The effect of phosphocreatine on the distribution of different subunits of translation elongation factor 1 in gently permeabilized human fibroblasts

Highly effective permeabilization/translation system developed recently (Negrutskii et al. (1994) Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 964–968) was used to study the distribution of FITC-labeled a and S submits of translation elongation factor 1 in human fibroblasts. Somewhat granular fluorescent picture observed for the both proteins distribution during active protein synthesis may be indicative of putative protein synthesis compartments. Exogenous phosphocreatine, an absolutely required agent to support the protein synthesis in permeabilized cells, is shown to influence the EF-1α distribution, while not affecting the EF-1δ. Most of EF-1α under «low energy» condition is found in nucleus. Thus, the possibility of the functional change in EF-la distribution is demonstrated supporting the Idea about transient character of EF-1α involvement into «heavy» EF-1 complex.Фосфокреатин є абсолютно необхідним компонентом суміші для білкового синтезу у безклітинних системах та перме­абілізованих клітинах. Показано, шр під впливом фосфокреа­тину змінюється локалізація α-субодиниці фактора елонгації трансляції І у пермеабілізованих клітинах вищих еукаріот. У присутності фосфокреатину EF-la має дискретну локалі­ зацію в цитоплазмі, а за його відсутністю більшість EF-1α локалізовано у ядрі. Розподіл δ-субодиниці EF-1 не залежить від наявності фосфокреатину в складі суміші для пермеабілізаціїФосфокреатин абсолютно необходим для обеспечения белково­го синтеза в бесклеточных системах и в пермеабилизованных клетках. Показано, что локализация EF-1α в пермеабилизо­ванных клетках высших эукариот зависит от присутствия фосфокреатина. в среде. Распределение EF-1α в цитоплазме в присутствии фосфокреатина носит дискретный характер, тогда как этот белок обнаруживается преимущественно в ядре в отсутствие фосфокреатина. Локализация EF-1δ не зависит от наличия фосфокреатина в смеси для пермеабилизации

Transcriptional and post-transcriptional control of eEF1A2 expression during myoblast diffrerentiation

During postnatal development, the switch of the expression from isoform A1 to the isoform A2 of eukaryotic translation elongation factor (eEF1A) is observed in neuronal and muscle tissues. The switch of the expression is a vital fundamental process, as mutant mice, with the partial EEF1A2 deletion dies on the 28th day after birth. Mechanism of the inhibition of A1 and stimulation of A2 expression during the first days of postnatal development is unknown. The existence of potential miRNA binding sites in the 3’UTR of mRNAs encoding the isoforms assumes a post-transcriptional control of abovementioned phenomenon. Aim. To check the possibility of post-transcriptional regulation of the isoforms A1 and A2 expression during differentiation of the human immortalized myoblasts cell line LHCN. Methods. The level of gene expression was quantified by qPCR, the existence of post-transcriptional regulation was demonstrated with Dual-Luciferase® Reporter Assay. Results. Using immortalized human myoblasts cell line LHCN, the induction of isoform A2 of eEF1 during differentiation of myoblasts was shown. The existence of transcriptional and post-transcriptional control of the abovementioned process was confirmed. Downregulation of mir-661 and mir-744 that have binding sites in the 3’ UTR of EEF1A2 mRNA, during differentiation suggests a potential role of microRNAs in the eEF1A2 induction during myoblast differentiation. Conclusions. Induction of A2 isoform of eEF1 during differentiation of myoblasts occurs on transcriptional and post-transcriptional level. Keywords: eEF1A1, eEF1A2, immortalized human myoblasts LHCN, differentiation, microRNA.Abstract У процесі постнатального розвитку в нейрональній і м’язовій тканинах відбувається зміна ізоформи А1 фактора елонгації трансляції на ізоформу А2. Перемикання експресії ізоформ є життєво важливою подією, оскільки мутантні миші, що містять делецію EEF1A2, гинуть на 28-й день після народження. Механізми інгібування А1 і стимуляції А2 протягом перших днів постнатального розвитку невідомі. Наявність сайтів зв’язування мікроРНК у 3'-нетрансльованих послідовностях мРНК ізоформ фактора елонгації трансляції передбачає існування посттранскрипційного контролю даного процесу. Мета. Перевірити можливість посттранскрипційної регуляції експресії ізоформ А1 і А2 під час диференціації імморталізованих міобластів людини LHCN. Методи. Рівень експресії генів визначали методом кількісної ПЛР, наявність посттранскрипційного контролю детектували методом репортерних генів. Результати. Використовуючи як модель клітинну лінію імморталізованих міобластів людини LHCN, показано індукцію ізоформи А2 фактора елонгації трансляції eEF1 при диференціації міобластів, наявність транскрипційного і посттранскрипційного контролю в даному процесі, а також потенційну участь мікро-РНК у процесі зміни експресії ізоформ. Висновки. Індукція ізоформи А2 протягом диференціації міобластів може відбуватися як на транскрипційному, так і на посттранскрипційному рівні. Ключові слова: eEF1A1, eEF1A2, імморталізовані міобласти людини LHCN, диференціація, мікроРНК

Compartmentalisation and localisation of the translation initiation factor (eIF) 4F complex in normally growing fibroblasts

Previous observations of association of mRNAs and ribosomes with subcellular structures highlight the importance of localised translation. However, little is known regarding associations between eukaryotic translation initiation factors and cellular structures within the cytoplasm of normally growing cells. We have used detergent-based cellular fractionation coupled with immunofluorescence microscopy to investigate the subcellular localisation in NIH3T3 fibroblasts of the initiation factors involved in recruitment of mRNA for translation, focussing on eIF4E, the mRNA cap-binding protein, the scaffold protein eIF4GI and poly(A) binding protein (PABP). We find that these proteins exist mainly in a soluble cytosolic pool, with only a subfraction tightly associated with cellular structures. However, this "associated" fraction was enriched in active "eIF4F" complexes (eIF4E.eIF4G.eIF4A.PABP). Immunofluorescence analysis reveals both a diffuse and a perinuclear distribution of eIF4G, with the perinuclear staining pattern similar to that of the endoplasmic reticulum. eIF4E also shows both a diffuse staining pattern and a tighter perinuclear stain, partly coincident with vimentin intermediate filaments. All three proteins localise to the lamellipodia of migrating cells in close proximity to ribosomes, microtubules, microfilaments and focal adhesions, with eIF4G and eIF4E at the periphery showing a similar staining pattern to the focal adhesion protein vinculin

Non-canonical interactions of the β subunit of the translation elongation complex eEF1B and analysis of their possible functional role

Aim. To predict protein networks which may comprise the β subunit of the translation elongation complex eEF1B in lung carcinoma cell line. Methods. The protein partners of eEF1Bβ from cytoplasmic extract of A549 cells were identified by co-immunoprecipitation (co-IP) combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The molecular interaction network for eEF1Bβ was predicted and visualized by a Cytoscape 3.2.0 program using an MCODE plugin. GO analysis of cellular distribution was performed by a STRAP Program. Results. 162 high-scored proteins interacting with eEF1Bβ in the cytoplasm of lung carcinoma cells A549 have been identified by mass-spectrometry. Possible functional networks involving these contacts were predicted bioinformatically. Conclusions. Four protein networks are identified as possible targets of eEF1Bβ in lung cancer cells. These groups are involved in the cell cycle regulation; DNA replication and repair; chromatin remodeling; chaperoning and signal transduction. The dataallow to narrow down further search for non-canonical cancer-related function of eEF1Bβ.Мета. Передбачити, до яких функціональних кластерів білків клітин карциноми легені А-549 може входити субодиниця β комплексу факторів елонгації трансляції eEF1B. Методи. Білки-партнери eEF1Bβ, отримані з цитоплазматичного екстракту клітин А549 методом ко-імунопреципітації (co-IP), були ідентифіковані за допомогою высокоефективної рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією (LC-MS/MS). Сітка молекулярних взаємодій eEF1Bβ була передбачена і побудована за допомогою програми Cytoscape 3.2.0 з використанням плагіна MCODE. Результати. Методом мас-спектрометрії було ідентифіковано 162 білка, що взаємодіють з eEF1Bβ в цитоплазмі клітин карциноми легені A549. Можливі функціональні сітки, що включають ці контакти, були передбачені біоінформатично. Висновки. Чотири білкові сітки були ідентифіковані як можливі мішені eEF1Bβ при раку. Ці групи білків залучені в регуляцію клітинного циклу; реплікацію та репарацію ДНК, ремоделювання хроматину; шаперонну функцію та сигнальну трансдукцію. Отриманні данні дозволяють звузити поле подальшого пошуку неканонічних, пов’язаних з раком функцій eEF1Bβ.Цель. Предсказать функциональные кластеры белков, в какие может быть вовлечена β субъединица комплекса факторов элонгации трансляции eEF1B в клетках карциномы легкого А549. Методы. Белки-партнёры eEF1Bβ, полученные из цитоплазматического экстракта клеток А549 методом ко-иммунопреципитации (co-IP), были идентифицированы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и последующей тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Сеть молекулярных взаимодействий eEF1Bβ была предсказана и построена с помощью программы Cytoscape 3.2.0 с использованием плагина MCODE. Результаты. Методом масс-спектрометрии было идентифицировано 162 белка, взаимодействующих с eEF1Bβ в цитоплазме клеток карциномы лёгкого A549. Возможные функциональные сети, включающие эти контакты, были предсказаны биоинфор-матически. Выводы. Четыре белковые сети были идентифицированы в качестве возможных мишеней eEF1Bβ при раке. Эти группы белков вовлечены в регуляцию клеточного цикла; репликацию и реперацию ДНК, ремоделирование хроматина; шаперонную функцию и сигнальную трансдукцию. Полученные данные позволяют сузить поле дальнейшего поиска неканонических, связанных с раком функций eEF1Bβ

Interaction of different tRNAs with translation elongation factors 1A from lower and higher eukaryotes

The work is aimed at confirmation of earlier assumed mechanism of tRNA channeling. Methods. The methods of band shift assay and Forsters resonance energy transfer were used. Results. The affinities of mammalian tRNAs for two tissue specific isoforms of elongator factor eEF1A1 and eEF1A2 were compared. For the first time we have shown the ability of yeast eEF1A*GDP to form non-canonical ternary complex with deacylated tRNAs. The complexation of eukaryotic eEF1A with initiator tRNA, of both bacterial and mammalian origin, was also demonstrated. Conclusions. The formation of the non-canonical complexes of eEF1A*GDP with deacylated tRNAs is common for higher and lower eukaryotes, which is in favor of universality of eukaryotic tRNA-channeling.Мета. Підтвердити запропонований раніше механізм каналювання тРНК. Методи. Зсув смуги в поліакриламідному гелі та Форстерівське резонансне перенесення енергії (FRET). Результати. Оцінено спорідненість тРНК ссавців з двома тканино-специфічними ізоформами фактораe еEF1A1 та eEF1A2. Вперше показано формування неканонічних потрійних комплексів дріжджового eEF1A*GDP з деацильованими тРНК. Продемонстровано також комплексоутворення еукаріотного eEF1A з ініціаторною тРНК ссавців і бактерій. Висновки. Формування неканонічних комплексів eEF1A*GDP з деацильованими тРНК є загальним для вищих і нижчих еукаріотів, що підтверджує універсальність еукаріотного каналювання тРНКЦель. Подтвердить предложенный ранее механизм каналирования тРНК. Методы. Сдвиг полосы в полиакриламидном геле и Форстеровский резонансный перенос энергии (FRET). Результаты. Оценено сродство тРНК млекопитающих с двумя тканеспецифическими изоформами фактора eEF1A1 и eEF1A2. Впервые показано формирование неканонических тройных комплексов дрожжевого eEF1A*GDP с деацилированными тРНК. Также продемонстрировано комплексообразование эукариотного eEF1A с инициаторной тРНК млекопитающих и бактерий. Выводы. Формирование неканонических комплексов eEF1A*GDP с деацилированными тРНК является общим для высших и низших эукариотов, что подтверждает универсальность эукариотного каналирования тРНК

Comparison of the ability of mammalian eEF1A1 and its oncogenic variant eEF1A2 to interact with actin and calmodulin

The question as to why a protein exerts oncogenic properties is answered mainly by well-established ideas that these proteins interfere with cellular signaling pathways. However, the knowledge about structural and functional peculiarities of the oncoproteins causing these effects is far from comprehensive. The 97.5% homologous tissue-specific A1 and A2 isoforms of mammalian translation elongation factor eEF1A represent an interesting model to study a difference between protein variants of a family that differ in oncogenic potential. We propose that the different oncogenic impact of A1 and A2 might be explained by differences in their ability to communicate with their respective cellular partners. Here we probed this hypothesis by studying the interaction of eEF1A with two known partners – calmodulin and actin. Indeed, an inability of the A2 isoform to interact with calmodulin is shown, while calmodulin is capable of binding A1 and interferes with its tRNA-binding and actin-bundling activities in vitro. Both A1 and A2 variants revealed actin-bundling activity; however, the form of bundles formed in the presence of A1 or A2 was distinctly different. Thus, a potential inability of A2 to be controlled by Ca2+-mediated regulatory systems is revealed

VALYL-TRNA SYNTHETASE INTERACTS WITH Β-SUBUNIT OF THE EUKARYOTIC TRANSLATION ELONGATION FACTOR COMPLEX eEF1B

The aim of this study was to investigate the interaction of the N-terminal domain of the valyl-tRNA synthetase with α, β, and γ subunits of the eEF1B translation elongation factor complex. Methods: for this purpose, all 4 proteins were synthesized in bacterial cells and purified to homogeneity by a combination of chromatographic methods. The interaction of the eEF1B complex subunits with the N-terminal domain of the valyl-tRNA synthetase was verified by gel filtration and in vitro pull-down assays. Protein fractions collected at these stages were analyzed by SDS-PAGE. Results: according to the gel filtration results, eEF1Bα and eEF1Bγ subunits do not form a stable complex with the valine-tRNA synthetase domain. The potential for complexation of the eEF1Bβ subunit was evaluated by pull-down assay, which showed that this protein does interact with the valyl-tRNA synthetase. Conclusions: we concluded that the eEF1Bα and eEF1Bγ subunits do not interact with the valyl-tRNA synthetase compared to the eEF1Bβ protein. The N-terminal domain of the valyl-tRNA synthetase is necessary and sufficient for this interaction

Protein partners of the eEF1Bβ subunit of the translation elongation complex eEF1B in the nuclear fraction of human lung carcinoma cells

Aim. To identify novel protein partners of translation factor eEF1Bβ in nucleus of human lung carcinoma cells. Methods. Protein partners of eEF1Bβ in the nuclear fraction of A549 cells were identified by co-immunoprecipitation (co-IP) combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Specific protein partners of eEF1Bβ were further selected by using the results of previously published global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellu-lar localization with help of “Mapofthecell” program. Results. 104 high-scored proteins interact-ing with eEF1Bβ in the nuclear fraction of A549 cells have been identified by mass-spectrometry. Among these proteins, 9 partners of eEF1Bβ were confirmed by the co-fractionation approach. Functional analysis of the partners has divided them on the pro-oncogenic (lung-cancer related) and neutral/anti-oncogenic moieties. These two groups are estimated to be spatially separated in human cancer cells. Conclusions. The position of eEF1Bβ as a link between the oncogenic and neutral/tumor-suppressor moieties of its protein partners in nucleus of lung cancer cells is sug-gested. Deciphering of a possible role of the eEF1Bβ distribution between the pro-cancer or anti-cancer communities of its protein partners can be a subject of further research.Мета. Виявити нових білків-партнерів фактора трансляції eEF1Bβ в ядрі клітин карциноми легені. Методи. Білки-партнери eEF1Bβ, отримані з ядерного екстракту клітин А549 методом ко-імунопреципітації (co-IP), були ідентифіковані за допомогою высокоефективної рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією (LC-MS/MS). Подальше підтвердження білків-партнерів проводили із використанням опублікованих даних глобального, кількісного і динамічного картування субклітинної локалізації білків за допомогою програми Mapofthecell. Результати. 104 білки, які взаємодіють із eEF1Bβ в ядерній фракції клітин карциноми легені A549 були ідентифіковані мас-спектрометрією. Проміж цих білків, 9 партнерів eEF1Bβ були підтверджені даними із прецизійного субклітинного фракціонування. За допомогою функціонального аналізу ці білки-партнери можуть бути поділені на про-онкогенну і нейтральну/анти-онкогенну групи. Передбачено, що ці групи можуть бути просторово розділені в ракових клітинах людини. Висновки. Запропоновано, що eEF1Bβ може бути проміжною ланкою між онкогенною і нейтральною/пухлиносупресорною групами партнерів цього білка в ядрі ракових клітин. Розшифрування можливої ролі залучення eEF1Bβ до про-ракової або анти-раковими спільнот білкових партнерів цього білку може бути предметом подальших дослiджень.Цель. Выявление новых белков-партнеров фактора трансляции eEF1Bβ в ядре клеток карциномы легкого. Методы. Белки-партнёры eEF1Bβ, полученные из ядерного экстракта клеток А549 методом ко-иммунопреципитации (co-IP), были идентифицированы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS). Дальнейшее подтверждение белков-партнеров проводили с использованием опубликованных ранее данных глобального, количественного и динамичного картирования субклеточной локализации белков с помощью программы «Mapofthecell». Результаты. Методом масс-спектрометрии было идентифицировано 104 белка, взаимодействующих с eEF1Bβ в ядре клеток A549. Из этих белков, 9 партнеров eEF1Bβ были подтверждены данными, полученными при подробном субклеточном фракционировании. С помощью функционального анализа эти белки-партнеры можно разделить на про-онкогенную і нейтральную/анти-онкогенную группы. Предсказано, что эти группы могут быть разделены в пространстве в раковых клетках человека. Выводы. Выдвинуто предположение, что eEF1Bβ может быть промежуточным звеном между онкогенной и нейтральной/опухоле-супрессорной группами его партнеров в ядре раковых клеток. Расшифровка возможной роли вовлечения eEF1Bβ в про-раковую или анти-раковую группы его белковых партнеров может быть предметом дальнейших исследований

Multisubunit complex eEF1H in human glial tumors: from mRNA to protein

Aim. To investigate protein level of all subunits of the eukaryotic elongation translation factor eEF1H (eEF1A, eEF1Bα, eEF1Bβ and eEF1Bγ) in glial tumors of human brain in comparison with normal brain. Methods. The eEF1H components content has been investigated in human glioblastoma clinical samples by Western blot analysis. Results. To determine the eEF1Bα, eEF1Bβ and eEF1Bγ content, the polyclonal antibodies against all eEF1H subunits were obtained. The tendency of the eEF1Bγ protein level to increase in glioblastomas was observed. There were no significant differences in the eEF1A, eEF1Bα and eEF1Bβ protein contents. Conclusions. In the previous report we analysed the expression of all eEF1H subunits in human glial brain tumor on the mRNA level. This study showed that eEF1Bγ was overexpressed while no significant changes in other eEF1H subunits were observed. It suggests a possible function of eEFBγ which is cancer-related and is not connected with the functioning of eEF1H complex in translation.Мета. Проаналізувати вміст усіх субодиниць фактора елонгації трансляції eEF1H (eEF1A, eEF1Bα, eEF1Bβ і eEF1Bγ) в гліальних пухлинах головного мозку людини порівняно з умовною нормою. Методи. Компоненти комплексу eEF1H досліджували у клінічних зразках гліальних пухлин людини Вестерн-блот-аналізом. Результати. Для визначення вмісту білків eEF1Bα, eEF1Bβ і eEF1Bγ отримано поліклональні антитіла до цих субодиниць. Спостерігали тенденцію до підвищення рівня білка eEF1B в гліобластомах. Відмінності в рівні білків eEF1A, eEF1Bα та eEF1Bβ в гліальних пухлинах у порівнянні з умовною нормою виявилися несуттєвими. Висновки. Ця робота є продовженням попередніх досліджень, де вивчали рівень мРНК, які кодують субодиниці комплексу eEF1H у пухлинах головного мозку людини. Виявлене зростання концентрації білка eEF1Bγ в гліобластомах, що відбувалося на фоні практичної відсутності розбіжностей в експресії інших субодиниць комплексу, може свідчити про виконання субодиницею eEF1Bγ певної пухлинозалежної ролі, окремої від трансляційної функції комплексу eEF1H.Цель. Проанализировать содержание всех субъединиц фактора элонгации трансляции eEF1H (eEF1A, eEF1Bα, eEF1Bβ и eEF1Bγ) в глиальных опухолях головного мозга человека по сравнению с условной нормой. Методы. Компоненты комплекса eEF1H исследовали в клинических образцах глиальных опухолей человека Вестерн-блот-анализом. Результаты. Для определения содержания белков eEF1Bα, eEF1Bβ и eEF1Bγ получены поликлональные антитела против этих субъединиц. Наблюдалась тенденция к повышению уровня белка eEF1Bγ в глиобластомах. Отличия в уровнях белков eEF1A, eEF1Bα и eEF1Вβ оказались несущественными. Выводы. Эта работа продолжает предыдущие исследования по изучению уровня мРНК, кодирующих субъединицы комплекса eEF1H в опухолях головного мозга человека. Выявленное увеличение концентрации белка eEF1Bγ в глиобластомах, происходящее на фоне практически отсутствующих изменений в уровнях экспрессии других субъединиц комплекса, может указывать на выполнение субъединицей eEF1Bγ определенной опухоль-зависимой роли, отдельной от трансляционного комплекса eEF1H

Structural basis of yeast aminoacyl-tRNA synthetase complex formation revealed by crystal structures of two binary sub-complexes

The yeast aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) complex is formed by the methionyl- and glutamyl-tRNA synthetases (MetRS and GluRS, respectively) and the tRNA aminoacylation cofactor Arc1p. It is considered an evolutionary intermediate between prokaryotic aaRS and the multi- aaRS complex found in higher eukaryotes. While a wealth of structural information is available on the enzymatic domains of single aaRS, insight into complex formation between eukaryotic aaRS and associated protein cofactors is missing. Here we report crystal structures of the binary complexes between the interacting domains of Arc1p and MetRS as well as those of Arc1p and GluRS at resolutions of 2.2 and 2.05 Å, respectively. The data provide a complete structural model for ternary complex formation between the interacting domains of MetRS, GluRS and Arc1p. The structures reveal that all three domains adopt a glutathione S-transferase (GST)-like fold and that simultaneous interaction of Arc1p with GluRS and MetRS is mediated by the use of a novel interface in addition to a classical GST dimerization interaction. The results demonstrate a novel role for this fold as a heteromerization domain specific to eukaryotic aaRS, associated proteins and protein translation elongation factors