosomes. De manière étonnante, L'IRES est situé dans la phase codante, c'est à dire en aval du premier codon d'initiation. Plus surprenant encore, il est possible de traduire un gène gag débutant directement par l'AUG initiateur alors que la traduction d'un gène classique nécessite au moins 8 nucléotides en amont du codon d'initiation. L'ensemble de ces résultats peuvent être étendu à deux autres lentivirus, SIV et HIV1. Ces propriétés reposent sur la structure adoptée par les 450 premiers nucléotides de la phase codante. Nous avons étudié le mécanisme moléculaire de l'entrée interne des ribosomes sur ces ARN par une combinaison d'approches; mutagenèse dirigée, essais in vivo, et analyse des complexes ribosomaux.The purpose of my first project was to evaluate the role of active RNA during evolution and in modern genomes and the plausibility to have implication for the use of RNA as therapeutic agents. In order to substitute in vivo metabolic enzymes by a catalytic RNA, we first need to isolate a ribozyme by in vitro selection. I have resolved several technical difficulties and provided the laboratory with all the tools necessary to start the real process. The second project was to study the translation initiation of HIV2 genomic RNA. We showed that the HIV2 genomic RNA encodes to the full length Gag p57 and two, yet undescribed, shorter isoforms. The synthesis of these proteins is driven by internal ribosome entry site entirely located in the coding region. Gag p57 is produced by a novel mechanism of the ribosome recruitment requires structural element located downstream the start codon (Herbreteau et al. 2005).ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Etude des mécanismes moléculaires de l'initiation de la traduction de l'ARN génomique du VIH-1

L ARN génomique du virus de l immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est multifonctionnel et suit au moins deux destins. Soit il est traduit par la machinerie traductionnelle de l hôte donnant naissance aux polyprotéines Gag et Gag-pol, soit il se dimérise et est encapsidé dans les virions en tant que génome viral. Les travaux du laboratoire visent à identifier les mécanismes moléculaires de la traduction de l ARN génomique et de sa dimérisation, ainsi que les déterminants gouvernant la balance entre ces deux phénomènes. La traduction de l ARN génomique viral peut être initiée de trois façons. Selon le mécanisme canonique nécessitant la présence d une coiffe à l extrémité 5 de l ARN, et grâce à deux sites d initiation par entrée interne des ribosomes (IRES). Un IRES a été mis en évidence dans la 5 UTR, dont l activité est stimulée lors en phase G2/M du cycle cellulaire uniquement. Un second IRES a été découvert dans la région codante de gag. Il est capable de lier directement la petite sous-unité ribosome et le facteur d initiation eIF3, et permet l initiation à partir de deux codons AUG situés dans la même phase de lecture, conduisant à la synthèse d une isoforme additionnelle de Gag. Mon projet de thèse a consisté en l étude de l influence de la structure secondaire sur la traduction et la dimérisation. Dans un premier temps, j ai mis en place au laboratoire une nouvelle technique de sondage de structure, appelée SHAPE , développée par le laboratoire de K. Weeks. Le SHAPE nous permet désormais de sonder rapidement la structure secondaire de nombreux ARN, et notamment de tester en routine l effet de mutations sur la structure secondaire. Cette technique a permis d étudier la structure secondaire de la 5 UTR dans différentes conditions. Nous avons ainsi identifié une signature de la conformation monomère de la 5 UTR, et découvert un nouvel élément impliqué dans la dimérisation in vitro. Par ailleurs, nous avons montré que des extraits de cellules Hela synchronisées en phase G2/M du cycle cellulaire stimulent l activité de l IRES de la 5 UTR et modifient le profil de réactivité de cette région, traduisant probablement une réorganisation structurale induite par le recrutement de protéines cellulaires. Une autre partie de mon projet de thèse a concerné l étude de l IRES de la région codante de gag, Des délétions progressives de l IRES, à partir des extrémités 5 et 3 ont mis en évidence l existence de deux sites de liaison distincts au ribosome, localisés à proximité de chacun des deux codons d initiation. La délétion de chaque site a permis de confirmer le rôle de la liaison directe au ribosome dans la traduction de gag. L ensemble de ces éléments nous permet de proposer un modèle moléculaire conduisant à la formation des complexes d initiation sur chaque codon AUG. Par ailleurs, nos résultats suggèrent qu une interaction longue-distance entre la boucle PolyA et la région codante de gag régule de la traduction de l ARN génomique. Un tel mécanisme pourrait permettre de réguler l efficacité de traduction du gène gag, voire du ratio entre les deux isoformes au cours du cycle réplicatif.Primate lentiviruses genomic RNA can serve both as an mRNA that encodes for Gag and Gag-Pol polyproteins and as a propagated genome. We previously reported the presence of an IRES activity embedded within Gag coding region itself that drives the production of several isoforms of the Gag polyprotein and that is conserved in HIV-1, HIV-2 and SIVmac. In addition, in vitro reconstitution experiments revealed that the initial step of initiation complex formation is the recruitment of the 40S ribosomal subunit and eIF3. The structural and functional conservation amongst lentiviruses indicates that those properties are important for the virus cycle. In order to define the RNA structural determinants responsible for the formation of IRES/eIF3/40S ternary complex, we have been following functional and biochemical approaches in parallel. Our results indicate that 2 distinct binding sites for the ribosome are present close to the 2 AUG codons used as initiation site for the translation. Further biochemical analyses have shown that 2 ribosomes can be recruited by the same RNA molecule. In order to determine the functional role of the IRES activity on gag translation, we assayed in vitro the translation efficiency of mutants unable to recruit the ribosome. In parallel, we have been following a drug screening strategy to identify small molecules that would inhibit the ribosome recruitment. This approach could pave the way to the definition of the IRESgag as a new therapeutic target, and to the identification of new drugs.PARIS5-Bibliotheque electronique (751069902) / SudocPARIS-BIUM-Bib. électronique (751069903) / SudocSudocFranceF

Selection and evolution of NTP-specific aptamers

ATP occupies a central position in biology, for it is both an elementary building block of RNA and the most widely used cofactor in all living organisms. For this reason, it has been a recurrent target for in vitro molecular evolution techniques. The exploration of ATP-binding motifs constitutes both an important step in investigating the plausibility of the ‘RNA world’ hypothesis and a central starting point for the development of new enzymes. To date, only two RNA motifs that bind ATP have been characterized. The first one is targeted to the adenosine moiety, while the second one recognizes the ‘Hoogsteen’ face of the base. To isolate aptamers that bind ATP in different orientations, we selected RNAs on an affinity resin that presents ATP in three different orientations. We obtained five new motifs that were characterized and subsequently submitted to a secondary selection protocol designed to isolate aptamers specific for cordycepin. Interestingly, all the ATP-binding motifs selected specifically recognize the sugar-phosphate backbone region of the nucleotides. Three of the aptamers show some selectivity for adenine derivatives, while the remainder recognize any of the four nucleotides with similar efficiency. The characteristics of these aptamers are discussed along with implications for in vitro molecular evolution