Development of new cellular models for step-by-step analysis of Astrogliogenic pathways

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015The Janus kinase/signal transducers and activators of transcription (JAK/STAT) pathway is an evolutionarily conserved mechanism for signalling transduction and involves four steps regulated by protein-protein interactions. Cytokines bind to the common receptor glycoprotein 130 (gp130) to activate JAKs, which then phosphorylate STATs leading to its dimerization and translocation to the nucleus to induce target genes. The activation of this pathway is essential for astroglia production during brain development and upon central nervous system (CNS) damage. Astrocytes are crucial to neuronal survival and determine the ability of the CNS to repair damage and regenerate. Multiple brain insults elicit a reactive response from astrocytes called astrogliosis, which can impair axonal regeneration and the reestablishment of the neural circuits. Due to the pleiotropic effects of the JAK/STAT pathway several attempts have been made to target this signalling pathway. However, further investigation on protein interactions and dynamics are required for an efficient determination of molecular targets. In this regard, bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays offer a direct method to identify potential modulators of protein interactions. In this study, we developed two Venus-based BiFC systems to screen for modulators of key protein-protein interactions in the JAK/STAT pathway, a gp130-Venus and a Venus-STAT3 BiFC system. Both systems worked in living cells and displayed a similar behaviour to endogenous proteins sustaining novel information regarding the dimerization of these proteins. The Venus-STAT3 BiFC system was further validated by a specific inhibitor of STAT3. These results show the potential of the BiFC systems as tools for drug and genetic screenings, as well as step-by-step analysis of the JAK/STAT pathway in diverse biological contexts.A via de sinalização JAK/STAT é um mecanismo de transdução de sinal conservado na evolução, que envolve quatro etapas de fosforilação e a formação de vários complexos proteicos. As citocinas da família da interleucina 6 ligam-se à cadeia comum do receptor composta pela glicoproteína 130 (gp130), induzindo uma alteração de conformação que ativa as JAKs, construtivamente associadas a estes. Por sua vez, as JAKs fosforilam resíduos de tirosina específicos nos recetores que permitem recrutar proteínas, como o fator de transcrição STAT3. As JAKs fosforilam o STAT3 em resíduos específicos e estes dímeros ativados migram para o núcleo para induzir a transcrição de genes específicos. A fosforilação do STAT3 pelas JAKs sempre foi considerada o processo pelo qual estes fatores de transcrição dimerizam, migram para o núcleo e ligam-se ao DNA. No entanto, estudos recentes demonstram que esta proteína existe como dímeros estáveis a priori e estes são continuamente transportados entre o citoplasma e o núcleo. A ativação deste mecanismo de transdução de sinal é essencial para a produção de astrócitos durante o desenvolvimento do cérebro e em alturas de dano no sistema nervoso central. Os astrócitos são extremamente importantes para a sobrevivência dos neurónios e determinam a capacidade de o sistema nervoso central reparar danos e de se regenerar. Existem múltiplos estímulos negativos que podem gerar uma resposta reativa dos astrócitos, denominada astrogliose, que é mediada pela via JAK/STAT. Quando o grau de lesão é severo os astrócitos formam a cicatriz glial, que constitui uma barreira entre o microambiente lesado e o parênquima saudável. Esta barreira limita a extensão do dano e inflamação provenientes do estímulo patológico, protegendo as células neuronais. No entanto, esta resposta imediatamente protetora pode promover doenças e inibir a regeneração do sistema nervoso central se o estimulo patológico persistir e a astrogliose for incapaz de o resolver. A via JAK/STAT condiciona inúmeras respostas biológicas envolvidas no ciclo celular, diferenciação e migração celular e apoptose. Devido ao seu largo espectro de ação, esta via está envolvida em processos fisiológicos fundamentais, como por exemplo, o desenvolvimento e a hematopoiese. A sua associação a diversas patologias é inerente às suas funções, e estas incluem inflamação crónica, doenças autoimunes, desordens neurodegenerativas e vários tipos de cancro. A ativação constitutiva do fator de transcrição STAT3 está associada a muitas destas patologias tornando esta via num alvo terapêutico promissor. No entanto, é necessário um maior conhecimento relativamente às dinâmicas intervenientes em interações proteicas subjacentes a este mecanismo, de forma a determinar mais eficientemente possíveis alvos moleculares e os seus moduladores. A complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) é uma técnica que permite visualizar interações proteicas em células vivas. Esta técnica baseia-se na fusão de fragmentos complementares de uma proteína fluorescente com as proteínas de interesse. Quando as proteínas de interesse interagem a proteína repórter é reconstituída e emite um sinal fluorescente proporcional ao número de dímeros formados. Este sinal pode ser analisado, quantitativamente e qualitativamente, utilizando métodos convencionais como a citometria de fluxo e a microscopia de fluorescência. O sistema BiFC também permite uma análise direta para identificar moduladores promissores de interações protéicas. Aplicando este sistema ao estudo da via JAK/STAT, teremos uma maior compreensão sobre as complexas interações protéicas que controlam a astrogliose, promovendo a regeneração do sistema nervoso central. No presente estudo foram desenvolvidos dois sistemas de BiFC baseados na proteína fluorescente Venus, de forma a avaliar moduladores na interação de proteínas cruciais na via JAK/STAT. Estes sistemas, gp130-Venus e Venus-STAT3, foram criados por clonagem molecular a partir de outros plasmídeos. Posteriormente foram testados em células animais e analisados por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência de forma a avaliar a sua funcionalidade, eficiência e comportamento. Tanto o sistema gp130-Venus como o Venus-STAT3, funcionaram em células vivas, tendo o primeiro baixos níveis de fluorescência, enquanto que o segundo demonstrou uma eficiência total superior. O comportamento de ambos os sistemas foi similar às proteínas endógenas, confirmando as investigações recentes referentes ao estado de dimerização destas proteínas na ausência de estímulos. O Venus-STAT3 produziu um maior nível de fluorescência e portanto foi o sistema estudado com mais profundidade. Para aferir a aplicabilidade do sistema molecular desenvolvido no estudo de interações de proteína, estudámos um dos plasmídeos do sistema Venus-STAT3 em combinação com outros plasmídeos que continham a metade complementar da proteína Venus. Os plasmídeos analisados eram constituídos por diversas proteínas envolvidas em doenças neurodegenerativas como: huntingtin, tau, synuclein, DJ-1 e GFAP, e tanto o factor de transcrição p53 como o seu regulador, mdm2. O sistema Venus-STAT3 também foi investigado em células animais após estimulação com citocinas, voltando a verificar-se um comportamento semelhante ao endógeno. O sistema Venus-STAT3 confere informação direta sobre a dimerização de STAT3. Para provar o seu potencial como ferramenta para a descoberta de novos moduladores desta interação, foi testado com um inibidor específico de dimerização recentemente desenvolvido pelo grupo de investigação da Dr. Rita Delgado. O tratamento com este inibidor reduziu a fluorescência gerada pela interação dos dímeros STAT3, voltando-se a validar este sistema. Os resultados apresentados demonstram o potencial destes sistemas BiFC a dois níveis: 1) como ferramentas na análise de moduladores farmacológicos e genéticos, e 2) na dissecção dos intervenientes da via JAK/STAT em diversos contextos biológicos. Estas ferramentas contribuem para um maior conhecimento das dinâmicas das interações proteicas envolvidas nesta cascada de sinalização, que mesmo parecendo simples se torna complexa quando analisada em conjunto com outras vias de sinalização

Interviewing Peter Gow — Dundee, June 24, 2017

This interview presents an initial dialogue about Peter Gow’s trajectory as an anthropologist, trying to bring to light particularly the fieldwork experiences and events that it had not been possible to commenton and explore in the published material. Its aim is to understand more closely the particular ways in which Peter Gow had come to arrive at the insights and the analyses presented in his brilliant ethnographies with the Yine/Piro people of Amazonia

Sustainable Production Programme in Setubal Region (PROSSET) : final results

ABSTRACT: Between 1997 and 1999, a Sustainable Production Programme was developed in the Portuguese Setubal region. In this paper its final results are presented. The programme included cleaner production (CP) demonstration projects developed in 10 companies located in the region and the involvement of local stakeholders, aiming at stimulating the diffusion and application of sustainable development principles in the region. The CP projects allowed the team to generate environmental, economic and social benefits for the companies, and also to achieve improvements in the quality of the regional environment. The role of stakeholders is discussed, in terms of subsequent actions taken by them.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Is painless synovitis different from painful synovitis? A controlled, ultrasound, radiographic, clinical trial

OBJECTIVE: This study compares the clinical, ultrasonography, radiography, and laboratory outcomes of painless and painful chronic synovitis in patients with established rheumatoid arthritis. METHODS: This cross-sectional study involved 60 patients with rheumatoid arthritis and synovitis in the metacarpophalangeal joints; 30 of the patients did not experience pain, and 30 had experienced pain for at least 6 months prior to the study. The radiocarpal, distal radioulnar, and metacarpophalangeal joints were evaluated using the ultrasound gray scale, power Doppler, and radiography. Past and present clinical and laboratory findings were also evaluated. RESULTS: There were no statistically significant differences between the groups for most of the outcomes. The group with pain scored worse on the disease activity indices (e.g., DAS 28 and SDAI), function questionnaires (HAQ and Cochin), and pinch strength test. A logistic regression analysis revealed that the use of an immunobiological agent was associated with a 3-fold greater chance of belonging to the group that experienced pain. The painless group had worse erosion scores in the second and fifth metacarpophalangeal with odd ratios (ORs) of 6.5 and 3.5, respectively. The painless group had more cartilage with grade 4 damage in the third metacarpophalangeal. CONCLUSIONS: The rheumatoid arthritis patients with both painless and painful synovitis exhibited similar disease histories and radiographic and ultrasound findings. However, the ultrasonography evaluation revealed worse scores in the second and fifth metacarpophalangeal of the synovitis patients who did not experience pain.Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao PauloUNIFESP communityHospital do Servidor Publico Estadual (IAMSPE)Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Escola Paulista de Medicina Disciplina de ReumatologiaUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Escola Paulista de Medicina Departamento de Diagnostico por ImagemUNIFESP, EPM, Disciplina de ReumatologiaUNIFESP, EPM, Depto. de Diagnostico por ImagemFAPESP - 2012/04867-6SciEL

ANÁLISE DA DINÂMICA DA CONDIÇÃO CAMPONESA NO TERRITÓRIO DA CANTUQUIRIGUAÇU - PR: UM EXERCÍCIO METODOLÓGICO A PARTIR DOS ESTUDOS SOBRE CAMPESINATO DE JAN DOUWE VAN DER PLOEG E DO CENSO AGROPECUÁRIO DE 2017

Esta pesquisa analisa dados preliminares do Censo agropecuário de 2017, em comparação ao Censo agropecuário de 2006, do Território da Cantuquiriguaçu/PR, tomando-se como referência o Estado do Paraná. Utilizou-se a proposta de Jan Douwe van der Ploeg, destacando características da agricultura no território que possam identificar qual estilo de agricultura, dentre os propostos por Ploeg, está sendo realizada na Cantuquiriguaçu e sua aproximação com a Agroecologia. Como conclusão, ressalta-se que esta análise utiliza dados preliminares e ausência de microdados, impossibilitando gerar conclusões precisas, contudo já aponta que a condição camponesa está em crescente aproximação à agricultura empresarial no território

Is painless synovitis different from painful synovitis? A controlled, ultrasound, radiographic, clinical trial

OBJECTIVE: This study compares the clinical, ultrasonography, radiography, and laboratory outcomes of painless and painful chronic synovitis in patients with established rheumatoid arthritis. METHODS: This cross-sectional study involved 60 patients with rheumatoid arthritis and synovitis in the metacarpophalangeal joints; 30 of the patients did not experience pain, and 30 had experienced pain for at least 6 months prior to the study. The radiocarpal, distal radioulnar, and metacarpophalangeal joints were evaluated using the ultrasound gray scale, power Doppler, and radiography. Past and present clinical and laboratory findings were also evaluated. RESULTS: There were no statistically significant differences between the groups for most of the outcomes. The group with pain scored worse on the disease activity indices (e.g., DAS 28 and SDAI), function questionnaires (HAQ and Cochin), and pinch strength test. A logistic regression analysis revealed that the use of an immunobiological agent was associated with a 3-fold greater chance of belonging to the group that experienced pain. The painless group had worse erosion scores in the second and fifth metacarpophalangeal with odd ratios (ORs) of 6.5 and 3.5, respectively. The painless group had more cartilage with grade 4 damage in the third metacarpophalangeal. CONCLUSIONS: The rheumatoid arthritis patients with both painless and painful synovitis exhibited similar disease histories and radiographic and ultrasound findings. However, the ultrasonography evaluation revealed worse scores in the second and fifth metacarpophalangeal of the synovitis patients who did not experience pain

Effects of short term elastic resistance training on muscle mass and strength in untrained older adults : a randomized clinical trial

Background: The current recommendations on resistance training involving older adults have reported an improvement of body composition variables. Despite this, there is a lack of knowledge on how elastic resistance training (ERT) affects the muscle mass in older adults population. The purpose of this study was to determine the effects of a short-term ERT on muscle mass of health and untrained older adults. Methods: Forty older adults were randomized into two groups of 20 individuals each: Control Group (CG = 66.2 ± 6.6 years) and Training Group (TG = 69.1 ± 6.3 years). TG underwent an ERT twice a week during 8 weeks and control group did not receive any specific intervention. The primary outcome was the upper and lower limbs muscle mass, measured by Dual-energy x-ray absorptiometry. The secondary outcomes were knee isokinetic peak torque (PT) at 60°/s and 120°/s speeds and isometric handgrip strength. A 2×2 mixed model (group [TG and CG] × time [pre and post]) analysis of variance (ANOVA) was applied to determine the effect on primary and secondary outcomes. Results: The results of the ANOVA showed no significant effects in group x time interaction for (1) upper limbs fat free mass (F [1.38] = 1.80, p = 0.19, effect size [ES] = 0.1) and for (2) lower limbs fat free mass (F [1.38] = 0.03, p = 0.88, ES = 0.02). Regarding muscle strength, the ANOVA showed no significant effects in group x time interaction for (3) PT at 60°/s (F [1.38] = 0.33, p = 0.56, ES = 3.0), for (4) PT at 120°/s (F [1.38] = 0.80, p = 0.38, ES = 4.1) and for handgrip strength (F [1.38] = 0.65, p = 0.42-value, ES = 0.9). Analysis of PT in TG showed a significant change of 4.5 %, but only at 120°/s (p = 0.01) when comparing pre and post-training (time interaction). Conclusions: Eight weeks of ERT did not show significant changes in muscle mass and strength of untrained older adults

Associação de COVID-19 com síndrome HELLP-like: um relato de caso / Association of COVID-19 with HELLP-like syndrome: a case report

Desde o surgimento das primeiras infecções por coronavírus (SARS-CoV e MERS) as gestações foram associadas a riscos de abortamentos, partos prematuros, óbitos fetais intra-uterinos e mortes maternas. Com o surgimento do novo coronavírus em 2020, as repercussões do COVID-19, têm sido estudadas e as gestantes enquadradas como grupo de risco. O estado hiper-inflamatório originado pela COVID-19 pode estar associado com hipóxia placentária, levando a um estado antiangiogênico, resultando os mesmos sinais clínicos da pré-eclâmpsia, como hipertensão, proteinúria, trombocitopenia e enzimas hepáticas elevadas. Relato de caso: Gestante de 29 anos, G2P1CA0, apresentando hipertensão arterial crônica (HAC) e diabetes gestacional (DMG) diagnosticada no primeiro trimestre. Encontrava-se em uso de polivitamínicos, metildopa 750 mg/dia e AAS 100 mg/dia profilático para PE, desde o primeiro trimestre. Com 28 semanas, positivou para COVID-19 com doença sintomática e no 10º dia da doença foram prescritos amoxicilina e dexametasona para uso ambulatorial.  No 17º dia apresentou exames de controle que demonstraram elevação de transaminases e D-dímero, sem alteração pressórica. Foi iniciada a enoxaparina 40mg no pronto socorro e controle em 48h. No 19º dia os exames apresentados foram D-dímero elevado (1.390 mg/dl) e plaquetas em queda (100.000/mm3). A mulher foi internada com suspeita de síndrome HELLP, apesar de paradoxalmente, a pressão arterial mensurada ser de 120 x 80 mmHg, Os níveis plaquetários permaneceram em queda até o limite de 30.000/mm3), enquanto não houve elevação de pressão arterial, sendo portanto concluído diagnóstico de síndrome HELLP-like. Foi indicada a interrupção da gestação com 32 semanas e 2 dias de gestação, após 25 dias de curso da doença e transfusão de 10 bolsas de plaquetas.  Após o parto, foi entubada e encaminhada para UTI, onde após 48 horas, assintomática e com parâmetros todos normalizados, foi extubada e recebeu alta após 72h. Conclusão: Os autores discutem o diagnóstico diferencial das síndromes HELLP clássica e HELLP-like associada à COVID-19, bem como as possíveis diferenças de mecanismos para o seu desenvolvimento

Intervenções nutricionais para terapia do transtorno do espectro autista: revisão de escopo

Introdução: O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é um agravo do neurodesenvolvimento desencadeado por diversos fatores, incluindo os de natureza genética e ambiental. Os principais sintomas são digestórios e neurológicos, estando às intervenções nutricionais dentre as terapêuticas mais promissoras para amenizar a sintomatologia clínica Objetivo: Mapear evidências científicas sobre as intervenções nutricionais para pessoas com Transtorno do Espectro Autista (TEA). Materiais e Métodos: Scoping review realizada segundo recomendações do The Joanna Briggs Institute, nas bases de dados Medline, Lilacs, Cochrane Library, Embase, SciELO e Web of Science. Resultados: Foram selecionados 51 estudos publicados de 2015 a 2022, apresentando altos níveis de evidência. Quanto às evidências mapeadas, destacaram-se as dietas sem glúten e sem caseína e cetogênica, os suplementos alimentares como ácido fólico, N-acetilcisteína, probióticos, metil-B12, trimetilglicerina, vitaminas do complexo B, magnésio, vitamina D, ômega-3, melatonina e proteína isolada de soro de leite rico em cisteína, além dos nutracêuticos dietéticos como curcumina, resveratrol, naringerina, sulforafano e ácido gama-aminobutírico  na forma de chá Oolong como as intervenções nutricionais mais relatadas para terapia nutricional de pessoas com TEA, com indicações para reduzir comportamentos estereotipados e melhorar a comunicação, cognição e sociabilidade. Conclusão: A alimentação como uma medida terapêutica tem se mostrado benéfica, tornando necessários mais estudos para obter-se conhecimento da relação nutrição e TEA