Transgenic resistance against Citrus tristeza virus (CTV) and analysis of the viral p23 protein as pathogenicity determinant in citrus

El virus de la tristeza de los cítricos (Citrus tristeza virus; CTV) es el agente causal de unas de las enfermedades virales de los árboles cítricos más devastadoras en el mundo. CTV está restringido al floema en su huésped cítrico natural, y ha desarrollado tres proteínas supresoras de silenciamiento que actúan a nivel intra-(p23 y p20) e intercelular (p20 y p25) para superar la fuerte defensa antiviral del huésped. La interferencia de RNA, una aproximación basada en el uso de dsRNA para desencadenar el silenciamiento de RNA, ha sido utilizada ampliamente para generar plantas transgénicas resistentes a virus. Considerando el importante papel de p23, p20 y p25 en la patogénesis de CTV, hemos transformado plantas de lima Mexicana con un vector intrón-horquilla que porta la secuencia completa en versión no traducible de los genes p25, p20, p23 y el extremo 3¿-UTR de la cepa T36 de CTV, para intentar silenciar su expresión en células infectadas. Se ha observado resistencia completa a la infección viral en tres líneas transgénicas, manteniéndose todas sus propagaciones asintomáticas y libres de virus tras ser inoculadas mediante injerto con CTV-T36, tanto en el portainjertos no transgénico como directamente sobre la variedad transgénica. La acumulación de siRNA derivados del transgén fue necesaria pero no suficiente para lograr resistencia frente a CTV en las plantas. Al inocular propagaciones de las líneas transgénicas inmunes con una cepa de CTV divergente, la resistencia fue parcialmente superada, destacando la importancia de la identidad de secuencia en el mecanismo subyacente a la interferencia de RNA. Este trabajo es el primero en que se consigue resistencia completa a CTV en un huésped cítrico muy sensible, actuando simultáneamente sobre los tres supresores virales de silenciamiento mediante interferencia de RNA. La proteína p23 codificada por el virus es además un importante factor de patogenicidad. La expresión ectópica de p23 en plantas de cítricos induce aberraciones fenológicas semejantes a síntomas de CTV. Para estudiar en más detalle el papel de p23 en la patogénesis de CTV, se ha sobre-expresado en lima Mexicana el gen p23 de CTV T36 y tres versiones truncadas del mismo bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Cauliflower mosaic virus). Solo la versión truncada, que expresa los aminoácidos del 1 al 157 (p23-¿157) indujo síntomas similares a los producidos por CTV, aunque más suaves que los inducidos por la expresión de la proteína p23 entera (209 aminoácidos), permitiendo delimitar la región responsable de la patogénesis de p23 en cítricos a un fragmento de 157 aminoácidos que incluye el dedo de zinc y los motivos básicos flanqueantes de la proteína. La actividad de p23 como supresor de silenciamiento de RNA en N. benthamiana se perdía en todos los mutantes de p23 probados, lo cual indica que la supresión de silenciamiento implica a la mayoría de las regiones de la proteína. Para profundizar más en el papel de p23 en la patogénesis, en un siguiente paso hemos restringido la expresión de transgenes derivados de p23 a células asociadas al floema de lima Mexicana mediante el uso del promotor especifico de floema del virus del moteado amarillo de la comelina (Commelina yellow mottle virus, CoYMV). Se transformó lima Mexicana con construcciones que portaban el gen p23 completo, ya sea de la cepa agresiva de CTV T36 o de la suave T317, o con un fragmento que comprende el dedo de zinc y los motivos básicos flanqueantes de la primera, todas ellas bajo el control bien del promotor de CoYMV o bien del promotor constitutivo 35S. La expresión de estas construcciones en el floema dio lugar a aberraciones semejantes a los síntomas específicos de CTV, pero no a los síntomas inespecíficos observados cuando se expresaba p23 de forma constitutiva. Por otra parte, la apariencia e intensidad de las aberraciones fenotípicas más notorias similares a síntomas inducidos por CTV generadas por la expresión específica en floema del gen p23 se relacionó positivamente con la agresividad de la cepa origen utilizada. Además, la expresión en tejidos floemáticos del fragmento de p23 que comprende el dominio de dedo de zinc y los motivos básicos flanqueantes fue suficiente para inducir síntomas semejantes a los producidos por la infección con CTV, confirmando así que la región N-terminal delimitada por los aminoácidos 1 y 157 podría determinar, al menos en parte, la patogénesis de CTV en lima Mexicana.Citrus tristeza virus (CTV) is the causal agent of one of the most devastating viral diseases of citrus trees in the world. CTV is phloem-restricted in natural citrus hosts, and has evolved three silencing suppressor proteins acting at intra- (p23 and p20) and inter-cellular level (p20 and p25) to overcome strong host antiviral defense in citrus. RNA interference (RNAi), an approach based on using dsRNA to trigger RNA silencing, has been widely used for generating transgenic plants resistant against viruses. Considering the important role of p23, p20 and p25 in CTV pathogenesis, we have transformed Mexican lime plants with an intron-hairpin vector carrying full untranslatable versions of genes p25, p20, p23 and the 3¿-UTR from the CTV strain T36, to attempt silencing their expression in CTV-infected cells. Complete resistance to viral infection was observed in three transgenic lines, with all their propagations remaining symptomless and virus-free after graft-inoculation with CTV-T36, either in the non-transgenic rootstock or directly in the transgenic scion. Accumulation of transgene-derived siRNAs was necessary but not sufficient for CTV resistance. Challenging immune transformants with a divergent CTV strain resulted in partial breakage of the resistance, stressing the importance of sequence identity in the underlying RNAi mechanism. This is the first evidence that it is possible to achieve full resistance to CTV in a highly sensitive citrus host by targeting simultaneously its three viral silencing suppressors through RNAi. The p23 protein encoded by the virus is additionally an important pathogenicity factor. Ectopic expression of p23 in transgenic citrus plants induces developmental aberrations resembling CTV symptoms. To explore in more detail the role of p23 in CTV pathogenesis, the p23 gene from CTV T36 and three truncated versions thereof under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter were used to transform Mexican lime. Only the truncated version expressing amino acids 1 to 157 (p23¿158-209) elicited CTV-like symptoms, similar to, albeit milder than, those incited by expressing the whole p23 protein (209 amino acids), thus delimiting the region responsible for p23 pathogenesis in citrus to a 157 amino acid fragment including the Zn finger and flanking basic motifs of the protein. RNA silencing suppressor activity of p23 in N. benthamiana was abolished by all mutants tested, indicating that silencing suppression involves most p23 regions. To better define the role of p23 in CTV pathogenesis, we next restricted the expression of p23-derived transgenes to phloem-associated cells in Mexican lime plants by means of using the phloem-specific promoter from Commelina yellow mottle virus (CoYMV). Constructions carrying the complete gene p23 from either the severe T36 or the mild T317 CTV strains, or a fragment comprising the zinc-finger and flanking basic motifs from the former, either under the control of the CoYMV promoter or the constitutive 35S promoter were used for genetic transformation of Mexican lime. Expression of these constructs in the phloem incited aberrations resembling CTV-specific symptoms, but not the unspecific symptoms observed when p23 was constitutively expressed. Moreover, appearance and intensity of the most notorious CTV-like phenotypic aberrations induced by the phloem-specific expression of the p23 gene were positively related with the aggressiveness of the source CTV strain used. Additionally, expression in phloem-tissues of the p23 fragment comprising the zinc-finger domain and flanking basic motifs was sufficient to induce CTV-like symptoms, corroborating that the N-terminal region (delimited by amino acids 1 and 157) determines, at least in part, CTV pathogenesis in Mexican lime.Soler Calvo, N. (2013). Transgenic resistance against Citrus tristeza virus (CTV) and analysis of the viral p23 protein as pathogenicity determinant in citrus [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/31631TESI

Diagnóstico genético ovocitario mediante análisis del primer corpúsculo polar

El desarrollo de nuevas tecnologías de cribado genético informa que la mayoría de la población es portadora, en heterocigosis, de alguna variante patogénica causante de enfermedades monogénicas; generando la mitad de sus gametos libres de la mutación y la otra mitad portadores. En el ámbito de la reproducción humana asistida, el diagnóstico molecular de los ovocitos permitiría seleccionar aquéllos libres de una variante patogénica particular, previamente a la fecundación; maximizando las probabilidades de obtener descendencia sana o portadora, según el escenario particular de cada pareja. Actualmente, el estudio molecular directo del ovocito fecundable no es posible, ya que su diagnóstico implica su compromiso en viabilidad. Alternativamente, la inferencia diagnóstica es posible mediante estudio del primer corpúsculo polar (CP1): una pequeña estructura, rodeada de membrana y con escaso citoplasma, localizada en el espacio perivitelino del ovocito maduro MII; es resultado de la primera división reduccional de la meiosis, presentando un haplotipo alélicamente complementario a la información contenida en el ovocito MII, con la que forma el genotipo de un individuo. El CP1 no participa en el proceso reproductivo y contiene, teóricamente, cromosomas homólogos; siendo haploide (n), y estando cada homólogo constituido por dos cromátidas hermanas (2C). El ovocito de prácticamente todas las especies de mamífero es ovulado en metafase de la segunda meiosis; permaneciendo en dicho secuestro hasta que el espermatozoide fecundante induzca la reanudación, culminación de la meiosis II, remodelación de la cromatina espermática y el inicio del desarrollo embrionario. La resolución de la meiosis ovocitaria comprende la segregación equitativa de las cromátidas hermanas, generando el segundo corpúsculo polar (CP2) y el pronúcleo materno (PNM); ambos conteniendo un haplotipo 23,X. Alternativamente al espermatozoide fecundante, un estímulo eficiente y artificial puede inducir la respuesta ovocitaria de activación sin participación espermática; permitiéndose la generación de constructos humanos uniparentales maternos o partenogenotas. El desarrollo partenogenético, aunque limitado y no dando en ningún caso gestaciones a término, progresa en las mitosis iniciales dando lugar a células, morfológicamente similares a las blastómeras, denominadas partenocitos. La presente tesis doctoral tiene como objetivo principal poner a punto y validar una metodología de test genético preconcepción (TGPC) ovocitario, en asociación a enfermedades monogénicas, mediante biopsia del CP1, empleando el modelo partenogenota. Para ello, planteamos como objetivos secundarios la puesta a punto de la metodología de biopsia de CP1 y valoración de su capacidad de inferencia diagnóstica mediante genotipado; cuantificación que requiere del análisis y estudio de las tríadas meióticas generadas por partenogénesis (CP1, CP2 y partenogenota o partenocito). Los ovocitos se obtuvieron de mujeres rechazadas del programa de donación de óvulos con fines reproductivos, debido a su condición de portadoras en heterocigosis de alguna variante patogénica conocida. Tras la estimulación ovárica controlada, los ovocitos se recuperaron, seleccionando un total de 279 MII. Un conjunto de 225 MII, obtenidos de 6 mujeres, se destinaron a la puesta a punto del protocolo de biopsia de CP1 (estudio 1); por su parte, 54 MII de dos donantes fueron empleados para la constitución y análisis genético de las tríadas meióticas (estudio 2). Estas tríadas analizadas proceden de ovocitos que fueron recuperados de la donante #7; una mujer sana, portadora en heterocigosis de la variante patogénica c.1345 C>T (p.Arg499Trp), localizada en el gen F9 y responsable de la hemofilia B. Por su parte, la donante #8 es una mujer sana, portadora igualmente en heterocigosis de la variante c.1521_1523delCTT o variante dF508 (p.Phe508delPhe), localizada en el gen CFTR y responsable de la fibrosis quística. A lo largo del primer estudio, el desarrollo técnico del protocolo de diagnóstico genético ovocitario mediante análisis del CP1 se ha llevado a cabo empleando ovocitos frescos. Actualmente, su aplicación requiere de la criopreservación individualizada de los ovocitos biopsiados a fin de preservar su viabilidad y competencia, en tanto que se obtienen los resultados moleculares. Adicionalmente, en este primer estudio, decidimos incluir ovocitos MII previamente criopreservados; como aquél posible escenario que incluyera mujeres que, habiendo preservado su fertilidad, solicitaran el diagnóstico genético de sus ovocitos. En este contexto, el estudio 1 incluyó ovocitos frescos biopsiados (grupo 1); biopsiados con posterior vitrificación (grupo 2) y control (grupo 3). Por lo que respecta a los ovocitos vitrificados, se aleatorizaron en 4 grupos: biopsiados (grupo 4); biopsiados con posterior vitrificación (grupo 5); control de una vitrificación (grupo 6); y control de dos rondas de vitrificación (grupo 7); estos dos últimos sin biopsia de CP1. La vitrificación individual de cada ovocito se realizó 2 horas después de la decumulación, o bien inmediatamente después de la biopsia de CP1, según la metodología de Cryotop®. Los ovocitos criopreservados fueron almacenados por un máximo de 15 días. Tras este tiempo, se desvitrificaron siguiendo también la metodología de Cryotop® y cultivados por 2 horas, momento en que se evaluó su supervivencia. La biopsia de CP1 se realizó mediante técnicas de micromanipulación 2 horas tras la decumulación en los ovocitos frescos o tras la desvitrificación en aquéllos criopreservados. En función del grupo experimental, 2 horas después de la desvitrificación o biopsia del CP1, el número de MII supervivientes fue registrado y artificialmente activados. La activación ovocitaria artificial (AOA) consistió en una incubación seriada en ionóforo de calcio (A23187, 5 minutos) y puromicina (5 horas). Transcurrido este tiempo, los ovocitos fueron individualmente cultivados en sistema time-lapse, a 37 ºC, 6% CO2 y 5% de O2 en aire y sin humedad. Tras 16-20 horas, se contabilizaron aquéllos ovocitos que además de haber expulsado el CP2 presentaban un único pronúcleo (1PN); respuesta de activación ovocitaria normal (NOAR). En el estudio 2, adicionalmente, se seleccionaron aquéllos ovocitos con NOAR para biopsiar el CP2, devolviendo a continuación el partenogenota al cultivo. En día 3 de desarrollo, el cultivo cesó y aquéllos partenogenotas que contuviesen 6 o más células y menos de un 15-20% de fragmentación fueron biopsiados y los partenocitos aislados. De cada partenogenota, 1-2 partenocitos se destinaron al análisis de ploidía mediante FISH y los restantes partenocitos fueron individualmente incluidos en tubos de PCR, al igual que sus respectivos CP1 y CP2. Las tríadas identificadas fueron remitidas al laboratorio de análisis genético para su genotipado, a fin de identificar el haplotipo asociado o no asociado a la variante patogénica en cada unidad de la tríada. En una primera fase del estudio 1, un total de 68 ovocitos frescos y 67 criopreservados fueron aleatoriamente asignados a los grupos experimentales. Todos los ovocitos procesados sobrevivieron a la biopsia del CP1 y, en promedio, 95,8% sobrevivieron a la vitrificación; independientemente de haber experimentado uno o dos procedimientos de criopreservación. Sin embargo, la vitrificación de ovocitos biopsiados supuso una merma significativa en las tasas de supervivencia, rindiendo en promedio un 50,9%, independientemente del origen fresco o vitrificado. Por su parte, la tasa de NOAR como variable diagnóstica de competencia ovocitaria fue variable en función del número de vitrificaciones más que de la aplicación adicional de la biopsia de CP. Los ovocitos frescos mostraron una media de NOAR del 70%, comparable en todos los grupos; lo que implica que la biopsia no ejerce ningún efecto sobre la tasa de activación. No obstante, el origen vitrificado de los ovocitos afecta a la tasa de NOAR; siendo más llamativa si se replica este proceso (50% vs. 88,9%; respectivamente). De los resultados obtenidos en esta primera fase del estudio 1 se deduce que: (i) las tasas de supervivencia ovocitaria a la vitrificación están fuertemente condicionadas por la previa biopsia del CP1; (ii) la aplicación de una segunda vitrificación no compromete la ulterior supervivencia ovocitaria; (iii) la biopsia de CP1 no afecta a la tasa de NOAR; (iv) el origen vitrificado de los ovocitos a biopsiar, aumenta las tasas de NOAR. En la segunda fase del estudio 1, se incluyeron algunas modificaciones en la metodología de biopsia y en el protocolo de AOA. El nuevo protocolo fue testado en 90 ovocitos; siendo 40 de ellos de origen fresco y 50 vitrificados. Concretamente, la modificación en el protocolo de biopsia de CP1 consistió en disminuir el tamaño del orificio practicado en la zona pelúcida de 20-25 µm a 10- 15 µm. Por su parte, la modificación en el protocolo de AOA conllevó una reducción en la concentración de ionóforo de calcio (A23187) de 8 µM a 6 µM. Estas modificaciones incrementaron notablemente la supervivencia de los ovocitos biopsiados a la vitrificación, pasando de un 50,9% a un 81,8%; no observándose modificaciones en la tasa de supervivencia en el resto de ovocitos criopreservados en origen experimentales (fase 1: 95,8% y fase 2: 87,8%). Por otro lado, aumentaron las tasas de NOAR en todos grupos, equiparándolas al grupo control; siendo la tasa de NOAR global del 80%. Así, de este primer estudio podemos concluir que hemos logrado con éxito poner a punto la metodología del TGPC ovocitario. El estudio 2 recogido en esta tesis doctoral tiene por objeto la validación del TGPC ovocitario, determinando la inferencia del contenido genético del ovocito a partir del análisis genético de las tríadas meióticas (CP1, CP2 y partenocitos). Para ello, realizamos un estudio de informatividad de las donantes #7 y #8. A tal efecto, se evaluó la idoneidad de la batería de marcadores genéticos disponible para el estudio de segregación alélica y definir las fases. Tras la confirmación y caracterización de la variante patogénica, se secuenciaron los loci interrogados; se desarrolló el protocolo molecular asociado al diagnóstico genético en célula única. Según la donante, el genotipado de las tríadas meióticas se llevó a cabo con diferentes protocolos moleculares. En las muestras procedentes de la donante #7, portadora de la variante patogénica en F9, se realizó una amplificación inespecífica de todo el genoma (WGA). A continuación, una amplificación específica por PCR mediante oligos de la variante de estudio rs757996262 y 2 polimorfismos, rs422187 y rs6048, localizados en el lado centromérico. Posteriormente, se realizó una amplificación específica en una primera PCR seguida de una amplificación para incluir los barcodes. Seguidamente se visualizaron los resultados y se realizó la secuenciación masiva, permitiendo proceder al genotipado de las muestras. Por otra parte, las muestras de la donante #8, portadora de la variante responsable de la fibrosis quística, se sometieron a una primera amplificación específica mediante PCR “heminested” de la región donde se encuentra la variante patogénica (dF508) y de los marcadores microsatélite informativos y flanqueantes a ella (D7S633, D7S677, IVS17bTA, IVS8CA, 25xAC, 30xAC, CFTR 18xAC), utilizando oligonucleótidos fluorescentes. A continuación, se realizó la electroforesis de las muestras y la detección fluorescente de los fragmentos obtenidos. Por último, se procedió al análisis bioinformático mediante un software específico. Además, también se realizó un análisis de microsatélites para control de ploidía en el cromosoma X (DXS8025, DXS1068) y 18 (D18S61, D18S1127). En este segundo estudio, la eficiencia global diagnóstica del CP1 depende de varios aspectos: el rendimiento técnico y el diagnóstico. En la donante #7, obtuvimos resultado genético de la tríada completa en 17 de los 25 ovocitos MII (rendimiento: 68%); un rendimiento superior al obtenido en la donante #8, donde 10 tríadas de 29 ovocitos MII tuvieron resultado genético completo (rendimiento: 34,5%). Estas diferencias en el rendimiento técnico parecen deberse a la diferente tasa de NOAR obtenida (96% en la donante #7 y 65,5% en la donante #8) o al fallo de amplificación genética (16% para la donante #7 y del 10% en el caso de la donante #8). Por lo que respecta al rendimiento diagnóstico, la posibilidad de inferir el haplotipo ovocitario mediante estudio del CP1, es fuertemente dependiente del grado de heterocigosidad de la región génica interrogada, habiéndose obtenido un 41,2% para el gen F9 y un 90% para el gen CFTR; resultando, en última instancia, la proporción esperada y observada de las variantes wild-type y patogénicas según los principios de segregación mendeliana. Las diferencias observadas en el grado de heterocigosidad pueden depender del protocolo de análisis molecular utilizado. No obstante, la detección de un CP1 heterocigoto puede atribuirse a la recombinación del alelo estudiado o bien a un patrón de segregación anómala, concretamente una separación precoz de las cromátidas hermanas en la meiosis I. El origen de esta heterocigosidad, si bien no puede esclarecerse con la aproximación molecular aquí ejecutada, creemos que la recombinación es el origen más probable. Debido a la elevada tasa de heterocigosidad del CP1, la inferencia del contenido genético del ovocito mediante el CP1 fue posible en poco más de la mitad de los ovocitos de la donante #7, rindiendo una sensibilidad y especificidad del 80%. Sin embargo, en la donante #8 solamente pudimos inferir el haplotipo ovocitario en un caso (10%) debido a la elevada tasa de heterocigosidad de CP1. Por tanto, aunque la biopsia y análisis de CP1 es técnicamente posible, el escaso rendimiento diagnóstico obtenido cuestiona su posible traslación clínica; siendo necesario completar dicha información con aquélla derivada del CP2. En nuestro caso particular, esta doble información aumentó la sensibilidad y especificidad a casi el 90%, para la donante #7; y el 100% para la donante #8. Finalmente, y consecuencia del estudio de la tercera unidad meiótica, planteamos una nueva estrategia: el estudio directo (y no por inferencia) del elemento partícipe de la fecundación en un nuevo formato, el partenocito. Tras la AOA y cultivo, los partenogenotas contienen una media de siete partenocitos; siendo el genotipo de todos ellos idéntico; resultando ser, a priori, réplicas del pronúcleo materno. De este modo, nos planteamos si la partenogénesis constituiría en sí misma un método de clonación gamética y, por tanto, un novedoso y transgresor abordaje de diagnóstico genético preconcepción, que permitiría seleccionar aquéllos orígenes maternos exentos de aneuploidías o con un determinado genotipo para una futura y ulterior fecundación.The development of new genetic screening technologies informs that the majority of the population is heterozygous carrier of some pathogenic variant causing monogenic diseases; generating half of their gametes free of the mutation and the other half carriers. In the field of assisted human reproduction, molecular diagnosis of oocytes would allow the selection of those free of a particular pathogenic variant prior to fertilization, maximizing the chances of obtaining healthy offspring or carriers, depending on the particular scenario of each couple. Currently, direct molecular study of the fertilizable oocyte is not possible, as its diagnosis implies its compromised viability. Alternatively, diagnostic inference is possible by studying the first polar body (PB1): a small structure, surrounded by membrane and with little cytoplasm, located in the perivitelline space of the mature MII oocyte; it is the result of the first reductional division of meiosis, presenting an allelic haplotype complementary to the information contained in the MII oocyte, with which it forms the genotype of an individual. PB1 does not participate in the reproductive process and theoretically contains homologous chromosomes; it is haploid (n), with each homologue chromosome consisting of two sister chromatids (2C). The oocyte of practically all mammalian species is ovulated in metaphase of the second meiosis; it remains in this sequestration until the fertilizing sperm induces the resumption, culmination of meiosis II, remodeling of the sperm chromatin and the beginning of embryonic development. Resolution of oocyte meiosis involves the equal segregation of sister chromatids, generating the second polar body (PB2) and the maternal pronucleus (PNM); both containing a 23,X haplotype. Alternatively to the fertilizing sperm, an efficient and artificial stimulus can induce the oocyte activation response without sperm involvement, allowing the generation of uniparental maternal or parthenogenetic human constructs. Parthenogenetic development, although limited and never giving rise to full-term pregnancies, progresses in early mitosis to give rise to cells, morphologically similar to blastomeres, named parthenocytes. The main objective of this PhD thesis is to develop and validate an oocyte preconception genetic test methodology, in association with monogenic diseases, by means of PB1 biopsy, using the parthenogenetic model. To this end, we set as secondary objectives the development of the PB1 biopsy methodology and assessment of its diagnostic inference capacity by genotyping; quantification that requires the analysis and study of the meiotic triads generated by parthenogenesis (PB1, PB2 and parthenogenote or parthenocyte). The oocytes were obtained from women rejected from the egg donation programme for reproductive purposes, due to their status as heterozygous carriers of a known pathogenic variant. After controlled ovarian stimulation, the oocytes were retrieved, selecting a total of 279 MII. A set of 225 MII, obtained from 6 women, were used for the development of the PB1 biopsy protocol (study 1); 54 MII from two donors were used for the constitution and genetic analysis of the meiotic triads (study 2). These analyzed triads came from oocytes recovered from donor #7; a healthy woman, heterozygous carrier of the pathogenic variant c.1345 C>T (p.Arg499Trp), located in the F9 gene and responsible for hemophilia B. Donor #8 is a healthy woman, also a heterozygous carrier of the c.1521_1523delCTT or dF508 variant (p.Phe508delPhe), located in the CFTR gene and responsible for cystic fibrosis. Throughout the first study, the technical development of the oocyte genetic diagnosis protocol using PB1 analysis has been carried out using fresh oocytes. Currently, its application requires individualized cryopreservation of the biopsied oocytes in order to preserve their viability and competence, while molecular results are obtained. Additionally, in this first study, we decided to include previously cryopreserved MII oocytes; as a possible scenario that included women who, having preserved their fertility, requested genetic diagnosis of their oocytes. In this context, study 1 included fresh biopsied oocytes (group 1); biopsied with subsequent vitrification (group 2) and control (group 3). As for the vitrified oocytes, they were randomized into 4 groups: biopsied (group 4); biopsied with subsequent vitrification (group 5); control of one vitrification (group 6); and control of two rounds of vitrification (group 7); the latter two without PB1 biopsy. Individual vitrification of each oocyte was performed 2 hours after decumulation, or immediately after PB1 biopsy, according to Cryotop® methodology. Cryopreserved oocytes were stored for a maximum of 15 days. After this time, they were devitrified and cultured for 2 hours, at which time their survival was assessed. PB1 biopsy was performed by micromanipulation techniques 2 hours after decumulation in fresh oocytes or after devitrification in cryopreserved oocytes. Depending on the experimental group, 2 hours after devitrification or biopsy of PB1, the number of surviving MII was recorded and artificially activated. Artificial oocyte activation (AOA) consisted of a serial incubation in calcium ionophore (A23187, 5 minutes) and puromycin (5 hours). After this time, oocytes were individually cultured in a time-lapse system, at 37 °C, 6% CO2 and 5% O2 in air and no humidity. After 16-20 hours, those oocytes that extruded the PB2 and showed a single pronucleus (1PN) were counted; normal oocyte activation response (NOAR). In study 2, oocytes with NOAR were additionally selected for biopsy of PB2 and the parthenogenote was then returned to culture. On day 3 of development, those parthenogenotes containing 6 or more cells and less than 15-20% fragmentation were biopsied and the parthenocytes isolated. From each parthenogenote, 1-2 parthenocytes were destined for ploidy analysis by FISH and the remaining parthenocytes were individually included in PCR tubes, as were their respective PB1 and PB2. The identified triads were submitted to the genetic analysis laboratory for genotyping to identify the haplotype associated or not associated with the pathogenic variant in each triad unit. In a first phase of study 1, a total of 68 fresh and 67 cryopreserved oocytes were randomly assigned to the experimental groups. All processed oocytes survived PB1 biopsy and, on average, 95.8% survived vitrification; irrespective of having undergone one or two cryopreservation procedures. However, vitrification of biopsied oocytes resulted in a significant decrease in survival rates, yielding on average 50.9%, regardless of fresh or vitrified origin. The NOAR rate as a diagnostic variable for oocyte competence was variable according to the number of rounds of vitrification rather than the additional application of PB1 biopsy. Fresh oocy

El turismo activo en el río Mijares: Propuesta de Planificación Sostenible

Treball Final de Grau en Turisme. Codi: TU0944. Curs acadèmic: 2019/202

Fly ash reactivity modified by nitrogen and sulfur compounds

The inhibitory effect of thiourea (TUA), ammonium thiosulfate (TSA) and amidosulfonic acid (ASA) on the reactivity of fly ash air was investigated using a thermobalance at different heating rates (5, 10 and 20 K min-1). A model fly ash (activated carbon + 50 wt.% CuCl2·2H2O, pyrolyzed at 700 ºC and washed) was used as carbonaceous material. Adding CuCl2·2H2O to the activated carbon led to an increased rate of decomposition with the air’s oxygen. TUA and TSA behaved in a similar way, accelerating the decomposition of the model fly ash. ASA also accelerated the decomposition but to a lower extent. We proof that the increase in decomposition rate is caused by a reaction between carbonaceous material and N- and S-containing compounds. The formation of nitrogenated and sulphured compounds was confirmed by TG-MS. A kinetic model based on a single reaction of order 0.6 showed very good correlations with all the heating rates tested in oxidant atmosphere.This work was supported by the CTQ2016-76608-R project from the Ministry of Economy, Industry and Competitiveness (Spain), and the UAUSTI17-07 grant from University of Alicante (Spain)

Atención farmacéutica en pacientes ostomizados

Objetivo. Se analiza el alcance que la atención farmacéutica (AF) supone en pacientes ostomizados incluyendo el análisis de disponibilidad a pagar por el paciente en caso de recibir ayuda en la oficina de farmacia (OF). Material y Método. Estudio observacional de tipo transversal descriptivo. Pacientes intervenidos quirúrgicamente con ostomía digestiva de eliminación y/o urinaria. El estudio fue realizado en hospitales andaluces donde está implantado el modelo EPA. Muestra aleatoria de 146 individuos. Variables estudiadas: Utilización de la atención farmacéutica mediante una escala likert de 5 puntos incluyendo la disponibilidad a pagar. Resultados Un 29% de los pacientes declaran haber tenido escasez o falta en alguno de los productos y el 71% tienen reserva de algún producto en su hogar. Respecto a la AF recibida la puntuación de experiencia global fue de 3,93 (DE: 0,91). Más del 58,3% de los pacientes opinaron que en la OF no reciben ayuda adecuada sobre complicaciones y necesidades (incluyendo recomendaciones dietéticas – 68,4%), debido a 2 causas: falta de tiempo y de conocimiento. El 27,2% de los pacientes estarían dispuestos a pagar por recibir atención e información adecuada entre 5-10€ por consulta, el 9,2% entre 10-15€, el 8,1% entre 15-20€ y el 8,1% más de 20€. La media de la disponibilidad a pagar es de 6,22€ por consulta (DE: 6,9). Conclusión. Una AF de calidad es necesaria y debe servir para generar evidencia para implementar y evaluar la longitudinalidad del proceso en ostomía.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Management of post-transplant diabetes mellitus: an opportunity for novel therapeutics

Post-transplant diabetes mellitus (PTDM) is a common problem after kidney transplantation (KT), occurring in 50% of high-risk recipients. The clinical importance of PTDM lies in its impactas a significant risk factor for cardiovascular and chronic kidney disease (CKD) after solid organ transplantation. Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) has recently updated the treatment guidelines for diabetes management in CKD with emphasis on the newer antidiabetic agents such as dipeptidyl peptidase-4 inhibitors, glucagon-like peptide-1 receptor agonists and sodium-glucose co-transporter 2 inhibitors as add-on therapy to metformin. Given all these new diabetes treatments and the updated KDIGO guidelines, it is necessary to evaluate and give guidance on their use for DM management in KT recipients. This review summarizes the scarce published literature about the use of these new agents in the KT field. In summary, it is absolutely necessary to generate evidence in order to be able to safely use these new treatments in the KT population to improve blood glucose control, but specially to evaluate their potential cardiovascular and renal benefits that would seem to be independent of blood glucose control in PTDM patients

Estudio de los egresados de los programas de máster en economía de la salud en España

To identify the characteristics, motivations and employment implications among graduates ofMasters programmes in health-economics (MPHE). The main motivation for undertaking an MPHE is academic, and to acquire new or enhance pre-vious knowledge. The general profile of graduates is that of a woman aged 37.8 and a health professional.Those looking for a job in Health Economics generally found employment in the first (54.9%) or secondyear (29.7%). MPHE were very highly assessed. The most useful subject was health management (46.3%). Undertaking an MPHE is a good investment because most of the graduates believed that theirtraining enabled them to find a job. The graduates showed a high degree of confidence in the usefulnessof the training. MPHE are highly evaluated irrespective of consequent employment. The subjects in whichthe curriculum vitae of the health professionals were weaker, such as those concerning management,were evaluated the highest as they were assumed to enhance promotion opportunities.Objetivo: Identificar las características, las motivaciones y las implicaciones laborales que aparecen entrelos egresados de programas de máster en economía de la salud (PMES).Método: Se solicitó colaboración a los másteres más relevantes de Espa˜na para esta investigación. Los par-ticipantes completaron un cuestionario on line de 30 ítems específicamente dise˜nado para este propósito.La muestra estuvo formada por 439 egresados. Se realizaron diferentes análisis estadísticos, incluyendomodelos logísticos.Resultados: La principal motivación para hacer un PMES es la académica. Las personas lo hacen con el finde adquirir nueva formación o mejorar conocimientos previos. El perfil general de egresado es el de unamujer de 37,8 a˜nos, profesional sanitaria. Las personas que buscaban trabajo en economía de la salud loencontraron principalmente en el primer (54,9%) o segundo (29,7%) a˜no. La valoración de los PMES esmuy elevada. La materia más útil fue gestión sanitaria (46,3%).Conclusiones: Hacer un PMES es una buena inversión porque la mayoría de los egresados consideran queobtuvieron un empleo gracias a su formación. Los graduados muestran un alto grado de confianza en lautilidad de la formación. Los PMES son altamente valorados independientemente de las consecuenciaslaborales. Las materias en las que los curricula vitae de los sanitarios son más débiles, como las relativasa gestión, son las mejor valoradas, ya que suponen mejores oportunidades de promoción.We have received a grant of the Chair in Health Economics andRational Use of Medicine University of Málaga-Janssen to pay thefee for publishing this paper

Consensus, dissension and precision in group decision making by means of an algebraic extension of hesitant fuzzy linguistic term sets

Present measures of the degree of agreement in group decision-making using hesitant fuzzy linguistic term sets allow consensus or agreement measurement when decision makers’ assessments involve hesitance. Yet they do not discriminate with different degrees of consensus among situations with discordant or polarized assessments. The visualization of differences among groups for which there is no agreement but different possible levels of disagreement is an important issue in collective decision-making situations. In this paper, we propose new collective and individual consensus measures that explicitly consider the hesitance of the decision makers’ hesitance in giving an opinion and also the gap between non-overlapping assessments, thus allowing the measurement of the polarization present within the group's opinions. In addition, an expert's profile is defined by considering the expert's behavior in previous assessments in group decision-making processes in terms of precision and dissension.Peer ReviewedPostprint (author's final draft

Increase of burnout among emergency department professionals due to emotional exhaustion during the SARS-Cov2 pandemic: Evolution from 2016 to 2021

The objective is to establish there have been any significant changes in the evolution of levels of burnout and empathy at the different Emergency Department in our region, bearing the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 pandemic. This cross-sectional observational study was conducted in a healthy region between November 2020 and January 2021. Lleida emergency care centers. All the doctors and nurses of the health were contacted by email. Empathy was measured using the Spanish version of the Jefferson scale of physician empathy. Burnout was measured using the Maslach Burnout Inventory (MBI) in the version validated in Spanish. Sociodemographic data were also recorded. We compared the data with 2016 results. A total of 159 professionals agreed to participate in this study. A significant increase in the MBI score was observed in the 2020 to 2021 sample (39.5 vs 49.7), mostly due to an increase in the MBI-EE (21.5 vs 28.5), as well as an increase in the Jefferson scale of physician empathy score (112 vs 116). (P = .039). There were no differences when analyzing the association between professions (nurses or doctors) or years worked, burnout, and empathy. For 2020 to 2021, the 41 to 50 years age group showed the highest burnout (MBI score). Emergency department practitioners suffered more burnout compared to 2016, especially due to emotional exhaustion (P < .001). Despite practitioners’ improved degree of empathy, which had been described as being preventative against burnout, during the COVID-19 pandemic, over-involvement may have led to empathic stress and emotional exhaustion, giving rise to greater burnout

Study protocol on social return on investment (SROI) project of the surgical waiting list management system

In Andalusia, the right to maximum waiting times for healthcare clashes with the available supply, leading to an increase in demand in the form of waiting lists. To address this situation, the activity of private centers has been created for certain diagnostic tests. The Social Return on Investment (SROI) model evaluates an intervention from an economic and stakeholder perspective. However, there are no studies on the suitability of waiting lists using SROI, which is why it is intended to be studied as a decision-making tool for the clinical and healthcare management of waiting lists. This research protocol is designed to determine the quality of life gained, with the EuroQol-5D-5L questionnaire, and its social assessment, with the specific survey of the SROI method, and, thus, analyze the social return on investment and determine the suitability of the intervention (diagnostic endoscopy activity arranged in a contracted center). After the study, we will know the economic (cost in public health centers and the incremental cost of extraordinary health resources), social (quality of life with health), and environmental scenarios of the concerted activity intervention in order to adjust waiting list timesPartial funding for open access charge: Universidad de Málag