Immunmodulation durch Interaktion des Yersinia enterocolitica V-Antigens mit Rezeptoren des angeborenen Immunsystems

In der vorliegenden Dissertation konnte der immunsuppressive Effekt von LcrV, über IL-10- Induktion eine TNF-alpha- Suppression auszulösen, auf TLR2 und Nod1/2 zurückgeführt werden. Damit konnte gezeigt werden, dass ein bakterieller Virulenzfaktor den für die Vermeidung einer überschiessenden Immunreaktion wichtigen Mechanismus einer TLR- Toleranz im Rahmen einer TLR- Homo- bzw. Heterotoleranzinduktion für seine Zwecke ausnutzt. Weiter konnte die LcrV- induzierte Signaltransduktion analysiert werden. Hierbei wurde herausgefunden, dass das LcrV- Signaling CD14- und TLR2- abhängig ist. Die in der Arbeit dargestellten in vitro und in vivo- Ergebnisse zeigen, dass Yersinien TLR2 ausnutzen, um über diesen Rezeptor der angeborenen Immunität die erste Immunantwort des Wirtes zu unterwandern. Als nicht- lipidiertes Protein eines Gram- negativen Bakteriums begründet LcrV nicht nur eine neue Klasse von bakteriellen TLR2- Agonisten, sondern als virulenz- assoziiertes Protein auch eine neue bakterielle Strategie, Rezeptoren (TLR2) und auch Effektoren (IL-10, TNFalpha) des angeborenen Immunsystems zur Umgehung der Wirtsimmunantwort zu nutzen. Für das LcrV-homologe Protein PcrV des opportunistischen Erregers P. aeruginosa, das weder eine IL-10- Induktion noch eine TNF-alpha- Suppression zeigte, konnte eine CD14/TLR2- Aktivität ausgeschlossen werden. Der Vergleich dieser Proteine zeigt auf, dass die Ausnutzung wirtseigener Effektoren eine pathogenetische Strategie ist, die obligat pathogene Bakterien von opportunistischen Erregern unterscheidet. Aufgrund der Diskrepanz in der immunmodulatorischen Wirkung von LcrV und PcrV wurde eine N-terminal lokalisierte LcrV- Domäne, die bei PcrV fehlt, als mögliche CD14/TLR2- aktive Domäne gefunden und näher untersucht. Unter Verwendung synthetischer Oligopeptide gelang es, die aktive Region von LcrV für das immunmodulierende CD14/TLR2- Signalling auf die Aminosäureregion aa31-aa57 einzugrenzen und durch punktmutierte Peptide und die zugehörigen Proteine mit voller LcrV- Länge schliesslich an der Existenz bestimmter Aminosäuren festzumachen. Ausserdem wurde hiermit der erste Nachweis einer TLR- Stimulierbarkeit durch nicht- lipidierte Peptide erbracht. Der endgültige Beweis für eine immunsupprimierende Wirkung der aktiven Region von LcrV über TLR2 wurde durch Konstruktion einer Yersinien- Mutante mit einem Aminosäureaustausch an Position 42 von LcrV erbracht, die keine LcrV- abhängige Immunmodulation über CD14/TLR2 mehr zeigte. Diese konnte in Mausinfektionsversuchen auch die Relevanz der LcrV- Wirkung für den Ausgang einer Y. enterocolitica Infektion beweisen. So konnte mit einer Yersinie mit TLR2- inaktivem LcrV, das alle übrigen Funktionen jedoch noch erfüllte, der nicht unbeträchtliche Beitrag von LcrV zur Gesamtpathogenität einer Yersinie verdeutlicht werden. Durch Verwendung von TLR2-/- und IL-10-/- Mäusen konnte auch die entscheidende Rolle von TLR2 und des endogenen Effektors IL-10 für die LcrV- induzierte Immunsuppression im Wirtsorganismus bewiesen werden. Auf der Suche nach möglichen intrazellulären Rezeptoren für LcrV wurden Nod1 und Nod2 identifiziert. Die Nod- aktive Region konnte auf die N- terminalen 130 Aminosäuren von LcrV eingegrenzt werden. Y. enterocolitica scheint die angeborene Immunantwort mit Hilfe des N- Terminus von LcrV doppelt- über den Transmembranrezeptor TLR2 und über die intrazellulären, löslichen Rezeptoren Nod1 und Nod2 zur Induktion einer Immunmodulation über IL-10 zu nutzen. Bei der Untersuchung der Frage, wie LcrV in die Zelle gelangt, wurde eine neuartige Shuttle- Funktion von TLR2 entdeckt, welches LcrV der Nod- Signalkaskade zuführt. Damit wurde erstmals gezeigt, dass ein TLR für die intrazelluläre Aufnahme eines bakteriellen Liganden benötigt wird. Darüber hinaus stellt LcrV das erste bekannte Protein und den dritten mikrobiellen Faktor dar, der von Nod1/2 erkannt wird. Insgesamt gesehen wurde in dieser Arbeit die elaborierte Strategie eines pathogenen Erregers genauer beleuchtet, der Effektoren (IL-10 im Rahmen einer TLR-Toleranz- Induktion) und extra- sowie intrazelluläre Rezeptoren des angeborenen Immunsystems ausnutzt, um so durch Vortäuschung des Endes einer Bedrohung durch ein Pathogen das Immunsystem zu überlisten und sich im Wirt auszubreiten. Aus der Arbeit können neue Einsichten in die Pathogen- Wirts- Interaktionen und in Struktur- Wirkungsbeziehungen von bakteriellen Proteinen in ihren Rezeptorinteraktionen mit LRR- haltigen Rezeptoren gewonnen werden. Es werden Ansatzpunkte geliefert, um durch Manipulation des TLR- bzw. Nod- Systems neue therapeutische Strategien zu entwickeln. Im Hinblick auf die Mutation im NOD2- Gen, die mit Morbus Crohn in Verbindung gebracht wird, kann die vorliegende Arbeit neue Ideen für die Ursachenforschung entzündlicher Erkrankungen liefern

Time-course of Toll-like receptor 2 expression, as a predictor of recurrence in patients with bacterial infectious diseases

The clinical course of bacterial infectious diseases is often variable, especially in elderly patients. Thus, new biological markers have been sought to predict the disease outcome. Recent studies have revealed that Toll-like receptor (TLR) 2 and/or TLR4 on circulating monocytes are significantly up-regulated in bacterial infections. However, the lack of reliable quantification methods hampers extensive study on the modulation of these molecules in response to the patient's clinical condition. In this study, we developed a new quantitative flow cytometric analysis system for TLR2. We then carried out a longitudinal study on TLR2 expression levels on monocytes from patients suffering from bacterial infectious diseases during and after antibiotic treatment. The clinical outcome divided 37 patients into ‘cure’ (n = 24) and ‘recurrence’ (n = 13) groups. A significant difference between the two groups was recognized in the TLR2 levels just after antibiotic treatment (antibody-binding sites/cell, 4395 ± 784 versus 5794 ± 1484, P < 0·001). The risk of recurrence was associated significantly with TLR2 (P < 0·001), but not C-reactive protein (P = 0·351) levels assayed during the first remission. Furthermore, antibiotic effectiveness was associated inversely with TLR2 levels during antibiotic administration (P < 0·001). Taken together, TLR2 expression levels on monocytes provide critical information for planning treatment against bacterial infectious diseases

Pneumonic Plague Pathogenesis and Immunity in Brown Norway Rats

The Brown Norway rat was recently described as a bubonic plague model that closely mimics human disease. We therefore evaluated the Brown Norway rat as an alternative small animal model for pneumonic plague and characterized both the efficacy and potency of vaccine candidates. When infected by intranasal instillation, these rats rapidly developed fatal pneumonic plague within 2 to 4 days of infection. Plague disease was characterized by severe alveolar edema and vascular hemorrhage in the lung in addition to fulminant necrotizing pneumonia caused by massive bacterial replication and inflammation. Twenty-four hours before death, animals developed systemic disease with an apparent delayed inflammatory response. We evaluated the ability of the protective antigen, LcrV, and a mutant derivative, V10, to protect these rats from pneumonic plague. Both were highly effective vaccines because complete protection was observed at challenge doses of 7500 LD50. Antibody analyses suggested stronger potency of V10 immune sera compared with LcrV in the passive transfer of immunity to bubonic plague, with multiple neutralizing epitopes in LcrV. Taken together, these data demonstrate the effectiveness of inhibiting type III secretion in the prevention of pneumonic plague in rats and reveal critical contributions from both the cellular and humoral immune systems. Thus, the Brown Norway rat is an appealing alternative small animal model for the study of pneumonic plague pathogenesis and immunity