6 research outputs found
Accelerated mass production of influenza virus seed stocks in HEK-293 suspension cell cultures by reverse genetics
Despite major advances in developing capacities and alternative technologies to egg-based production of influenza vaccines, responsiveness to an influenza pandemic threat is limited by the time it takes to generate a Candidate Viral Vaccine (CVV) as reported by the 2015 WHO Informal Consultation report titled “Influenza Vaccine Response during the Start of a Pandemic”. In previous work, we have shown that HEK-293 cell culture in suspension and serum free medium is an efficient production platform for cell culture manufacturing of influenza candidate vaccines. This report, took advantage of, recombinant DNA technology using Reverse Genetics of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 strain, and advances in the large-scale transfection of suspension cultured HEK-293 cells. Transfection in shake flasks was performed using 1ug of total plasmid and 1x106 cells/mL. The supernatant was harvested after 48 hpt and used to infect a new shake flasks at 1x106 cells/mL for virus amplification. 3-L bioreactor was inoculated and transfected at 1x106 cells/mL with 1ug of total plasmid and harvested after 48hpt and the virus generated was amplified in shake flask. Quantification by TCID50, SRID, Dot-blot and TRPS were performed as well as characterization by TEM and HA and NA sequencing. Small-scale transfection in shake flasks generated 1.5x105 IVP/mL after 48 hpt and 1x107 IVP/mL after 96 hpi. For large-scale experiment a 3-L controlled stirred tank bioreactor resulted in supernatant (P0) virus titer of 5x104 IVP/mL and 2.8x107 IVP/mL after only one amplification (P1) in HEK-293 suspension cells. We demonstrate the efficent generation of H1N1 with the PR8 backbone reassortant under controlled bioreactor conditions in two sequential steps (transfection/rescue and infection/production). This approach could deliver a CVV for influenza vaccine manufacturing within two-weeks, starting from HA and NA pandemic sequences. Thus, this innovative approach is better suited to rationally design and mass produce the CVV within timelines dictated by pandemic situations and produce effective responsiveness than previous methodolog
Actualización del catálogo de composites de ICM Industrie para mecanizado industrial
Outgoin
Estudi sobre l’efecte de bhrf1 en la inhibició de l’apoptosi i el control del cicle cel·lular en cèl·lules d’hibridoma
En l’actualitat, la industria farmacèutica utilitza la tecnologia basada en el cultiu in vitro de cèl·lules animals per a la producciĂł de compostos d’elevat interès terapèutic i tambĂ©, com a model biològic per assajar l’activitat de nous fĂ rmacs. Moltes empreses fan Ăşs d’aquesta tecnologia ja que es tracta del sistema biològic mĂ©s apropiat per obtenir proteĂŻnes complexes. Tot i aixĂ, pel que fa a l’ús de cèl·lules animals, existeixen una sèrie de limitacions importants, entre les que es troba la pèrdua de viabilitat de les cèl·lules en cultiu, degut a l’activaciĂł del procĂ©s de mort cel·lular programada o apoptosi.
La principal causa de l’activació d’aquest tipus de mort cel·lular és l’esgotament de determinats nutrients essencials o factors de creixement i l’acumulació de metabòlits tòxics per a la cèl·lula al llarg del cultiu. L’apoptosi representa un greu inconvenient a nivell del cultiu in vitro en bioreactors, ja que disminueix drà sticament la viabilitat del cultiu i, en conseqüència, la productivitat del bioreactor.
En aquest treball, s’han utilitzat cèl·lules murines d’hibridoma KB26.5 productores de la immunoglobulina IgG3, transfectades amb el gen bhrf1 i s’ha comprovat com aquesta modificaciĂł Ă©s capaç de reduir el nivell de mort per apoptosi, i garantir la supervivència de les cèl·lules durant un perĂode on hi ha una situaciĂł d’inducciĂł a l’apoptosi. Aquesta capacitat s’ha observat en dos sistemes de cultiu cel·lular com sĂłn el discontinu i la perfusiĂł. Aquest Ăşltim sistema de cultiu s’ha posat en evidència que, a mĂ©s de conferir una major resistència a la mort cel·lular, BHRF1 afecta al cicle cel·lular tant sols en els moments de limitaciĂł de nutrients.
Aquestes observacions han portat a estudiar els efectes intracel·lulars de BHRF1 per entendre com l’expressiĂł d’aquest gen vĂric era capaç de produir aquests efectes fenotĂpics. S’ha determinat que BHRF1 no es limita tant sols a l’aturada de l’apoptosi a nivell mitocondrial, sinĂł que Ă©s capaç d’influir en diverses rutes que intervenen en processos vitals per la cèl·lula.
Les anà lisi realitzades amb microarrays de DNA han revelat la capacitat de BHRF1 d’induir de forma diferencial l’expressió de gens relacionats amb l’apoptosi, el cicle cel·lular, la ruta Akt/mTOR i la via de JNK. A més, estudis realitzats mitjançant PCR en temps real han indicat que, tant sols en condicions inductores de l’apoptosi, es produeix una sobreexpressió de bcl2 en les cèl·lules KB26.5 transfectades amb el gen bhrf1, indicant que hi ha una relació entre les dues proteïnes codificades per aquests gens.
Per tal de veure els efectes de la sobreexpressiĂł de bcl2 s’han utilitzat inhibidors quĂmics especĂfics per la proteĂŻna Bcl-2. Com a resultat s’ha anul·lat la resistència a l’apoptosi per part d’aquelles cèl·lules amb expressiĂł de BHRF1. La sobreexpressiĂł de bcl2 es pot relacionar, a mĂ©s, amb l’aturada observada del cicle cel·lular en la fase G1.
La relació entre BHRF1 i Bcl-2 no s’ha constatat a través d’una interacció directa, ja que tant sols s’han vist interaccions de BHRF1 amb la proteïna proapoptòtica Bim i amb VRK2, relacionada amb la ruta JNK. Aquestes interaccions proteiques poden explicar la conservació de la integritat mitocondrial que s’ha observat en aquelles cèl·lules amb presència de BHRF1 i la resistència a l’apoptosi en condicions d’estrès.
En aquest treball s’ha determinat també que BHRF1 és una proteïna exclusivament mitocondrial, ja que aquesta no varia la seva localització cel·lular tant en un context d’alta viabilitat cel·lular com d’apoptosi, per tant les interaccions proteiques s’han de donar a nivell del mitocondri.Now a day the pharmaceutical industry uses the in vitro animal cell culture technology for the production of elevated therapeutic interest products as well as biological model for the assay of novel drugs. Many corporations use this technology as the best approach to obtain complex molecules. Notwithstanding there are several important drawbacks on the animal cell culture. Among them there is the loose of viability in cultured cells due to the activation of the programed cell death or apoptosis.
The main origin of the apoptosis triggering is the essential nutrient or growth factors deprivation and the accumulation of harmful metabolites during the cell culture. Apoptosis represents a major inconvenient for the in vitro cell culture in bioreactors as is responsible for the dramatic cell viability reduction and consequently a decrease in productivity.
The IgG3 producing murine hybridoma cells KB26.5 have been used in this thesis. These cells have been transfected with bhrf1 gene and it was checked that this particular modification was able to reduce the number of apoptotic cells and ensure cell survival in proapoptotic conditions. This ability was observed in two cell culture systems such as batch and perfusion. The later culture system clearly showed that BHRF1 directly affects to the cell cycle only in a nutrient limitation situations.
These observations led to a deep study of the BHRF1 intracellular effects to understand how the expression of this gene was able to generate those phenotypical effects. It was determined that the cellular effect of BHRF1 was not only constricted to prevent the apoptosis by itself at a mitochondrial level, but also was able to influence on several essential pathways.
Microarray analysis unveiled the BHRF1 capability to differentially induce gene expression related to apoptosis, cell cycle, Akt/mTOR and JNK pathways. Moreover studies using real time PCR showed, only under apoptotic conditions, an over expression of bcl2 in KB26.5 transfected cells with bhrf1 gene. This indicates that exist a relationship between both proteins.
In order to see the effect of the bcl2 overexpression two chemical inhibitors for Bcl-2 were used; BHRF1 expressing cells did not exhibit apoptosis resistance. The overexpression of bcl2 can be related with G1 arrest observed under apoptotic conditions in BHRF1 expressing cells in the cell culture systems used.
It was not determined a direct interaction between BHRF1 and Bcl-2, even though a direct interaction between BHRF1 and the proapoptotic protein Bim and the JNK pathway related protein VRK2 were observed. Those interactions must take place in the mitochondria as it was observed that BHRF1 was a fully mitochondrial protein
Current and Emerging Cell Culture Manufacturing Technologies for Influenza Vaccines
Annually, influenza virus infects millions of people worldwide. Vaccination programs against seasonal influenza infections require the production of hundreds of million doses within a very short period of time. The influenza vaccine is currently produced using a technology developed in the 1940s that relies on replicating the virus in embryonated hens’ eggs. The monovalent viral preparation is inactivated and purified before being formulated in trivalent or tetravalent influenza vaccines. The production process has depended on a continuous supply of eggs. In the case of pandemic outbreaks, this mode of production might be problematic because of a possible drastic reduction in the egg supply and the low flexibility of the manufacturing process resulting in a lack of supply of the required vaccine doses in a timely fashion. Novel production systems using mammalian or insect cell cultures have emerged to overcome the limitations of the egg-based production system. These industrially well-established production systems have been primarily selected for a faster and more flexible response to pandemic threats. Here, we review the most important cell culture manufacturing processes that have been developed in recent years for mass production of influenza vaccines
Estudi sobre l'efecte de BHRF1 en la inhibició de l'apoptosi i el control del cicle cel·lular en cèl·lules d'hibridoma
En l'actualitat, la industria farmacèutica utilitza la tecnologia basada en el cultiu in vitro de cèl·lules animals per a la producciĂł de compostos d'elevat interès terapèutic i tambĂ©, com a model biològic per assajar l'activitat de nous fĂ rmacs. Moltes empreses fan Ăşs d'aquesta tecnologia ja que es tracta del sistema biològic mĂ©s apropiat per obtenir proteĂŻnes complexes. Tot i aixĂ, pel que fa a l'Ăşs de cèl·lules animals, existeixen una sèrie de limitacions importants, entre les que es troba la pèrdua de viabilitat de les cèl·lules en cultiu, degut a l'activaciĂł del procĂ©s de mort cel·lular programada o apoptosi. La principal causa de l'activaciĂł d'aquest tipus de mort cel·lular Ă©s l'esgotament de determinats nutrients essencials o factors de creixement i l'acumulaciĂł de metabòlits tòxics per a la cèl·lula al llarg del cultiu. L'apoptosi representa un greu inconvenient a nivell del cultiu in vitro en bioreactors, ja que disminueix drĂ sticament la viabilitat del cultiu i, en conseqüència, la productivitat del bioreactor. En aquest treball, s'han utilitzat cèl·lules murines d'hibridoma KB26.5 productores de la immunoglobulina IgG3, transfectades amb el gen bhrf1 i s'ha comprovat com aquesta modificaciĂł Ă©s capaç de reduir el nivell de mort per apoptosi, i garantir la supervivència de les cèl·lules durant un perĂode on hi ha una situaciĂł d'inducciĂł a l'apoptosi. Aquesta capacitat s'ha observat en dos sistemes de cultiu cel·lular com sĂłn el discontinu i la perfusiĂł. Aquest Ăşltim sistema de cultiu s'ha posat en evidència que, a mĂ©s de conferir una major resistència a la mort cel·lular, BHRF1 afecta al cicle cel·lular tant sols en els moments de limitaciĂł de nutrients. Aquestes observacions han portat a estudiar els efectes intracel·lulars de BHRF1 per entendre com l'expressiĂł d'aquest gen vĂric era capaç de produir aquests efectes fenotĂpics. S'ha determinat que BHRF1 no es limita tant sols a l'aturada de l'apoptosi a nivell mitocondrial, sinĂł que Ă©s capaç d'influir en diverses rutes que intervenen en processos vitals per la cèl·lula. Les anĂ lisi realitzades amb microarrays de DNA han revelat la capacitat de BHRF1 d'induir de forma diferencial l'expressiĂł de gens relacionats amb l'apoptosi, el cicle cel·lular, la ruta Akt/mTOR i la via de JNK. A mĂ©s, estudis realitzats mitjançant PCR en temps real han indicat que, tant sols en condicions inductores de l'apoptosi, es produeix una sobreexpressiĂł de bcl2 en les cèl·lules KB26.5 transfectades amb el gen bhrf1, indicant que hi ha una relaciĂł entre les dues proteĂŻnes codificades per aquests gens. Per tal de veure els efectes de la sobreexpressiĂł de bcl2 s'han utilitzat inhibidors quĂmics especĂfics per la proteĂŻna Bcl-2. Com a resultat s'ha anul·lat la resistència a l'apoptosi per part d'aquelles cèl·lules amb expressiĂł de BHRF1. La sobreexpressiĂł de bcl2 es pot relacionar, a mĂ©s, amb l'aturada observada del cicle cel·lular en la fase G1. La relaciĂł entre BHRF1 i Bcl-2 no s'ha constatat a travĂ©s d'una interacciĂł directa, ja que tant sols s'han vist interaccions de BHRF1 amb la proteĂŻna proapoptòtica Bim i amb VRK2, relacionada amb la ruta JNK. Aquestes interaccions proteiques poden explicar la conservaciĂł de la integritat mitocondrial que s'ha observat en aquelles cèl·lules amb presència de BHRF1 i la resistència a l'apoptosi en condicions d'estrès. En aquest treball s'ha determinat tambĂ© que BHRF1 Ă©s una proteĂŻna exclusivament mitocondrial, ja que aquesta no varia la seva localitzaciĂł cel·lular tant en un context d'alta viabilitat cel·lular com d'apoptosi, per tant les interaccions proteiques s'han de donar a nivell del mitocondri.Now a day the pharmaceutical industry uses the in vitro animal cell culture technology for the production of elevated therapeutic interest products as well as biological model for the assay of novel drugs. Many corporations use this technology as the best approach to obtain complex molecules. Notwithstanding there are several important drawbacks on the animal cell culture. Among them there is the loose of viability in cultured cells due to the activation of the programed cell death or apoptosis. The main origin of the apoptosis triggering is the essential nutrient or growth factors deprivation and the accumulation of harmful metabolites during the cell culture. Apoptosis represents a major inconvenient for the in vitro cell culture in bioreactors as is responsible for the dramatic cell viability reduction and consequently a decrease in productivity. The IgG3 producing murine hybridoma cells KB26.5 have been used in this thesis. These cells have been transfected with bhrf1 gene and it was checked that this particular modification was able to reduce the number of apoptotic cells and ensure cell survival in proapoptotic conditions. This ability was observed in two cell culture systems such as batch and perfusion. The later culture system clearly showed that BHRF1 directly affects to the cell cycle only in a nutrient limitation situations. These observations led to a deep study of the BHRF1 intracellular effects to understand how the expression of this gene was able to generate those phenotypical effects. It was determined that the cellular effect of BHRF1 was not only constricted to prevent the apoptosis by itself at a mitochondrial level, but also was able to influence on several essential pathways. Microarray analysis unveiled the BHRF1 capability to differentially induce gene expression related to apoptosis, cell cycle, Akt/mTOR and JNK pathways. Moreover studies using real time PCR showed, only under apoptotic conditions, an over expression of bcl2 in KB26.5 transfected cells with bhrf1 gene. This indicates that exist a relationship between both proteins. In order to see the effect of the bcl2 overexpression two chemical inhibitors for Bcl-2 were used; BHRF1 expressing cells did not exhibit apoptosis resistance. The overexpression of bcl2 can be related with G1 arrest observed under apoptotic conditions in BHRF1 expressing cells in the cell culture systems used. It was not determined a direct interaction between BHRF1 and Bcl-2, even though a direct interaction between BHRF1 and the proapoptotic protein Bim and the JNK pathway related protein VRK2 were observed. Those interactions must take place in the mitochondria as it was observed that BHRF1 was a fully mitochondrial protein