Linking Process, Product and Performance by Raman Imaging Analysis

This work aims at exploring two applications of Raman spectroscopy in the development and manufacturing of pharmaceutical tablets made from amorphous solid dispersions (ASDs), in terms of both physical and chemical properties. The first application consisted on applying Raman spectroscopy to predict the tablets’ hard-ness. In contrast to typical destructive hardness testing, this strategy can be implemented as at-line and real-time process control via process analytical technology and thus provide real-time release during continuous manufacturing. This is investigated here for the first time for tablets composed of ASDs rather than crystalline-based formulations using a Confocal Raman Micro-scope. The generated data show an apparent relationship between the measured hardness and the Raman spectra baseline, consistent with previous findings in the literature. However, a more stringent analysis leads to the conclusion that the trend line is not strictly monotonic and with a slope across the measured range comparable to the variability of the Raman imaging analysis. The second application consisted on exploring the potential of confocal Raman microscopy to provide spatially resolved chemical images of the tablets’ surface, which allows to characterize the components spatial distribution. The goal was to evaluate the impact of two process param-eters: blending shear rate and sieving mesh size. These parameters were investigated using a structured 2-level design of experiments where Confocal Raman microscopy allowed the evalu-ation of the spatial distribution and the detection of API agglomerates and its relationship with the process parameters. However, the analysis was hindered by a lack of a perfectly flat surface of the tablets and to correct the influence of the change in focus on the Raman spectra, post-pro-cessing scripts were implemented. It is shown that there is an impact of both process parameters on the heterogeneity of tablets’ surface and, consequentially, a significant impact in disintegration of the tablets

Open-domain web-based multiple document : question answering for list questions with support for temporal restrictors

Tese de doutoramento, Informática (Ciências da Computação), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015With the growth of the Internet, more people are searching for information on the Web. The combination of web growth and improvements in Information Technology has reignited the interest in Question Answering (QA) systems. QA is a type of information retrieval combined with natural language processing techniques that aims at finding answers to natural language questions. List questions have been widely studied in the QA field. These are questions that require a list of correct answers, making the task of correctly answering them more complex. In List questions, the answers may lie in the same document or spread over multiple documents. In the latter case, a QA system able to answer List questions has to deal with the fusion of partial answers. The current Question Answering state-of-the-art does not provide yet a good way to tackle this complex problem of collecting the exact answers from multiple documents. Our goal is to provide better QA solutions to users, who desire direct answers, using approaches that deal with the complex problem of extracting answers found spread over several documents. The present dissertation address the problem of answering Open-domain List questions by exploring redundancy and combining it with heuristics to improve QA accuracy. Our approach uses the Web as information source, since it is several orders of magnitude larger than other document collections. Besides handling List questions, we develop an approach with special focus on questions that include temporal information. In this regard, the current work addresses a topic that was lacking specific research. A additional purpose of this dissertation is to report on important results of the research combining Web-based QA, List QA and Temporal QA. Besides the evaluation of our approach itself we compare our system with other QA systems in order to assess its performance relative to the state-of-the-art. Finally, our approaches to answer List questions and List questions with temporal information are implemented into a fully-fledged Open-domain Web-based Question Answering System that provides answers retrieved from multiple documents.Com o crescimento da Internet cada vez mais pessoas buscam informações usando a Web. A combinação do crescimento da Internet com melhoramentos na Tecnologia da Informação traz como consequência o renovado interesse em Sistemas de Respostas a Perguntas (SRP). SRP combina técnicas de recuperação de informação com ferramentas de apoio à linguagem natural com o objetivo de encontrar respostas para perguntas em linguagem natural. Perguntas do tipo lista têm sido largamente estudadas nesta área. Neste tipo de perguntas é esperada uma lista de respostas corretas, o que torna a tarefa de responder a perguntas do tipo lista ainda mais complexa. As respostas para este tipo de pergunta podem ser encontradas num único documento ou espalhados em múltiplos documentos. No último caso, um SRP deve estar preparado para lidar com a fusão de respostas parciais. Os SRP atuais ainda não providenciam uma boa forma de lidar com este complexo problema de coletar respostas de múltiplos documentos. Nosso objetivo é prover melhores soluções para utilizadores que desejam buscar respostas diretas usando abordagens para extrair respostas de múltiplos documentos. Esta dissertação aborda o problema de responder a perguntas de domínio aberto explorando redundância combinada com heurísticas. Nossa abordagem usa a Internet como fonte de informação uma vez que a Web é a maior coleção de documentos da atualidade. Para além de responder a perguntas do tipo lista, nós desenvolvemos uma abordagem para responder a perguntas com restrição temporal. Neste sentido, o presente trabalho aborda este tema onde há pouca investigação específica. Adicionalmente, esta dissertação tem o propósito de informar sobre resultados importantes desta pesquisa que combina várias áreas: SRP com base na Web, SRP especialmente desenvolvidos para responder perguntas do tipo lista e também com restrição temporal. Além da avaliação da nossa própria abordagem, comparamos o nosso sistema com outros SRP, a fim de avaliar o seu desempenho em relação ao estado da arte. Por fim, as nossas abordagens para responder a perguntas do tipo lista e perguntas do tipo lista com informações temporais são implementadas em um Sistema online de Respostas a Perguntas de domínio aberto que funciona diretamente sob a Web e que fornece respostas extraídas de múltiplos documentos.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), SFRH/BD/65647/2009; European Commission, projeto QTLeap (Quality Translation by Deep Language Engineering Approache

Ansiedade aos testes: uma leitura à luz do modelo cognitivo de Clark e Wells para a perturbação de ansiedade social

Dissertação de mestrado em Psicologia Clínica e Saúde (Intervenções Cognitivo-Comportamentais nas Perturbações Psicológicas e da Saúde), apresentada à Faculdade de Psicologia e Ciências da Educação da Universidade de Coimbra.A ansiedade aos testes, altamente prevalente e interferente no desempenho de adolescentes em contexto escolar, não está contemplada como uma perturbação de ansiedade e não existem critérios específicos para a definir. Enquanto alguns autores a formulam como um subtipo específico de perturbação de ansiedade social (PAS), tendo por base o medo da avaliação negativa, outros consideraram-na uma fobia específica e, outros ainda, uma dimensão transdiagnóstica. Do nosso conhecimento, não existem ainda estudos no sentido de verificar se os fatores preconizados por qualquer modelo conceptual para a PAS estão ou não presentes na ansiedade aos testes e se contribuem ou não para a sua manutenção. Assim, o presente estudo pretendeu explorar se os fatores preconizados pelo modelo de Clark e Wells (1995) – processamento antecipatório, situacional e pós-situacional, atenção auto-focada, comportamentos de segurança e sintomas somáticos – estariam presentes em situações de teste. A amostra foi constituída por 338 adolescentes entre os 13 e os 18 anos (M = 16.23; DP = 1.38), que completaram voluntariamente um conjunto de questionários de autorresposta. Os resultados permitiram concluir que todas as variáveis preconizadas pelo modelo de Clark e Wells tiveram correlações positivas, significativas e de magnitude moderada a elevada com a ansiedade aos testes. Cada uma destas variáveis revelou, separadamente, ter um poder preditor significativo da ansiedade aos testes. Em conjunto, estas variáveis explicaram 73.7% da ansiedade aos testes. Sendo o único estudo do género, estes resultados poderão constituir um contributo importante para a discussão da classificação da ansiedade aos testes e apontam para a possibilidade de aplicação deste modelo na compreensão e intervenção nesta condição.Test anxiety, a highly prevalent and interfering condition in adolescents’ academic performance, is not classified as an anxiety disorder and there is no specific criteria to define it. Although some authors frame it as a specific subtype of social anxiety disorder (SAD), stating that its main feature is the fear of negative evaluation, some considered it a specific phobia, and others a transdiagnostic dimension. Nevertheless, from our knowledge, studies have not yet verified if, in fact, the factors included in any conceptual model of SAD also occur in test anxiety, and if they contribute or not to its maintenance. Therefore, the aim of the present study was to explore if the factors described in Clark and Wells model (1995) – anticipatory, situational and post-event processing, self-focused attention, safety behaviors and somatic symptoms – would also occur in test situations. The sample consisted of 338 adolescents aged between 13 and 18 (M = 16.23; SD = 1.38), who voluntarily completed several self-report questionnaires. Results led to conclude that all the variables defined by Clark and Wells model had positive, significant and moderate to high correlations with test anxiety. Each one of these variables showed, separately, having a significant predictive power over test anxiety. Taken together, these variables explained 73.7% of test anxiety. Being the only study on this subject, these results may play an important role in the discussion of test anxiety classification and point out to a possible application of this model in understanding and treating this condition

Microplastic contamination in Argentina: insights about a source (wastewater treatment plant) and a sink (beach): 2 case studies

Mestrado em Engenharia do Ambiente - Instituto Superior de AgronomiaMicroplastics (MPs) are a contaminant which due to its ubiquitous nature is spread all over the world, reaching all the ecosystems and remote places. Since it’s a recent topic in the scientific community and its elimination is still a challenge, it’s important to access its concentration worldwide and monitoring. Some countries don’t have or have scarce data about it. Argentina, which comprises a long Atlantic coast and manages one of the major estuaries of South America is highly susceptible to release and transport MPs, but its concentration hasn’t been broadly studied yet. This thesis aims to contribute to filling the existent knowledge gap by presenting two case studies: one representing a sink for Potential Microplastics (PMPs), three beaches from Villa Gesell (Great Buenos Aires); and a source, a communitarian Wastewater Treatment Plant (WWTP) in the Great Buenos Aires area, to understand the transport of PMPs to the environment. PMPs were quantified and classified optically by its shape and colour. In Villa Gesell, PMPs were investigated in three different beaches with different anthropogenic loads, ranging from 46.0±34.8 (SD) to 86.2±66.1 PMPs.Kg-1 dry sand. No relation was observed between the amount of PMPs with anthropogenic load, wracklines, sand-size grain, and organic content. In WWTP, the concentration of PMPs in the influent was 12587±3073 PMPs.L-1 and it’s suggested that lagoon system and secondary settler could remove PMPs. However, still releases to the aquatic ecosystem an amount of 9.1x109 PMPs.day-1. Since the PMPs were not eliminated, they remained in the sludge, reaching an amount of 2.7x105±2.9x105 PMPs.kg-1 of dry sludge. The results from this thesis show the importance of assessing PMPs to understand the dimension of the contamination, bring awareness on this problem that can have serious consequences to the biota, and motivate the development of strategies to eliminate this contaminantN/

Integration of culture- and molecular-based water quality monitoring tools to protect human health

Monitoring and improving the microbiological quality and safety of surface waters used for various purposes, including drinking water abstraction and recreation is paramount as degradation may pose a serious risk to human health and cause significant economic losses as a result of the closure of beaches and shellfish harvesting areas. With the aim of providing new knowledge and tools with which to manage more effectively faecal contamination of water resources, this study focused on three goals: 1) determining the fate and suitability of new bioindicators for virus removal during wastewater treatment; 2) elucidating the levels and sources of faecal pollution in the River Tagus (Rio Tejo) using a blend of newly-developed and existing microbial source tracking (MST) markers; and 3) critically evaluating various pretreatments to distinguish between infectious and non-infectious viruses. To this end, raw and treated wastewater were collected and tested for the presence of traditional faecal indicator bacteria (FIB), and four viral bio-indicators (namely, somatic coliphages (SC), GB124 phages, human adenovirus (HAdV) and JC Polyomavirus (JCPyV)). In order to demonstrate whether the novel bio-indicators might be suitable indicators of risk to human health, Norovirus genogroup II (NoVGII) were also analysed, in parallel. FIB, SC and GB124 phages were analysed using standardised culture methods (membrane filtration and plaque assays) and HAdV, JCPyV and NoVGII were analysed using widely used molecular (qPCR) methods. Samples of river water were collected over a thirteen-month period and analysed for both non source-specific indicators of faecal contamination (Escherichia coli (EC), intestinal enterococci (IE), and SC) and source-specific contamination markers ((GB124 phages, HAdV) and four mitochondrial DNA markers (HMMit, CWMit, PigMit and PLMit)). EC, IE, SC and GB124 phages were detected by culture methods and HAdV and mitochondrial markers were detected by molecular (qPCR) methods. Furthermore, domestic animal markers (based on the detection of mitochondrial DNA) were also developed for dog and cat and tested during the catchment study. Finally, in order to determine accurately the level of risk to human health, heat-, chlorine-, and UV-inactivated Enterovirus and Mengovirus were subjected to PCR pre-treatments using enzymatic digestion and viability dyes, in order to determine infectivity. Detection of inactivated Mengovirus (MC0) was performed by RT-qPCR and detection of inactivated Enterovirus (EntV) was performed by both RT-qPCR and cell culture. The results demonstrated that the traditional bacterial indicators (FIB) were more effectively removed during wastewater treatment than GB124 phages, SC, HAdV and JCPyV, the removal levels of which were more similar to those of NoVGII. Spearman’s correlation showed that SC and GB124 phages correlated positively with NoVGII at a relatively high level and that HAdV and EC correlated positively at a moderate level. Discriminant analysis revealed that whilst no organism could predict the presence or absence of NoVGII in treated wastewater, GB124 phages in combination with other parameters did result in higher percentages of correct classification. GB124 phages plus HAdV appeared to be good candidates as alternative indicators of enteric virus removal during wastewater treatment. Results from the catchment study demonstrated that certain sites on the River Tagus are relatively highly impacted by faecal contamination (as indicated by EC, IE and SC concentrations). Moreover, the MST markers revealed that this contamination appears to be not only of human origin, but also originates from a range of other animal sources. The HMMit marker was the most prevalent and was found at the highest mean concentrations, followed by the CWMit marker. Two-way ANOVA revealed a correlation between concentrations of non source-specific indicators (and the CWMit marker) and season. Physico-chemical parameters, such as temperature and UV radiation, were found to be related to to levels of the CWMit, EC, IE, and SC. Interestingly, rainfall levels were found to be related to concentrations within the river of the PLMit marker and of the newly-developed dog and cat markers. Weak to no correlations were found between non source-specific indicators and the various MST markers, providing further evidence that these faecal indicators were unsuitable for determining the source(s) of contamination in this study. In contrast, the relatively high sensitivity and specificity of the mitochondrial DNA markers supported their use as appropriate markers of the origin of faecal contamination in this scenario. The results from the viral infectivity study demonstrated that results of ‘viability PCR’ (involving viability dyes) of chlorine- and UV-treated viruses did not correlate with those from cell culture assay. However, data from RNase-RT-qPCR from chlorine- and UV-inactivated viruses were consistent with the cell culture assay, achieving full PCR signal reduction in several instances. Heat treatment appeared to play an important role, since a significant reduction in the RT-qPCR signal was achieved. Different pre-treatments were able to achieve full removal of RT-qPCR signal for non-infectious heat-treated EntV and MC0. Therefore, enzymatic treatment may represent a rapid and inexpensive tool for discriminating between infectious and non-infectious viruses and as such should improve understanding of risks to human health. This research has demonstrated that the currently-used methodologies and approaches to assess the potential human health impact of wastewater discharges to environmental waters are limited in their ability to predict the prevalence of important agents of human waterborne disease. Furthermore, these findings provide evidence to support the development and application of alternative and potentially more effective approaches, which could better protect human health in the future

Variability in growth and condition of juvenile common two-banded sea bream (Diplodus vulgaris)

Tese de mestrado. Biologia (Ecologia Marinha). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015The objective of this study was to assess the variability in condition for juvenile common two-banded sea bream Diplodus vulgaris in nursery areas of the main Portuguese estuaries using several individual condition indices. Estuaries and coastal lagoons play an important role for juveniles of marine fish because they offer areas with high availability of food, high water temperature and lower predation. These characteristics permit a fast and safe growth of fish until they reach adequate size to return to the ocean and to join adult populations. In this study, two indices estimated by analysis of otolith microstructure were used: widths of the 10 last and of the 60 first daily increments were considered as recent growth index and initial growth index, respectively. Furthermore, two common condition indices were also used: biochemical RNA:DNA ratio, that assesses nutritional status of individuals, and morphometric Fulton's K, that gives an estimate of general well-being of individuals. Since recent growth index and RNA:DNA ratio were significantly related with total length of individuals, a correction was performed and corrected condition indices recent growth’ index and RNA:DNA’ ratio were considered. Fulton's K was also significantly related with total length of juveniles and for this reason was replaced by condition factor K', which considers allometry in the growth of fish. Condition factor K' was considered in the study. A significant positive correlation between recent growth’ and initial growth indices was obtained. Results of the multiple regression analyses seem to reflect the discrepancy in the response times of the different condition indices used. In general, Sado, Ria Formosa and Guadiana provided juveniles in better individual condition. Future studies should be done to better investigate relationships between condition indices and between condition indices and environmental variables, focusing on the link between individual condition and habitat quality of nursery areas.O objetivo deste estudo foi avaliar a condição dos juvenis de sargo-safia, Diplodus vulgaris, em áreas de viveiro dos principais estuários da costa Portuguesa, utilizando vários índices de condição individual. Os estuários e lagoas costeiras desempenham uma função importante para os juvenis de muitas espécies de peixes marinhos porque oferecem elevada disponibilidade de alimento, águas quentes e menor pressão predatória. Estas caraterísticas permitem que os juvenis cresçam rapidamente e em segurança até atingirem dimensões suficientes para regressar ao mar e recrutar para as populações adultas. Neste estudo, foram usados dois índices baseados na análise da microestrutura dos otólitos: as larguras dos 10 últimos e dos 60 primeiros incrementos diários foram considerados como um índice de crescimento recente e um índice de crescimento inicial, respetivamente. Além disso, foram considerados o rácio bioquímico ARN:ADN, que estima o estado nutricional dos indivíduos, e o morfométrico K de Fulton, que avalia o bem-estar geral dos indivíduos. Uma vez que o índice de crescimento recente e o rácio ARN:ADN apresentaram uma relação significativa com o comprimento total dos indivíduos, foi efetuada uma correção e os índices corrigidos índice de crescimento recente' e rácio ARN:ADN’ foram considerados. Também o K de Fulton mostrou-se significativamente relacionado com o comprimento total dos juvenis e foi substituído pelo fator de condição K', o qual considera o crescimento do peixe alométrico. Os resultados mostraram uma correlação positiva significativa entre os índices de crescimento recente’ e de crescimento inicial. Os resultados das regressões múltiplas parecem mostrar discrepância nos tempos de resposta dos diferentes índices de condição usados. Em geral, Sado, Ria Formosa e Guadiana apresentaram juvenis em melhor condição. No futuro, deve-se investigar melhor as relações entre os índices de condição e entre os índices de condição e as variáveis ambientais, focando a ligação entre condição individual e qualidade do habitat das áreas de viveiro

miRNA-29 bioseparation and target delivery strategies for Alzheimer's disease

The possibility of selectively alter the expression pattern of a particular gene has been sought by scientists and clinicians for a long time. Nowadays, RNA interference (RNAi)-based technology has become a novel tool for silencing gene expression in cells. In addition, this strategy encloses an enormous therapeutic potential that could change the course of the currently applied treatments in several life threatening pathologies and it is expected that this technology can be translated onto clinical applications in a near future. MicroRNA (miRNA) has become a commonly employed tool for gene silencing, since it prevents protein synthesis by inducing the messenger RNA (mRNA) degradation, with a high specificity degree. Consequently, in the last years, the miRNAs have emerged as biopharmaceuticals to regulate several pathways involved in the insurgence and progression of the Alzheimer’s disease (AD), since they might have key regulatory roles in many neuronal functions, such as differentiation, synaptic plasticity and memory formation, and typically they are down-regulated in disease conditions. In the literature there are some studies describing a causal relationship between miR-29 expression and AD, since a loss of miR-29 cluster can contribute to increased beta-amyloid precursor protein-converting enzyme 1 (BACE1) and Amyloid-β (Aβ) levels in sporadic AD patients. Thus, this evidence supports the possibility to use miR-29 as a potential therapeutic target for AD therapy. In general, miRNA-based therapy relies on the use of synthetic microRNAs. However, these synthesized formulations typically present contaminants that can lead to non-targeted gene silencing, which still restricts the pre-clinical or clinical application of these RNAs. Thus, considering this therapeutic purpose and the global distribution of novel biopharmaceuticals it is necessary to develop efficient processes for their preparation. The development of new strategies for microRNA production with high purity degree and biologically active is extremely required. One of the strategies might be the use of the recombinant production of biomolecules using prokaryotic hosts. Hence, the present work intends to develop and establish an integrative biotechnological platform to biosynthesize and purify a recombinant miRNA precursor (pre-miR-29b) to act in the selective silencing of endogenous pathways directly related with AD, in particular BACE1 and Aβ. In addition, the success of these therapies also depends upon the ability to selectively and efficiently deliver the pre-miR-29b in the cytoplasmic compartment of neuronal cells, the location where their function is exerted; therefore the development of miRNA delivery systems was also envisioned. The expression system Rhodovulum sulfidophilum (R. sulfidophilum) DSM 1374 allowed, for the first time, the production of human pre-miR-29b with a straightforward recuperation of pre-miR-29b in a single step, maintaining its biological active form. The application of this recombinant bacterial microorganism is innovative and is supported by the unusual capacity of secreting the nucleic acids to the extracellular space and the absence of host ribonucleases in the culture medium. Therefore, it is expected that the secreted miRNA will be devoid of main bacterial associated impurities. Regarding the growth conditions, and conversely to what was previously described for this bacterium, our results showed to be possible to develop an original approach for the aerobic growth of the R. sulfidophilum, which results in a cell growth improvement followed by an enhanced production of human pre-miR-29b. The extracellular pre-miR-29b concentration was approximately 182 μg/L, after 40 hours of bacterial growth and the total intracellular pre-miR-29b was of about 358 μg/L, at 32 hours of cell growth. To further develop a potential therapeutic application, the major interest is not only to produce high quantities of RNA but also to obtain and preserve its biological active form, fulfilling the requirements of regulatory agencies. Hence, to assure that this prerequisite is met it was used a novel and effective purification strategy, based on affinity chromatography, to purify the pre-miR-29b. Therefore, in order to achieve the selectivity towards the target pre-miRNA and the maximum resolution between the pre-miR-29b and other host biomolecules (transfer RNAs and proteins) it was used an affinity support that exploits the same biological interactions that are established within the cell, by using immobilized amino acids (L-lysine and L-arginine), as specific ligands. The recognition of the pre-miR-29b achieved with these supports, allowed its selective recovery from a complex mixture with high efficiency and high purity. In parallel, the binding of pre-miRNA to these different amino acids was studied by Surface Plasmon Resonance. This information brings important insights concerning the characterization of the pre-miRNA binding onto chromatographic supports. Moreover, it was possible to determine some particular conditions enabling the improvement of the binding specificity of the amino acid ligands used to purify miRNA, preserving the RNA integrity. Taking into account that the structure of the chromatographic supports has been continuously developed to afford rapid and efficient separations, namely for the purification of nucleic acids, it was also tested a monolithic support to purify the pre-miR-29b. The association of the high capacity of these supports with the specificity conferred by the agmatine ligand (a derivative of L-arginine) represented a novelty and an advantage to obtain highly pure pre-miR-29b (90%) with a high recovery yield (95%). The establishment of an effective application of miRNAs is usually constrained by different phenomena, namely their easy degradation when in contact with the body fluids. To overcome this limitation, delivery systems, such as polymeric systems (polyplexes), were developed and characterized in order to encapsulate and protect the pre-miR-29b biopharmaceuticals from degradation, allowing their sustained and targeted release. The formulations prepared with chitosan and polyethylenimine demonstrated high loading capacity, small sizes and exhibited a strong positive charge on their surface. In addition, considering the application field of this work, the delivery systems should also have the ability to penetrate the Blood-Brain Barrier (BBB), causing an increase of the pre-miRNAs concentration in the brain and, consequently the improvement of the therapeutic effect. Actually, BBB is an intrinsic barrier limiting miRNA therapeutic effect on the central nervous system. Thus, to improve the delivery of pre-miRNA therapeutics in the brain, the polyplexes were functionalized with specific ligands, namely lactoferrin and stearic acid which are recognized by cell surface receptors of BBB. Finally, it was evaluated the biological activity of the recombinant pre-miR-29b by measuring the efficiency on human BACE1 knockdown, using in vitro neuronal cell lines. The effect of recombinant pre-miR-29b administration was verified by both assessing the mRNA and protein human BACE1 levels, by using RT-qPCR, Western blot and Imunocytochemistry. Results suggest that recombinant pre-miR-29b can represent a novel biopharmaceutical product for the therapeutic modulation of human BACE1 levels, because high levels of inhibition were achieved, namely 80% of reduction for BACE1 protein expression and 45% for Aβ42 levels. Globally, the implementation of these cutting-edge technologies can have a great impact on the biopharmaceutical industry, providing the basis for the implementation of novel miRNA-based therapeutics, not only for neurological disorders but also for future therapeutic targets that can be of potential interest.A recente descoberta da tecnologia do RNA de interferência tornou-se numa nova ferramenta que permite regular seletivamente o padrão de expressão de um ou mais genes, o que pode ser explorado no âmbito de aplicação terapêutica. Deste modo, os resultados promissores desta nova abordagem têm vindo a reforçar a investigação relacionada com o RNA, avaliando e compreendendo os mecanismos celulares em que está envolvido, com o objetivo de o usar como uma nova classe de produtos bioterapêuticos, de fácil translação e implementação para o âmbito clínico. Na verdade, o mecanismo celular responsável pelo silenciamento da expressão génica apresenta um enorme potencial terapêutico que poderá alterar os tratamentos atualmente disponíveis para diversas patologias, como por exemplo as doenças neurológicas. Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe de RNAs de baixo peso molecular e, nos últimos anos, têm sido cada vez mais reconhecidos como moléculas endógenas reguladoras em numerosos processos biológicos. Devido à sua especificidade e eficiência, os miRNAs tornaram-se uma das ferramentas mais utilizadas no silenciamento de genes pelo mecanismo de RNA de interferência, uma vez que podem bloquear a síntese de proteínas através da indução da degradação do RNA mensageiro. Assim, os miRNAs podem ser considerados agentes terapêuticos promissores. Durante a última década, a hipótese de que os miRNAs podem ser usados como biofármacos para regular e controlar várias vias envolvidas no desenvolvimento e progressão da doença de Alzheimer (DA) ganhou consistência, uma vez que estes apresentam um papel crucial em muitas funções neuronais, tais como diferenciação, plasticidade sináptica, formação da memória, e normalmente estão sub-expressos em doentes com esta patologia. A doença de Alzheimer é a forma mais comum de demência e caracteriza-se por uma perda neuronal e sináptica generalizada, que causa um declínio progressivo e irreversível em diversas funções cognitivas. Embora, as causas ainda não sejam completamente compreendidas, sabe-se que esta doença neurodegenerativa está associada ao aparecimento de dois tipos de agregados proteicos, nomeadamente placas extracelulares beta-amiloides (Aβ) e complexos neurofibrilares intraneuronais. A formação das placas de Aβ resulta da clivagem sequencial da proteína percursora amiloide (APP) pela BACE1 e, posteriormente, pelo complexo gama-secretase dando origem às espécies Aβ tóxicas. Alguns estudos têm descrito uma relação causal entre a expressão do miR-29 e a DA, uma vez que a diminuição dos níveis de expressão da família miR-29 tem sido associada ao aumento da expressão da BACE1 e, consequentemente da formação dos péptidos Aβ em doentes com DA. Desta forma, a utilização do miR-29 pode proporcionar uma estratégia terapêutica eficaz na prevenção, controlo da progressão e tratamento desta patologia. As terapêuticas baseadas no uso de miRNAs recorrem, na sua maioria, à utilização de miRNAs sintéticos. Embora a síntese de miRNAs possa ser muito eficiente, verifica-se normalmente a presença de contaminantes nas amostras de RNA sintetizado o pode levar à inespecificidade do silenciamento génico. Além disso, por norma, no processo de preparação do RNA sintético é necessário recorrer à utilização de solventes tóxicos, solventes orgânicos e condições desnaturantes, que podem comprometer a qualidade e integridade do produto alvo. Por todos estes motivos, e considerando o objetivo de aplicação terapêutica destes novos produtos biofarmacêuticos, torna-se evidente a necessidade de desenvolver novos processos eficientes ou melhorar as metodologias atualmente empregues para a sua preparação. Assim, um dos desafios mais importantes no desenvolvimento destas estratégias terapêuticas surge com a necessidade de produzir miRNA com elevado grau de pureza e atividade biológica, de modo a satisfazer os requisitos necessários à sua aplicação. Deste modo, uma das estratégias que pode ser aplicada consiste na produção recombinante de biomoléculas utilizando hospedeiros procarióticos. Desta forma, o objetivo principal do presente trabalho consiste no desenvolvimento e implementação de uma plataforma biotecnológica para a produção e purificação de precursores de miRNAs, em particular o pre-miR-29b (percursor do miR-29), cuja aplicação visa o silenciamento seletivo de vias endógenas diretamente relacionados com DA, nomeadamente a BACE1 e os péptidos Aβ. Paralelamente, serão desenvolvidas e caracterizadas nanopartículas poliméricas para a entrega do pre-miR-29b no citoplasma de células neuronais de forma seletiva e eficaz, de modo a assegurar o sucesso destas administrações. O sistema de expressão recombinante utilizado permitirá, pela primeira vez, a produção e o isolamento do pre-miR-29b humano na bactéria Rhodovulum sulfidophilum (R. sulfidophilum) DSM 1374, mantendo a sua atividade biológica. A utilização deste hospedeiro bacteriano é inovadora e vantajosa, devido à sua capacidade invulgar de secretar os ácidos nucleicos para o meio de cultura, bem como devido à ausência de ribonucleases no mesmo, permitindo a obtenção do miRNA de interesse com baixo conteúdo de impurezas bacterianas. A fim de otimizar a produção e acumulação de miRNAs no espaço extracelular, as condições de crescimento foram estudadas, nomeadamente no que diz respeito ao efeito da temperatura e concentração de cloreto de sódio. Os ensaios realizados demonstraram ser possível desenvolver um protocolo para o crescimento aeróbio da bactéria R. sulfidophilum, na ausência de luz, a 30ºC, o que resulta num melhoramento do crescimento das células, seguido de um aumento da produção do pre-miR-29b humano. Neste trabalho foi possível atingir uma concentração de pre-miR-29b no meio extracelular de aproximadamente 182 μg/L, após 40 horas de crescimento bacteriano e uma concentração de 358 μg/L de pre-miR-29b intracelular, após 32 horas de fermentação. Para que seja possível a aplicação terapêutica do pre-miR-29b é necessário ter em conta as exigências estabelecidas pelas agências reguladoras internacionais, que requerem a produção de miRNA com elevada qualidade e atividade biológica. Para assegurar esta condição, foram desenvolvidas novas estratégias de purificação para o pre-miR-29b, baseadas em cromatografia de afinidade. A fim de alcançar a máxima seletividade e especificidade na separação do pre-miRNA de outras biomoléculas do hospedeiro (outras espécies de RNA e proteínas), foram desenvolvidos suportes de afinidade baseados nas interações biológicas que são estabelecidas a nível celular, usando como ligandos de afinidade, aminoácidos básicos como a L-lisina e a L-arginina. Na estratégia de purificação com o aminoácido de L-lisina foi demonstrada pela primeira vez a purificação de pre-miRNA utilizando um gradiente decrescente de concentração de sulfato de amónio em três passos, o que permitiu explorar maioritariamente interações hidrofóbicas. Contudo, a necessidade de aplicar elevadas concentrações de sal pode ser visto como uma desvantagem devido aos custos e ao impacto ambiental associado ao processo, principalmente no que diz respeito à aplicação ao nível industrial. De modo a ultrapassar estas limitações foi usada L-arginina como aminoácido imobilizado. Este estudo demonstrou a possibilidade de purificar o pre-miR-29b utilizando três estratégias diferentes de eluição, nomeadamente concentrações decrescentes de sulfato de amónio e duas condições de eluição moderadas, tais como usando um gradiente crescente de cloreto de sódio e a adição de um agente de competição (arginina) ao tampão de eluição. A versatilidade da matriz de arginina na purificação do pre-miR-29b sugeriu que o mecanismo de interação envolveria uma multiplicidade de interações não-covalentes, que globalmente resultam no bioreconhecimento do RNA de interesse. O reconhecimento bioespecífico e seletivo do pre-miR-29b por estes suportes cromatográficos permitiu a sua purificação e recuperação de forma eficiente, com elevados rendimentos, grau de pureza e integridade, a partir de uma mistura complexa. Além disso, a utilização da cromatografia de afinidade com arginina resultou na eliminação das impurezas associadas à produção recombinante, nomeadamente proteínas e endotoxinas, respeitando os critérios estabelecidos pelas agências reguladoras (por exemplo “Food and Drug Administration” – FDA). Considerando que esta estratégia cromatográfica requer condições suaves de eluição, torna-se um método de purificação mais económico do que a lisina-agarose. Em paralelo, a ligação do pre-miR-29b aos aminoácidos em estudo foi avaliada por biosensor. Este estudo também permitiu compreender as interações envolvidas entre o pre-miR-29b e as matrizes de lisina- e arginina-agarose, assim como determinar as melhores condições que favorecem o bioreconhecimento e a especificidade de ligação dos aminoácidos ao pre-miR-29b, preservando a sua estabilidade e integridade. Os resultados obtidos neste estudo mostraram a existência de várias interações entre o pre-miR-29b e as matrizes de afinidade com os aminoácidos imobilizados, tais como interações hidrofóbicas, eletrostáticas, catião-π, pontes de hidrogénio e forças de “van der Waals”. Tendo em conta que a estrutura dos suportes cromatográficos está em contínuo desenvolvimento de modo a proporcionar separações rápidas e eficientes, nomeadamente para a purificação de ácidos nucleicos, foi também testado um suporte monolítico na purificação do pre-miR-29b. Esta estratégia que associa a alta capacidade destes suportes com a especificidade e seletividade conferida pelo ligando de agmatina (um derivado da L-arginina), permitiu a recuperação do pre-miR-29b com alta eficiência (95%) e com elevado grau de pureza (90%) para posterior aplicação nos ensaios in vitro. Além disso, este suporte monolítico revelou elevada capacidade de ligação para o RNA, permitindo uma rápida e eficiente separação do pre-miR-29b, independentemente da taxa de fluxo aplicada. No geral, foi possível desenvolver métodos de purificação simples, robustos, versáteis e de elevada reprodutibilidade, que permitiram minimizar o manuseamento das amostras e evitar o uso de condições desnaturantes e solventes orgânicos, contribuindo para o sucesso das aplicações terapêuticas do RNA. No entanto, o sucesso das terapêuticas baseadas em miRNAs depende também da capacidade de entrega do miRNA, de forma seletiva e eficiente, aos órgãos-alvo, com a mínima toxicidade. De facto, a entrega cerebral de fármacos é limitada por diversos fatores intrínsecos, nomeadamente a sua rápida degradação quando em contato com os fluidos corporais e a reduzida permeabilidade ao longo da barreira hematoencefálica (BHE). Para ultrapassar estas limitações, vários sistemas de entrega de fármacos não-virais têm sido desenvolvidos e caracterizados, nomeadamente os sistemas poliméricos (poliplexos) que possuem características intrínsecas ideais para a transfecção, proteção e libertação controlada e direcionada de RNA. No presente trabalho, as formulações foram preparadas com polímeros comerciais, tais como quitosano e polietilenimina e demonstraram elevada capacidade de transporte de RNA, apresentando pequenas dimensões e uma forte carga superficial positiva. Além disso, e considerando o campo de aplicação do presente trabalho, estes sistemas devem também ter a capacidade de penetrar a BHE, levando a um aumento da concentração do pre-miRNA no cérebro e, consequentemente uma melhoria da sua ação terapêutica. Deste modo, a fim de potenciar o efeito terapêutico das abordagens baseadas no RNAi no sistema nervoso central, os poliplexos desenvolvidos foram funcionalizados com ligandos específicos, tais como a lactoferrina e o ácido esteárico, os quais são reconhecidos pelos recetores localizados à superfície da BHE. Este estudo revelou que os sistemas de entrega desenvolvidos conseguem penetrar a BHE e assim entregar o pre-miR-29b no cérebro. Finalmente, avaliou-se a atividade biológica do pre-miR-29b recombinante através da verificação da sua eficiência na regulação dos níveis de expressão dos genes relacionados com a DA, em particular no silenciamento da BACE1 humana, utilizando modelos in vitro (linhas de células neuronais). O efeito da administração do pre-miR-29b recombinante foi verificado tanto ao nível da expressão do RNA mensageiro como ao nível da expressão da proteína BACE1, através de RT-qPCR, Western blot e Imunocitoquímica. Os resultados sugerem que o pre-miR-29b recombinante pode funcionar como biofármaco para a modulação terapêutica dos níveis de BACE1, uma vez que foram atingidos elevados níveis de inibição, ou seja 80% de redução para a expressão da proteína BACE1 e 45% para os níveis dos péptidos beta amiloides, quando comparados com as células não transfectadas e células transfectadas como um RNA não relacionado bem como um miR-29b sintético. Em suma, a implementação destas metodologias terá um grande impacto na indústria farmacêutica e biotecnológica, fornecendo a base para a utilização de novas formas terapêuticas baseadas na utilização de miRNAs, não apenas para aplicação em doenças neurológicas, mas também para futuros alvos terapêuticos que possam ser de interesse

Modelos do tipo campo de fases em processos de cristalização

Orientador : Jose Luiz BoldriniTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matematica, Estatistica e Computação CientificaResumo: Neste trabalho apresentamos alguns resultados de existência de solução para sistemas de equações diferenciais parciais não lineares consistindo de uma equação do tipo Cahn-Hilliard e várias equações do tipo Allen-Cahn. Tais sistemas são análogos ao modelo proposto por Fan, L.-Q. Chen, S. Chen e Voorhees a fim de modelar o fenômeno "Ostwald ripening" em sistemas bifásicos. Utilizamos o método de Faedo-Galerkin e argumentos de compaci-dade a fim de obter resultados de existência e unicidade de soluções fracasAbstract: We analyze a family of systems consisting of a Cahn-Hilliard and several Allen-Cahn type equations. These systems are analogous to one proposed by Fan, L.-Q. Chen, S. Chen and Voorhees for modeling Ostwald ripening in two-phase systems. We prove results on existence and uniqueness of weak solutions by using the Faedo-Galerkin method and compactness argumentsDoutoradoDoutor em Matemática Aplicad

O impacto do goodwill nos resultados

Dissertação de Mestrado em Contabilidade e FinançasA partir de 2005, as entidades com valores admitidos à negociação nos mercados regulamentados da União Europeia (UE) passaram a apresentar as suas demonstrações financeiras consolidadas segundo as IAS/IFRS adotadas pela UE. Em resultado desta alteração, surgiram novas regras de reconhecimento e mensuração do goodwill pelo que tem sido desenvolvido diversos estudos, que procuram avaliar a subjetividade que lhe está subjacente pode conduzir a determinados comportamentos na preparação da informação financeira. Neste estudo pretende aferir se existem factos relevantes que, comprovem a existência de manipulação dos resultados advinda do novo tratamento contabilístico do goodwill. Para isso analisamos as empresas cotadas na bolsa de valores da Euronext Lisbo a 31 de Dezembro de 2011. Concluímos que existem algumas falhas por parte das empresas no tratamento do goodwill, nas suas demonstrações financeiras. Em alguns períodos, as empresas que não alteraram o seu goodwill, assim como as que registaram perdas por imparidade, obtiveram o seu resultado mais atrativo.Since 2005, all companies listed in the European Stock Exchange are obliged to present their consolidated financial statements based on IAS/IFRS as adopted by the European Union. In result of this amendment, new rules on recognition and measurement of goodwill have been developed by several studies, seeking to assess how the subjectivity behind it can lead to certain behaviors in preparing the financial information. This study aims to evaluate, if there are relevant facts that prove the existence of manipulation of results from the new accounting treatment of goodwill. For such,portuguese companies listed in the Lisbon Euronext in December 31, 2012, werw studied. In conclusion, all the examined companies are some mistakes, concerning the goodwill treatment, in their consolidated financial statements. In some periods, the companies that have not altered your goodwill, as well as those registering impairment losses, obtained more attractive results