Systems metabolic engineering of Escherichia coli for production of violacein and deoxyviolacein

Violacein and deoxyviolacein are promising therapeutics against pathogenic bacteria and viruses as well as tumor cells. In the present work, systems-wide metabolic engineering was applied to Escherichia coli for heterologous production of these high-value products. First, a high performance liquid chromatography method for accurate separation and quantification of violacein and deoxyviolacein was developed. Afterwards, a basic producer, E. coli dVio-1, that expressed the vioABCE cluster from Chromobacterium violaceum under control of the araBAD promoter and induction by L-arabinose, was constructed. Targeted intracellular metabolite analysis then identified bottlenecks in pathways that supply tryptophan, the major product building block of the natural products of interest. This was used for systems-wide engineering of serine, chorismate and tryptophan biosynthesis and the non-oxidative pentose-phosphate pathway, followed by elimination of L-arabinose catabolism. Transferred to a glycerol-based fed-batch process, E. coli dVio-8 surpassed the gram scale and produced 1.6 g L-1 deoxyviolacein (>99.5% purity). The created chassis of a high-flux tryptophan pathway was complemented by genomic integration of the vioD gene of Janthinobacterium lividum, which enabled exclusive production of violacein (710 mg L-1 with 99.8% purity). This demonstrates the potential of E. coli as a platform for production of tryptophan based therapeutics.Violacein und Deoxyviolacein sind vielversprechende Therapeutika gegen pathogene Bakterien und Viren als auch Tumorzellen. In der vorliegenden Arbeit wurde Escherichia coli zur heterologen Produktion dieser hochwertigen Produkte untersucht. Zuerst wurde eine HPLC-Methode für eine genaue Trennung und Quantifizierung von Violacein und Deoxyviolacein entwickelt. Anschließend wurde einer Basisstamm von E. coli, die die vioABCE Operon aus Chromobacterium violaceum unter der Kontrolle des araBAD-Promotor, konstruiert. Gezielte intrazelluläre Stoffwechselanalysen identifizierten dann Engpässe in den zuliefernden Routen der Biosynthese von Tryptophan, dem zentralen Baustein für das Produkt. Dieses Wissen wurde für die rationale Stammoptimierung genutzt. Durch die aufeinanderfolgende Optimierung von Serin-, Tryptophan- und Chorismat-Biosynthese sowie des nicht-oxidativen Pentose-Phosphat-Weges konnte eine umfassende Optimierung des Stoffflusses zum Zielprodukt erreicht werden. In einem Glycerin-basierten Fed-Batch-Verfahren, hat E. coli dVIO-8 den Gramm-Maßstab übertroffen (1,6 g L-1 Deoxyviolacein, >99,5% Reinheit). Das metabolische Chassis von E. coli mit einem High-Flux-Tryptophan-Weg wurde durch genomische Integration des vioD Genes aus Janthinobacterium lividum zur gezielten Produktion (710 mg L-1, 99,8% Reinheit) von Violacein weiterentwickelt. Die Ergebnisse zeigen darüber hinaus das große Potential von E. coli als Plattform für die Produktion Tryptophan-basierter Therapeutika

As três margens do rio e o vertiginoso fluxo da vida

O ensaio procura mostrar como o título e o enredo de "A terceira margem do rio", o célebre conto de Primeiras estórias, de João Guimarães Rosa, podem ser aproximados da noção de "terceiro não excluído", tal como proposta por Immanuel Wallerstein, em artigo sobre Fernand Braudel e Ilya Prigogine. Nessa perspectiva, o conto apontaria para a existência - na vida como na literatura - de um terceiro caminho, que não exclui mas participa dos dois caminhos usualmente apresentados como mutuamente excludentes pelo pensamento binário - tão difícil de ser superado, como o demonstra um fragmento de Adorno e Horkheimer.This essay seeks to show how the title and the plot of "A terceira margem do rio" [The third bank of the river], the acclaimed short story from the book Primeiras estórias, by João Guimarães Rosa, relate to the notion of "the unexcluded middle," as discussed by Immanuel Wallerstein in an article on Fernand Braudel and Ilya Prigogine. In this perspective, the short story emphasizes the possibility of a third way that does not exclude, and indeed encompass, the two paths that are often presented as mutually exclusive by the binary thinking - a system that is very difficult to surmount, as a fragment by Adorno and Horkheimer shows

Systems metabolic engineering of Escherichia coli for production of violacein and deoxyviolacein

Violacein and deoxyviolacein are promising therapeutics against pathogenic bacteria and viruses as well as tumor cells. In the present work, systems-wide metabolic engineering was applied to Escherichia coli for heterologous production of these high-value products. First, a high performance liquid chromatography method for accurate separation and quantification of violacein and deoxyviolacein was developed. Afterwards, a basic producer, E. coli dVio-1, that expressed the vioABCE cluster from Chromobacterium violaceum under control of the araBAD promoter and induction by L-arabinose, was constructed. Targeted intracellular metabolite analysis then identified bottlenecks in pathways that supply tryptophan, the major product building block of the natural products of interest. This was used for systems-wide engineering of serine, chorismate and tryptophan biosynthesis and the non-oxidative pentose-phosphate pathway, followed by elimination of L-arabinose catabolism. Transferred to a glycerol-based fed-batch process, E. coli dVio-8 surpassed the gram scale and produced 1.6 g L-1 deoxyviolacein (>99.5% purity). The created chassis of a high-flux tryptophan pathway was complemented by genomic integration of the vioD gene of Janthinobacterium lividum, which enabled exclusive production of violacein (710 mg L-1 with 99.8% purity). This demonstrates the potential of E. coli as a platform for production of tryptophan based therapeutics.Violacein und Deoxyviolacein sind vielversprechende Therapeutika gegen pathogene Bakterien und Viren als auch Tumorzellen. In der vorliegenden Arbeit wurde Escherichia coli zur heterologen Produktion dieser hochwertigen Produkte untersucht. Zuerst wurde eine HPLC-Methode für eine genaue Trennung und Quantifizierung von Violacein und Deoxyviolacein entwickelt. Anschließend wurde einer Basisstamm von E. coli, die die vioABCE Operon aus Chromobacterium violaceum unter der Kontrolle des araBAD-Promotor, konstruiert. Gezielte intrazelluläre Stoffwechselanalysen identifizierten dann Engpässe in den zuliefernden Routen der Biosynthese von Tryptophan, dem zentralen Baustein für das Produkt. Dieses Wissen wurde für die rationale Stammoptimierung genutzt. Durch die aufeinanderfolgende Optimierung von Serin-, Tryptophan- und Chorismat-Biosynthese sowie des nicht-oxidativen Pentose-Phosphat-Weges konnte eine umfassende Optimierung des Stoffflusses zum Zielprodukt erreicht werden. In einem Glycerin-basierten Fed-Batch-Verfahren, hat E. coli dVIO-8 den Gramm-Maßstab übertroffen (1,6 g L-1 Deoxyviolacein, >99,5% Reinheit). Das metabolische Chassis von E. coli mit einem High-Flux-Tryptophan-Weg wurde durch genomische Integration des vioD Genes aus Janthinobacterium lividum zur gezielten Produktion (710 mg L-1, 99,8% Reinheit) von Violacein weiterentwickelt. Die Ergebnisse zeigen darüber hinaus das große Potential von E. coli als Plattform für die Produktion Tryptophan-basierter Therapeutika

Produção heteróloga de violaceína por Escherichia Coli

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-graduação em Engenharia QuímicaA violaceína é um pigmento formado pela união de duas moléculas modificadas do aminoácido L-triptofano. Este pigmento apresenta propriedades interessantes como tripanocida e antitumoral. Dentre os microrganismos produtores de violaceína encontra-se a bactéria Chromobacterium violaceum. Os genes necessários à síntese de violaceína em C. violaceum estão organizados em um operon conhecido como vioABCDE. A clonagem e expressão dos genes vioABCDE de C. violaceum sob controle do promotor araBAD foi realizada em Escherichia coli visando avaliar a estabilidade, rendimento e produtividade da produção heteróloga de violaceína neste microrganismo. Os resultados indicam que um dos fatores responsáveis pela instabilidade da produção de violaceína em E. coli está relacionado às alterações que podem ser causadas aos genes vioABCDE devido à produção desta molécula. Apesar da instabilidade observada, foi possível a obtenção de um rendimento e produtividade de violaceína bruta de 22,06 mg/gMS e 10,71 µmol/gMS·h, respectivamente

Aplicação de rede social no suporte a pacientes com doenças neurodegenerativas

Redes sociais mundialmente famosas como o Facebook têm como objectivo a interacção entre os seus utilizadores com o recurso a conteúdos e funcionalidades de vários tipos. Enquanto estas redes sociais são essencialmente genéricas, a rede social que se pretende desenvolver é focada na prestação dos cuidados de saúde e deve servir como apoio para pacientes e famílias que têm à sua guarda membros doentes, em particular pacientes que sofram de doenças degenerativas. Esta rede social deve suportar as actividades não apenas dos pacientes e dos seus familiares (cuidadores informais), mas também de médicos, profissionais de saúde e comunidade em geral, com o objetivo de criar uma troca de informação e apoio entre os seus membros.Globally famous social networks like Facebook have as objective the interaction between all users, using as resources content and functionality's of all kinds. While these social networks are essentially used with general purposes, the social network that this investigation pretends to develop is focused at provisioning health care and should serve as a support for patients and families who have these kind of patients - neurodegenerative disease patients. This social network should support not only patients and families but also health professionals and general community, having in mind the information exchange and support between it's members

A importância das aulas de Educação Física na educação infantil

Introdução: O presente estudo destaca a importância da Educação Física na Educação Infantil, observando os aspectos lúdico e psicomotor no qual a criança desenvolverá ao longo da Educação Infantil assim como os aspectos sociais e cognitivos. É observado também a influencia que o professor de Educação Física tem perante os alunos e qual deve ser sua postura e metodologia diante os fatos que ocorrem na Educação Infantil. Objetivo: Identificar como a Educação Física é importante no ensino da Educação Infantil, e verificar como a disciplina Educação Física engloba os elementos do desenvolvimento motor das crianças na Primeira Infância e correlacionar o lúdico com a Educação Física Escolar. Materiais e Métodos: Este artigo teve como base artigos científicos e monografias, na qual foi realizado mediante revisão bibliográfica, tornando este trabalho uma pesquisa de cunho exploratório. Revisão da Literatura: A Educação Física carrega consigo um papel de suma importância, porque a criança que se encontra nesta fase está em amplo processo de desenvolvimento de diversas funções, entre elas motoras, sociais, emocionais e cognitivas, nas quais transita da fase de individualismo para a vivência social. Sendo assim, as aulas de Educação Física são imprescindíveis para que possa haver um aprendizado através do lúdico, onde vão se desenvolver aspectos fundamentais como o afetivo-social e motor (MAGALHÃES, 2007). Segundo Kunz (2006), a Educação Física percebe o jogo como um dos seus conteúdos clássicos, que possibilita desenvolver uma educação baseada em um processo lúdico e criativo, permitindo modificar imaginariamente a realidade como processo educativo. Nesse contexto, a Educação Física Escolar tem como uma de suas funções propor aos alunos novas formas de brincar, exercitando sua criatividade, através do movimento corporal, do mais simples reflexo (agarrar, esticar, olhar) até o movimento sistematizado (pular elástico, jogar xadrez, dançar). .Considerações Finais: Observamos neste estudo, que o professor de Educação Física tem um papel motivador e muito relevante no processo educacional da criança na Educação Infantil, por meio de uma parceria com o professor regente, oportunizando seu desenvolvimento psicomotor de forma integral e harmoniosa.Introduction: This study highlights the importance of physical education in kindergarten, watching the playful and psychomotor aspects in which the child will develop throughout childhood education as well as social and cognitive aspects. It also noted the influence that the physical education teacher has students before and what should be their attitude and methodology on the events that occur in early childhood education. Objective: To identify how physical education is important in the education of early childhood education, and check how the Physical Education encompasses the elements of motor development of children in early childhood and to correlate the playful with the Physical Education. Material and Methods: This article was based on scientific articles and monographs, which was carried out through literature review, making this job as exploratory research. Literature Review: The Physical Education carries a role of paramount importance, because the child is at this stage is in the broad process of developing various functions, including motor, social, emotional and cognitive, in which transitions of individualism phase for social life. Therefore, the physical education classes are essential for you to be a learning through play, which will develop fundamental aspects such as emotional-social and motor. (Magalhaes, 2007) According to Kunz (2006), Physical Education sees the game as one of their classic content, which enables you to develop an education based on a playful and creative process, allowing you to modify imaginary reality as an educational process. In this context, physical education has as one of its functions offer students new ways of playing, exercising your creativity, through body movement, from the simplest reflex (grab, stretch, look) to the systematic movement (elastic jump, play chess, dance). Conclusions: We observed in this study, the physical education teacher has a motivating and very important role in the child's educational process in kindergarten, through a partnership with Regent teacher, providing opportunities psychomotor development in a comprehensive and harmonious way

SACARIFICAÇÃO DE RESÍDUOS CELULÓSICOS COM BACTÉRIAS RECOMBINANTES COMO ESTRATÉGIA PARA REDUÇÃO DO EFEITO ESTUFA.

Atualmente, o intenso uso de veículos automotores contribui para o aumento do efeito estufa. Uma das estratégias para a redução na emissão de gases poluentes é a substituição dos combustíveis fósseis por biocombustíveis. Neste contexto, o emprego do etanol vem apresentando contribuição significativa. Contudo, durante a produção do álcool de cana-de-açúcar, também são gerados subprodutos celulósicos que eventualmente são queimados para a concomitante geração de energia. Alternativamente à queima, o processo de bioconversão microbiana vem permitindo a geração de produtos de alto valor agregado (etanol, enzimas e alimentos). Tal processo, conhecido por sacarificação enzimática da celulose em glicose, requer a ação de três grupos de celulases (endoglucanases, exoglucanases e beta-glucosidases). Entretanto, são raros os exemplos de microrganismos cultivados industrialmente que apresentem a capacidade de hidrolisar totalmente o polissacarídeo celulose na forma cristalina. Apesar disso, a construção de bactérias geneticamente modificadas, pode capacitá-las na sacarificação de resíduos celulósicos e/ou na síntese de álcool. Neste sentido, conclui-se que a obtenção de organismos recombinantes representa uma estratégia alternativa para a produção de álcool. Tal processo poderá contribuir para a redução do preço final deste produto, incluindo-o definitivamente em nosso cotidiano em substituição aos combustíveis fósseis e, conseqüentemente, reduzindo a expansão do efeito estufa. Palavras-chave: sacarificação; bactérias recombinantes; efeito estufa. ABSTRACT Use of recombinant bacteria for celulosic residues saccharification as an strategy for green house effects migration. The extensive use of motor vehicles contributes to the greenhouse effect, since combustion of fossil fuels generates greenhouse gases. Substitution of these fossil fuels by biofuels is one of the strategies employed for reduction of greenhouse gases. For instance, the substitution of gasoline and diesel oil by ethanol produced from sugar cane in the automotive industry has been playing an important role regarding the reduction of greenhouse gases emission. Nevertheless, during this process large amounts of cellulosic wastes are generated. Although these by-products are frequently burned to generate energy they may be bioconverted by microorganisms into products with high aggregate value such as ethanol, enzymes, and food. This process is called saccharification and requires the action of three kinds of enzymes (endoglucanases, exoglucanases and beta-glucosidases) known as cellulases. Microorganisms normally used in industrial processes, which are capable to hydrolyze crystalline cellulose into glucose, are rare in nature. Therefore, the development of recombinant bacteria for saccharification of cellulosic residues represents an alternative way that results in the production of ethanol at reduced costs and, therefore, contributes to the use of this renewable source to reduce greenhouse gases generation. Keywords: saccharification, recombinant bacteria, greenhouse effect