Deciphering the structure of CAD: Structural and Functional Characterization of the Human Aspartate Transcarbamoylase Domain

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 28-10-2016Aspartate transcarbamoylase (ATCase) catalyzes the synthesis of N-carbamoyl-L-aspartate from carbamoyl phosphate and aspartate in the second step of the de novo biosynthesis of pyrimidines. In prokaryotes and plants, the first three activities of the pathway, namely carbamoyl phosphate synthetase (CPSase), ATCase and dihydroorotase (DHOase), are encoded as distinct proteins that function independently or in non-covalent association. In turn, in animals, CPSase, ATCase and DHOase are part of a 243 kDa multifunctional polypeptide named CAD whose up-regulation is essential for normal and tumor cell proliferation. Although the structures of numerous prokaryotic ATCases have been determined, there is no structural information about any eukaryotic ATCase. In fact, the only detailed structural information about CAD is that it self-assembles through its ATCase domain forming hexameric particles of 1.5 MDa. In this study, we report the cloning, expression and purification of the ATCase domain of human CAD. The recombinant protein, expressed in bacteria and purified with good yields, forms homotrimers in solution. Crystallization experiments, both in the absence and presence of the inhibitor PALA, yielded small crystals that diffracted X-rays to 2.1 Å resolution using synchrotron radiation. We have determined the structure of the human ATCase domain, the first example of a eukaryotic ATCase, confirming the overall similarity with bacterial homologues. Surprisingly, the enzymatic and biochemical characterization of human ATCase showed that this domain exhibits cooperativity effects that reduce the affinity for the anti-tumoral drug PALA. These results were unexpected since the prokaryotic ATCase catalytic trimers lack cooperativity between active sites. Combining structural, mutagenic and biochemical analysis we identified key structural elements in human ATCase for the necessary regulation and transmission of conformational changes leading to cooperativity between subunits. Mutation of one of these elements, the active site residue R2024, was recently found to cause the first non-lethal CAD-deficit. We reproduced this mutation in the recombinant human ATCase domain and measured its effect. Our data suggest that this arginine is part of a molecular switch that regulates the conformational equilibrium between low and high affinity states of the subunits for the ligands. To further understand the role of ATCase trimers in the assembly of CAD particles, we produced a bifunctional construct harbouring the DHOase and ATCase domains of human CAD together with the 91 amino acid interlinking sequence. We demonstrated that this construct assembles into hexamers in solution and that site-specific mutations preventing either the dimerization of DHOase or the trimerization of ATCase, results in DHOase-ATCase trimers and dimers respectively. These results indicate that the ATCase and DHOase domains form the structural core of CAD particles.La aspartato transcarbamilasa (ATCasa) cataliza la síntesis de N-carbamil-L-aspartato a partir de carbamil fosfato y aspartato en el segundo paso de la síntesis de novo de pirimidinas. En procariotas y en plantas, las primeras tres actividades de esta ruta, llamadas carbamil fosfato sintetasa (CPSasa), ATCasa y dihidroorotasa (DHOasa), están codificadas como proteínas que funcionan de forma independiente o asociadas de forma no covalente. En cambio en animales CPSasa, ATCasa y DHOasa son parte de un polipéptido multifuncional de 243 kDa llamado CAD, cuya activación es esencial para la proliferación de células normales y tumorales. Aunque se conoce la estructura de numerosas ATCasas procariotas, la única información estructural detallada sobre CAD es que se auto-ensambla a través de su dominio ATCasa formando partículas hexaméricas de 1.5 MDa. En este estudio describimos la clonación, expresión y purificación del dominio ATCasa de CAD humana. La proteína recombinante, expresada en bacterias y purificada con buen rendimiento, forma homo-trímeros en solución. Los experimentos de cristalización, tanto en ausencia como en presencia del inhibidor PALA, produjeron cristales que difractan los rayos X a una resolución de 2.1 Å usando radiación de sincrotrón. Hemos determinado la estructura del dominio ATCasa humano, siendo la primera estructura de una ATCasa eucariota, confirmando la similitud general con los homólogos bacterianos. Sorprendentemente, la caracterización enzimática y bioquímica de la ATCasa humana mostró que este dominio exhibe propiedades cooperativas que reducen la afinidad por el compuesto anti-tumoral PALA. Combinando el análisis estructural, mutagénico y bioquímico hemos identificado elementos estructurales claves para la transmisión de cambios conformacionales que permiten la cooperatividad entre subunidades. La mutación de uno de estos elementos, el residuo del centro activo R2024, se ha descrito recientemente como la causa del primer déficit no letal de CAD. Hemos reproducido esta mutación en la ATCasa humana recombinante y medido su efecto. Nuestros datos sugieren que esta arginina es parte de un interruptor molecular que regula el equilibrio conformacional entre estados de baja y alta afinidad de las subunidades por los ligandos. Para comprender mejor el papel de los trímeros de ATCasa en la arquitectura de CAD, produjimos una construcción bifuncional que contiene los dominios DHOasa y ATCasa humanos. Hemos demostrado que esta construcción forma hexámeros en solución y que mutaciones específicas que previenen la dimerización de los dominios DHOasa o la trimerización de la ATCasa resultan respectivamente en la formación de trímeros o dímeros de DHOasa-ATCasa. Estos resultados prueban que los dominios ATCasa y DHOasa forman el esqueleto central de las partículas de CAD

Territorios y energías renovables. proyecto de investigación ?sostenibilidad territorial del modelo energético bajo en carbono (terryer)?

Resumen. La alarma climática que acecha actualmente al planeta, así como la preocupación por el agotamiento de los recursos fósiles, han irrumpido con fuerza en el panorama social, político y económico a escala mundial. Esto ha puesto en evidencia la necesidad de una transición hacia un modelo energético bajo en carbono, y para el que las energías renovables se han convertido en la alternativa más viable. Ante este escenario de transición energética, el proyecto de Investigación TERRYER se presenta como una herramienta de refuerzo del compromiso social para con la energía limpia, segura, sostenible y eficiente, a través de la participación activa de la población en la implantación de las energías renovables. A través de un equipo multidisciplinar, basado en los pilares de la comunicación, la transparencia y la inclusión, este proyecto persigue transformar el alcance del conocimiento científico sobre la implantación territorial sostenible de las energías renovables.   Palabras clave: energía renovable, sostenibilidad, paisaje, territorio, transición energética

Livestock or Conservation? Characterization of the Environmental Conflict in the Protective Forest Reserve “El Malmo” (Tunja-Boyacá, Colombia)

La Reserva Forestal Protectora El Malmo es fuente de pugna entre las autoridades ambientales y los habitantes de la vereda Barón Germania (Tunja, Boyacá, Colombia), pues esta encuentra en un paisaje rural dominado por actividades agropecuarias que están en contravía con el objetivo de conservación del área protegida. El Plan de Manejo de la Reserva, tras cuatro décadas de declaración, no ha sido adoptado y la Corporación Autónoma Regional de Boyacá no ha definido las zonas donde las actividades económicas rurales están prohibidas, generando desconfianza y temor, en razón de las acciones correctivas y policivas por parte de la autoridad ambiental. En esta investigación se realiza una caracterización del conflicto ambiental en el área de estudio que expone actores y dimensiones. Además, se hace énfasis en la ausencia de mecanismos de participación ciudadana y de acciones de resolución mediante el desarrollo conjunto de la zonificación en cuanto a restricciones de uso de los recursos naturales existentes en la reserva.“El Malmo” Protective Forest Reserve is a source of conflict between environmental authorities and the inhabitants of the Barón Germania settlement (Tunja, Boyacá, Colombia), as it is located in a rural landscape ruled by agricultural activities that go against the conservation purposes of the protected area. Although a reserve management plan for this area was enacted four decades ago, it has not been adopted to this date. Besides, Boyacá regional environmental authority (Corpoboyacá) has not defined the areas where rural economic activities are prohibited, generating distrust and fear, due to the corrective actions deployed. For these reasons, this research presents a characterization of the environmental conflict in the study area that exposes actors and dimensions, emphasizing the absence of citizen participation mechanisms and resolution actions by jointly developing the zoning in terms of restrictions to the use of existing natural resources in the reserve

Structural basis for the inactivation of cytosolic DNA sensing by the vaccinia virus

Detection of cytosolic DNA is a central element of the innate immunity system against viral infection. The Ku heterodimer, a component of the NHEJ pathway of DNA repair in the nucleus, functions as DNA sensor that detects dsDNA of viruses that replicate in the cytoplasm. Vaccinia virus expresses two proteins, C4 and C16, that inactivate DNA sensing and enhance virulence. The structural basis for this is unknown. Here we determine the structure of the C16 – Ku complex using cryoEM. Ku binds dsDNA by a preformed ring but C16 sterically blocks this access route, abrogating binding to a dsDNA end and its insertion into DNA-PK, thereby averting signalling into the downstream innate immunity system. C4 replicates these activities using a domain with 54% identity to C16. Our results reveal how vaccinia virus subverts the capacity of Ku to recognize viral DNA

Nuevos escenarios y contextos en la formación inicial docente. Fundamentos pedagógicos y espaciales para aprender a ser docentes: Aula Viva

Un grupo multidisciplinar de docentes de la Universidad de Málaga nos hemos constituido en equipo de investigación para diseñar y desarrollar un contexto universitario de formación inicial docente coherente con las necesidades y retos educativos actuales. El proyecto, perteneciente al II Plan Propio de Smart Campus y denominado “Naturalización de espacios educativos para nuevos modelos docentes innovadores” (“Naturalezas docentes”), trata de diseñar e investigar un espacio armónico, natural, vivo y complejo donde los docentes en formación se pongan en acción y relación con la enseñanza y el aprendizaje, creando propuestas reales y dialogadas que ofrecerán a niños y niñas de las escuelas cercanas. Es decir, un espacio de creación que nos permitirá investigar la propia formación docente en sí misma y orientarla hacia un proceso de investigación ligado a la práctica en ciclos de reflexión y acción crítica (Helgevold y Wilkins, 2019), donde el alumnado y también los docentes implicados en la formación, analicen las experiencias educativas que se viven y promueven entre la escuela y la universidad. Teniendo en cuenta todo lo anterior, nuestra investigación parte de un análisis contextual básico, tanto social como pedagógico y natural. Una tríada que nos ayude a situar los retos educativos actuales, así como la formación inicial del profesorado, analizando espacios escolares y universitarios contemporáneos y definiendo, por último, las cualidades y dimensiones de un espacio universitario provocador, sugerente, acogedor y, sobre todo, educativo: Aula Viva

PROTO-COL. Red interuniversitaria para la formación en protocolo, eventos y relaciones institucionales (2010-2016)

Este proyecto de innovación docente denominado “Proto-col: red interuniversitaria de trabajo colaborativo en protocolo y gestión de eventos” se ha desarrollado durante los últimos seis cursos académicos (2010-2011, 2011-2012, 2012-2013, 2013-2014, 2014-2015, 2015-2016) y constituye en la actualidad un grupo de trabajo consolidado, en el que sus miembros han compartido un ejercicio de reflexión sobre las capacidades, habilidades y destrezas en este ámbito, por parte de los estudiantes de los Grados en Publicidad y Relaciones Públicas ofertados por la Universidad de Alicante, la Universitat Jaume I de Castellón, y la Universidad Miguel Hernández (a través de su centro adscrito IMEP), con la implantación del Grado en Organización de Eventos, Protocolo y Relaciones Institucionales desde el curso 2012-2013 y del Máster Universitario como posgrado desde el curso 2013-2014. Para ello, durante todos estos años, se ha trabajado en el diseño de propuestas educativas y metodología didáctica aplicada a las asignaturas vinculadas al protocolo, la gestión de eventos y las relaciones institucionales. Se han realizado diferentes investigaciones exploratorias sobre perfiles profesionales y la presencia de materias vinculadas al protocolo, la gestión de eventos y las relaciones institucionales en las universidades españolas. Todas estas aportaciones, junto con la participación en cursos de especialización y másteres universitarios, la realización de proyectos académicos, la dirección de TFGs, TFMs y tesis doctorales reflejan el trabajo colaborativo de un grupo de profesores especializados en esta materia y justifica la pertinencia de este proyecto interuniversitario que se ha traducido en diversas contribuciones académicas y experiencias de enseñanza-aprendizaje

Experimental archeology at Cuevas de la Araña (Málaga, Spain)

En este trabajo abordamos las actividades de Arqueología Experimental desarrolladas en las Cuevas de La Araña. Éstas, cubren los campos más significativos de la Arqueología y sus protocolos -de campo y laboratorio-, así como la reproducción de los procesos tecnológicos con que se tuvieron que enfrentar los grupos prehistóricos para su supervivencia, desde el Paleolítico Inferior hasta el Calcolítico. Con la reproducción de las diversas tecnologías se obtiene una información más directa, y se aprecia mejor las dificultades inherentes a cada una de ellas, obteniéndose una visión más ajustada de la propia evolución tecnológica, y los avances conseguidos en cada periodo culturalThe following paper addresses a series ofexperimental archeology activities performed at the Archeological Site ofLa Araña. They cover the most significant aspects ofArcheology and its protocols -includingfield and laboratory work-as well as the replication of technological processes prehistoric groups had to face for their survival, from the Lower Paleolithic to the Chalcolithic. With the reenactment of the various technologies more immediate information is obtained, and the difficulties inherent to each of them are better appreciated, building a more accurate perspective of the technological evolution itself, andthe advances achieved in each cultural perio

Use of meat resources in the Early Pleistocene assemblages from Fuente Nueva 3 (Orce, Granada, Spain) (vol 13, 213, 2021)

Correction to: Archaeological and Anthropological Sciences (2021) 13: 213Peer reviewe

Safety and immediate humoral response of COVID-19 vaccines in chronic kidney disease patients:the SENCOVAC study

BACKGROUND: Chronic kidney disease (CKD) patients are at high-risk for severe Covid-19. The multicentric, observational and prospective SENCOVAC study aims to describe the humoral response and safety of SARS-CoV-2 vaccines in CKD patients. Safety and immediate humoral response results are reported here. METHODS: Four cohorts of patients were included: kidney transplant (KT) recipients, haemodialysis (HD), peritoneal dialysis (PD) and non-dialysis CKD patients from 50 Spanish centres. Adverse events after vaccine doses were recorded. At baseline and on day 28 after the last vaccine dose, anti-Spike antibodies were measured and compared between cohorts. Factors associated with development of anti-Spike antibodies were analyzed. RESULTS: 1746 participants were recruited: 1116 HD, 171 PD, 176 non-dialysis CKD patients and 283 KT recipients. Most patients (98%) received mRNA vaccines. At least one vaccine reaction developed after the first dose in 763 (53.5%) and after the second dose in 741 (54.5%) of patients. Anti-Spike antibodies were measured in the first 301 patients. At 28 days, 95% of patients had developed antibodies: 79% of KT, 98% of HD, 99% of PD and 100% of non-dialysis CKD patients (p<0.001). In a multivariate adjusted analysis, absence of an antibody response was independently associated to KT (OR 20.56, p = 0.001) and to BNT162b2 vaccine (OR 6.03, p = 0.023). CONCLUSION: The rate of anti-Spike antibody development after vaccination in KT patients was low but in other CKD patients it approached 100%; suggesting that KT patients require persistent isolation measures and booster doses of a Covid-19 vaccine. Potential differences between Covid-19 vaccines should be explored in prospective controlled studies

Professional Quality of Life and Perceived Stress in Health Professionals before COVID-19 in Spain: Primary and Hospital Care

This study aimed to analyze the professional quality of life and the perceived stress of health professionals before COVID-19 in Spain, in primary and hospital care professionals. A cross-sectional observational study on health professionals working in health centers during the health crisis caused by COVID-19 was conducted. Professional Quality of Life (ProQoL) and Perceived Stress (PSS-14) were measured, along with socio-demographic and labor variables through an online questionnaire. A descriptive and correlation analysis was performed. A total of 537 professionals participated, both in hospital care (54.7%) and in primary care (45.3%). There was a predominance of medium Compassion Satisfaction, high Compassion Fatigue and medium Burnout. Mean scores for compassion fatigue and compassion satisfaction were slightly higher in primary care, while burnout was higher in hospital care. When primary care participants were grouped by profession, significant differences were found in relation to perceived stress and to the three subscales of professional quality of life. In hospital care, the differences were observed when comparing compassion fatigue and perceived stress by gender. In addition, with respect to Burnout it was carried out by type of contract and shift and in relation to perceived stress grouped by sex, contract and profession. The COVID-19 health crisis has had an impact on mental health and the quality of professional life of health professionals. There is a need to implement long-term contingency programs aimed at improving the emotional well-being of health service professionals