β-Glucosidasas de cepas nativas y su potencial en la liberación de aromas en vinos. Desarrollo de nuevas estrategias para su uso en la industria enológica

Uruguay es un país vitivinícola, productor desde mediados del siglo XVII y ha sido reconocido internacionalmente con premiaciones y distinciones por su excelencia en calidad. Uno de los desafíos para el crecimiento del sector es la producción de vinos con características distintivas, competitivos para el mercado internacional. Actualmente, existe una tendencia a explorar y utilizar el potencial de la microbiota silvestre nativa en el proceso de elaboración de vinos, para aportar atributos que contribuyan a la calidad del producto. Algunos de estos atributos están asociados a productos generados por reacciones enzimáticas, por lo que la búsqueda y estudio de nuevas enzimas con propiedades específicas es muy interesante.Las β-glucosidasas (BGLs) son enzimas capaces de hidrolizar precursores glicosídicos de aromas que permanecen después de finalizada la fermentación y que constituyen una reserva potencial de aroma. Es extremadamente difícil encontrar variantes de estas enzimas que sean activas y estables en las condiciones de estrés enológico, como son las elevadas concentraciones de glucosa del mosto (~100 g/L), etanol en vinos (~12 % v/v), valores de pH ácidos (3.0-4.0), entre otras. En este trabajo, el primer abordaje fue seleccionar cepas nativas no-Saccharomyces de ambientes vínicos (Colección del Laboratorio de Enología de la Facultad de Química) capaces de producir actividad BGL a pH 4.0. Además de la cepa de referencia Issatchenkia terricola 0621, se destacaron en la producción de actividad BGL a este pH, las cepas I. terricola PV10-69F e Issatchenkia orientalis TE11-19F. Considerando que no se habían reportado estudios de caracterización de BGLs de I. orientalis, en esta tesis se purificó y caracterizó dicha enzima. Para su aplicación en vinos, la enzima fue estabilizada mediante inmovilización en nanopartículas de sílica y posterior entrecruzamiento con glutaraldehído. La actividad y especificidad de la enzima sobre precursores glicosídicos aislados de vino Moscatel blanco, estudiada en vino sintético, demostró un incremento significativo de terpenos, norisoprenoides y fenoles volátiles. Sin embargo, su aplicación directa en vinos no mostró actividad sobre los precursores de agliconas aromáticas, lo que podría deberse a una baja estabilidad en esta matriz, ya que perdió 100% de su actividad al final del proceso. En cambio, la BGL de la cepa de I. terricola 0621 fue activa en todos los vinos estudiados. Esta BGL hidrolizó precursores de tipo norisoprenoides (vomifoliol y 3-oxo-α-ionol) y algunos terpenos tales como cis-8-hidroxilinalool (Tannat y Moscatel) y geraniol (en Tannat). Los estudios sensoriales indicaron que los descriptores encontrados por el panel sensorial se correspondían con los resultados obtenidos mediante GC-MS. Es así que las notas destacadas a frutos secos y miel, característicos de norisoprenoides, concordaron con el análisis mediante GC-MS. El vino tratado con la enzima BGL I. terricola se distinguió incluso frente a los vinos tratados con la preparación comercial de glicosidasas de A. niger, con notas que los evaluadores calificaron como más agradables. Estos resultados obtenidos con la BGL I. terricola representan un hito en cuanto a la liberación de aromas en vinos. Sin embargo, la baja producción constitutiva de la enzima es una limitante para la aplicación enológica. Por lo tanto, se optimizaron las condiciones para la producción de la enzima, modificando los medios de cultivo nutrientes. En cultivos batch en Erlenmeyer, se logró el incremento de la producción de la enzima al doble en comparación a las condiciones utilizadas de rutina, y el proceso fue escalado a biorreactores en cultivos de tipo batch y batch alimentado. Si bien se logró mejorar la producción de actividad BGL, los resultados fueron insuficientes como para permitir una aplicación industrial. Por lo tanto, a continuación se abordaron estrategias de clonado y expresión de la enzima para viabilizar su uso. Visto que el genoma de I. terricola no se encontraba secuenciado, el primer abordaje fue el diseño de cebadores degenerados a partir de fragmentos peptídicos obtenidos del análisis de espectrometría de masas de la proteína pura. Mediante esa estrategia no fue posible hallar fragmentos coincidentes con BGLs reportadas en base de datos. A continuación, en el marco del proyecto FMV_1_2017_1_136574 se identificó la secuencia codificante, lo que permitió el clonado y su expresión en la cepa T73-4 de Saccharomyces cerevisiae. Esta cepa epresenta una alternativa muy promisoria para la producción de BGL I. terricola

Production and characterization of a β-glucosidase from Issatchenkia terricola and its use for hydrolysis of aromatic precursors in Cabernet Sauvignon wine

New enzymes isolated from the biodiversity of native wine ecosystems could contribute to increase the varietal character of regional wines. This study reports on the production and characterization of Issatchenkia terricola, beta-glucosidase and its potential to release red-wine aromatic compounds. The enzyme, a monomer of 48 kDa with an isoelectric point of 3.5 is tolerant to glucose and ethanol, properties compatible with enological use. Although fed-batch is usually the most suitable system for enzyme production in submerged culture, in this case the yield was practically the same as in batch culture. Enzyme productivity was increased 2-fold in synthetic medium with glucose with respect to the YPG and 3 to 8-fold with respect to other media assayed. After enzymatic treatment, GC-MS analysis of the released aglycones demonstrated significant increases in the concentration of phenols (83%) and norisoprenoids (65%). According to the judges of the sensory panel, the treatment resulted in a wine with dried fruits and raisins notes, as compared to the control, which was found more sweet and fruity. This, together with the lack of activity on anthocyanin glycosides, highlights the potential of this enzyme in enology, since its high selectivity allowed the development of aroma without compromising wine color.Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriale

Genome sequencing and oenologically relevant traits of the Uruguayan native yeast Issatchenkia terricola

Issatchenkia terricola 0621 is a non-Saccharomyces yeast strain isolated from Tannat grapes from Uruguayan vineyards; it stands out for its ability to produce high levels of β-glucosidase activity, which contributes to the aromatic complexity of wines. To delve into the potential oenological applications of this strain, its high-quality genome was obtained and explored, allowing the main central carbon and nitrogen metabolic pathways to be reconstructed. I. terricola is able to utilise glycerol as the sole carbon source in a way that has not previously been described for yeasts. The genes of the fermentome and those involved in stress resistance during winemaking were also identified, and differences were found when compared to S. cerevisiae, which may explain why I. terricola is unable to complete fermentation. The pathways responsible for natural aroma synthesis were also reconstructed, and the production of aromatic acids, alcohols, esters, acetates and lactones was verified experimentally. Finally, sequences encoding for β-glucosidases, in addition to the previously characterised one, were identified in the genome. The work presented here lays the groundwork for experimental research focused on the dissection of the metabolism of a native non-Saccharomyces strain and its application for oenological and biotechnological purposes.ANII: FMV_1_2017_1_13657

Informe final del proyecto: Obtención de una cepa de Saccharomyces cerevisiae productora de una beta-glucosidasa de Issatchenkia terricola y explotación del genoma de esta levadura nativa para la identificación de nuevas enzimas con potencial aplicación en enología

El desarrollo del aroma del vino depende en gran parte de la existencia durante la elaboración, de enzimas (glicosidasas) capaces de actuar eficientemente sobre los sustratos glicosídicos existentes, generando compuestos volátiles. Estudios previos de nuestro grupo con enzimas aisladas de la microbiota de viñedos uruguayos, demostraron que una beta-glucosidasa de la cepa Issatchenkia terrícola presenta propiedades muy promisorias en condiciones enológicas y se destaca por impartir características aromáticas propias a los vinos locales. Sin embargo, los bajos niveles producidos por la cepa autóctona constituyen una limitante para la manipulación y posible aplicación biotecnológica de dicha glucosidasa. Con el objetivo de clonarla y expresarla en Saccharomyces cerevsiae con mayor rendimiento, nos encontramos actualmente focalizados en obtener la secuencia de dicha glucosidasa mediante el diseño de cebadores degenerados, dado que no disponemos aún del genoma de I. terrícola. La cepa generada será utilizada en ensayos de microvinificaciones y análisis químico y sensorial de aromas de los vinos obtenidos. Complementariamente, se propone avanzar en la caracterización molecular mediante secuenciación masiva del genoma de I. terrícola. Esto permitirá identificar la presencia de otros genes codificantes para beta-glucosidasas así como otras glicosidasas. Asimismo, la interpretación del genoma permitirá identificar otras actividades enzimáticas con potencial interés biotecnológico. El proyecto implica el diseño y uso racional del potencial existente en la microbiota nativa enológica, integrando conocimientos desde un enfoque multidisciplinario desde las áreas de bioquímica, biología molecular, genómica y química de aromas. Los resultados podrían generar productos potencialmente transferibles a la industria enológica.Agencia Nacional de Investigación e Innovació

Immobilization on biomimetic silica nanoparticles as a highly effective strategy for the stabilization of Issatchenkia orientalis β-glucosidase in wine conditions

β-Glucosidases (BGLs) are key enzymes for the hydrolysis of glycosidic aroma precursors of wines. However, BGLs produced by oenological yeasts are often inactive or unstable at typical wine pH values. In this work, different immobilization strategies on biomimetic NPs were tested to enhance the stability of Issatchenkia orientalis BGL and compared with traditional methods on agarose and Eupergit. Immobilization to biomimetic silica NPs by ionic interactions proved to be the most efficient method to achieve enzyme stabilization in model wine at pH 4.0. In particular, the subsequent glutaraldehyde crosslinking, achieved a high immobilization efficiency (71%) with an outstanding stabilization factor of 240-fold with respect to the soluble enzyme. This enzyme derivative preserved practically all the activity (98%) after15 days in model wine supplemented with Muscat glycosides, making possible its application for the release of aroma compounds relevant to the typicity of wine

Informe final del proyecto: Obtención de una cepa de Saccharomyces cerevisiae productora de una beta-glucosidasa de Issatchenkia terricola y explotación del genoma de esta levadura nativa para la identificación de nuevas enzimas con potencial aplicación en enología

El desarrollo del aroma del vino depende en gran parte de la existencia durante la elaboración, de enzimas (glicosidasas) capaces de actuar eficientemente sobre los sustratos glicosídicos existentes, generando compuestos volátiles. Estudios previos de nuestro grupo con enzimas aisladas de la microbiota de viñedos uruguayos, demostraron que una beta-glucosidasa de la cepa Issatchenkia terrícola presenta propiedades muy promisorias en condiciones enológicas y se destaca por impartir características aromáticas propias a los vinos locales. Sin embargo, los bajos niveles producidos por la cepa autóctona constituyen una limitante para la manipulación y posible aplicación biotecnológica de dicha glucosidasa. Con el objetivo de clonarla y expresarla en Saccharomyces cerevsiae con mayor rendimiento, nos encontramos actualmente focalizados en obtener la secuencia de dicha glucosidasa mediante el diseño de cebadores degenerados, dado que no disponemos aún del genoma de I. terrícola. La cepa generada será utilizada en ensayos de microvinificaciones y análisis químico y sensorial de aromas de los vinos obtenidos. Complementariamente, se propone avanzar en la caracterización molecular mediante secuenciación masiva del genoma de I. terrícola. Esto permitirá identificar la presencia de otros genes codificantes para beta-glucosidasas así como otras glicosidasas. Asimismo, la interpretación del genoma permitirá identificar otras actividades enzimáticas con potencial interés biotecnológico. El proyecto implica el diseño y uso racional del potencial existente en la microbiota nativa enológica, integrando conocimientos desde un enfoque multidisciplinario desde las áreas de bioquímica, biología molecular, genómica y química de aromas. Los resultados podrían generar productos potencialmente transferibles a la industria enológica.Agencia Nacional de Investigación e Innovació