Etude de la fonction d'ARN structurés (recherche d'un ribozyme de fonction inédite et initiation de la traduction de l'ARN génomique d'HIV-2)

Abstract

Dans le but d'étudier le rôle et l'évolution des enzymes ARN, nous cherchons à substituer une enzyme protéique, la S-Adénosyl-Méthionine synthétase par un ARN catalytique. L'originalité de cette démarche impose que l'enzyme agisse en trans par rapport à ces deux substrats, or les techniques de sélection in vitro classiques permettent d'isoler des catalyseurs agissant exclusivement en cis. Les premières étapes de ce projet ont été réalisées : la sélection et la caractérisation de motifs ARN liant l'ATP, l'introduction de ces motifs dans une banque combinatoire pour la sélection du ribozyme et la fonctionalisation de l'extrémité d'un ARN pour donner une indépendance structurale à l'ATP en le liant à la librairie au moyen d'un linker flexible.La traduction d'un messager eucaryote est initiée par la liaison d'un complexe ribosomal 43S sur la coiffe située à l'extrémité 5' de l'ARN. Ce complexe migre ensuite jusqu'au codon initiateur. Alternativement, la 5'UTR de certains ARN attire la sous unité 40S du ribosome grâce à un site d'entrée interne des ribosomes (IRES). L'ARN génomique d'HIV2 code la polyprotéine Gag. En collaboration avec l'équipe de T.Ohlmann (U412 INSERM), nous avons découvert que trois isoformes de Gag sont produites par entrée interne des ribosomes. De manière étonnante, L'IRES est situé dans la phase codante, c'est à dire en aval du premier codon d'initiation. Plus surprenant encore, il est possible de traduire un gène gag débutant directement par l'AUG initiateur alors que la traduction d'un gène classique nécessite au moins 8 nucléotides en amont du codon d'initiation. L'ensemble de ces résultats peuvent être étendu à deux autres lentivirus, SIV et HIV1. Ces propriétés reposent sur la structure adoptée par les 450 premiers nucléotides de la phase codante. Nous avons étudié le mécanisme moléculaire de l'entrée interne des ribosomes sur ces ARN par une combinaison d'approches; mutagenèse dirigée, essais in vivo, et analyse des complexes ribosomaux.The purpose of my first project was to evaluate the role of active RNA during evolution and in modern genomes and the plausibility to have implication for the use of RNA as therapeutic agents. In order to substitute in vivo metabolic enzymes by a catalytic RNA, we first need to isolate a ribozyme by in vitro selection. I have resolved several technical difficulties and provided the laboratory with all the tools necessary to start the real process. The second project was to study the translation initiation of HIV2 genomic RNA. We showed that the HIV2 genomic RNA encodes to the full length Gag p57 and two, yet undescribed, shorter isoforms. The synthesis of these proteins is driven by internal ribosome entry site entirely located in the coding region. Gag p57 is produced by a novel mechanism of the ribosome recruitment requires structural element located downstream the start codon (Herbreteau et al. 2005).ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF