Protocol: Adeno-Associated Virus-Mediated Gene Transfer in Ex Vivo Cultured Embryonic Mammary Gland

Branching morphogenesis of the murine mammary gland starts during late embryogenesis. It is regulated by the signals emanating both from the epithelium and the mesenchyme, yet the molecular mechanisms regulating this process remain poorly understood. We have previously developed a unique whole organ culture technique for embryonic mammary glands, which provides a powerful tool to monitor and manipulate branching morphogenesis ex vivo. Nowadays, RNA sequencing and other transcriptional profiling techniques provide robust methods to identify components of gene regulatory networks driving branching morphogenesis. However, validation of the candidate genes still mainly depends on the use of the transgenic mouse models, especially in mammary gland studies. By comparing different serotypes of recombinant adeno-associated virus (rAAVs), we found out that rAAVs provide sufficient efficiency for gene transfer with different tissue preferences depending on the serotypes of the virus. AAV-2 and AAV-8 preferentially target epithelial and mesenchymal compartments, respectively, while AAV-9 infects both tissues. Here, we describe a protocol for AAV-mediated gene transfer in ex vivo cultured murine embryonic mammary gland facilitating gene function studies on mammary gland branching morphogenesis.Peer reviewe

Superovulation and embryo transfer in dairy cattle : effect of management factors with emphasis on sex-sorted semen

Multiple ovulation and embryo transfer (MOET) has been established in cattle breeding since the 1970s. It is an efficient means to increase the number of offspring from genetically superior females. Despite nearly 50 years of development, the average number of transferable embryos recovered in a single embryo collection has remained nearly constant at approximately six embryos per donor. Several animal-related, environmental and management factors contribute to the outcome of superovulation and embryo recovery. The most prominent factor affecting the success of superovulation is an animal-related attribute: the ovarian follicular population responsive to exogenous gonadotropin stimulation. Environmental factors, such as heat stress or other external factors causing stress, can compromise the embryo yield after superovulation. However, such factors represent a management challenge. The superovulatory outcome is additionally affected by several factors that can conflict with management decisions, including nutritional management of the donor, gonadotropin treatment protocol and semen and technical performance of donor inseminations. The purpose of the work presented in this thesis was to investigate management factors that affect the efficacy of MOET. First, the effect of nutritional protein in the form of rapeseed meal on superovulation of dairy heifers was studied. One-year old heifers were fed diets formulated to meet energy requirements for 800 g daily gain and crude protein either at 14% or 18%, which was higher than the feeding recommendations and the common practice on farms. There was no effect of the higher protein level on the ovulation rate, total number of embryos recovered or the number of transferable embryos. Feeding an energy-adequate diet containing moderate or high protein with respect to feeding recommendations resulted in comparable embryo yields. The efficacy of two commercial FSH products was compared in a retrospective study on superovulations of heifers and cows on Finnish dairy farms and an embryo collection station. A highly purified porcine FSH with a low LH:FSH ratio, Folltropin, was used for 2592 superovulations, and Pluset, containing equal amounts of LH and FSH, was used for 1398 superovulations. Pluset-treated donors had a higher ovulation rate, yielding 1.1 recovered structures (embryos and ova) more than those receiving Folltropin. However, the difference was characterized by more unfertilized ova (UFO). For transferable embryos, the number, quality and developmental stage were similar for both preparations. Therefore, it can be concluded that the efficacy of the preparations is comparable. The effect of sex-sorted semen on efficacy of MOET was investigated from a dataset of commercial embryo collections and transfers. A total of 443 embryo collections produced with sex-sorted semen and 1528 produced with conventional semen were analyzed. Sex-sorted semen decreased the number of transferable embryos and increased proportions of UFO and degenerated embryos, compared with non-sorted semen. The decrease was more evident in cows than in heifers. The proportion of poor quality embryos was higher and there was a slight delay in the embryo developmental kinetics for sexed embryos. The risk of recovering no transferable embryos was increased when sex-sorted semen was used. Pregnancy rates after transfer of embryos produced with sex-sorted semen were 12% lower than for embryos originating from conventional semen. It can be concluded from these studies on sexed semen that the use of sex-sorted semen is profitable because more female calves can be produced from a donor heifer, wasting less recipient resources. For superovulated cows, equal numbers of female calves can be produced per embryo collection, but the need for only half the number of recipients compared with using conventional semen favors the use of sexed semen when female progeny are desired.Lypsylehmät Suomessa poikivat elämänsä aikana keskimäärin alle kaksi lehmävasikkaa. Hyvästä lehmästä ei siten jää monta jälkeläistä karjaan, ellei lisääntymistä jollain tavalla tehosteta. Naudan-jalostusta on nopeutettu jo lähes viidenkymmenen vuoden ajan tuottamalla alkioita parhaista eläimistä. Alkiohuuhteluiden ja alkionsiirtojen avulla hyvistä lehmistä saadaan tavanomaista useampia jälkeläisiä, ja samalla kantajina käytettyjen heikoimpien eläinten geenit karsiutuvat. Alkiohuuhteluissa luovuttajaeläimelle aiheutetaan superovulaatio follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) avulla, jolloin yhden munasolun sijaan kypsyy ja hedelmöityy useita munasoluja. Viikon kuluttua hedelmöityksestä alkiot huuhdellaan pois kohdusta ja siirretään oikeassa kiimakierron vaiheessa olevien vastaanottajien kohtuihin tai pakastetaan myöhempiä alkionsiirtoja varten. Keskimäärin alkiohuuhtelu tuottaa kuusi siirtokelpoista alkiota. Määrään vaikuttavat useat eläimestä riippuvat, ympäristöperäiset ja eläinten hoitoon liittyvät tekijät. Väitöskirjatyössä tarkasteltiin erilaisten eläimen hoitoon liittyvien tekijöiden – ruokinnan, superovulaatioon käytettävän hormonivalmisteen sekä sukupuolilajitellun siemenen ¬– vaikutusta alkioiden tuotantoon ja alkionsiirron onnistumiseen. Mitä nuoremmasta eläimestä alkioita pystytään tuottamaan, sitä lyhyemmäksi sukupolvien väli jää ja sitä nopeampaa on jalostuksen edistyminen. Näin ollen merkittävin eläinryhmä alkiotuotannon kannalta ovat nuoret hiehot. Väitöskirjatyössä selvitettiin hiehojen rehustuksen raakavalkuaispitoisuuden vaikutusta alkioiden määrään ja laatuun. Lähellä siemennysikää olevia hiehoja ruokittiin kahden kuukauden ajan ennen alkiohuuhtelua rehulla, jossa oli raakavalkuaista joko tavanomaisesti (14 %) tai paljon (18 %). Valkuaispitoisuudella ei ollut vaikutusta siirtokelpoisten alkioiden määrään, mutta runsaalla valkuaisella ruokituilla eläimillä alkiot olivat keskimäärin parempilaatuisia. Tuloksia voidaan soveltaa käytännön ruokintasuosituksissa alkionluovuttaja¬hiehoille. Käytännön alkionsiirtotyössä keskusteluttaa alinomaa superovulaatiohormonin valinta; toisin sanoen, eroavatko eri FSH-valmisteet vaikutuksiltaan. Kaupallisia valmisteita ei ole kattavasti vertailtu. Retrospektiivisessä tutkimuksessa analysoitiin kahden Suomessa markkinoilla olevan FSH-valmisteen vaikutusta alkiohuuhtelun tulokseen. Aineisto koostui noin 2600:sta Folltropinilla ja 1400:sta Plusetilla tehdystä superovulaatiosta. Plusetilla hoidetut luovuttajat tuottivat yhden hedelmöitymättömän munasolun enemmän kuin Folltropinilla hoidetut. Ero oli siten merkityksetön, sillä siirtokelpoisten alkioiden määrä, laatu ja kehitysasteet olivat yhtäläiset näillä valmisteilla. Siementämällä alkionluovuttaja sukupuolilajitellulla X-siemenellä voidaan lisätä huuhtelusta saatavien naarasalkioiden osuutta sekä vähentää vastaanottajien tarvetta, kun näitä ei tarvita kantamaan vähemmän toivottuja urosalkioita lypsykarjoissa. Tutkimuksessa selvitettiin sukupuolilajitellun siemenen käytön vaikutuksia alkioiden määrään, laatuun, kehitysasteisiin ja tiineyttävyyteen. Sukupuolilajitellun siemenen myötä siirtokelpoisia alkioita saatiin vähemmän ja ne olivat huonolaatuisempia samalla, kun hedelmöitymättömiä munasoluja ja degeneroituneita alkioita saatiin suhteellisesti enemmän lajittelemattomaan siemeneen verrattuna. Lajitellun siemenen käyttö lisäsi riskiä, että alkiohuuhtelusta ei saada lainkaan siirtokelpoisia alkioita. Haitalliset vaikutukset olivat suurempia lehmillä kuin hiehoilla. Alkion vastaanottajien tiinehtyvyys oli 12 prosenttia huonompi siirrettäessä alkioita, jotka oli tuotettu lajiteltua siementä käyttäen kuin lajittelemattomalla siemenellä. Ottaen huomioon kaikki tutkitut muuttujat heikkouksistaan huolimatta sukupuolilajitellun siemenen käyttö todettiin kannattavaksi, kun tavoitellaan mahdollisimman paljon lehmävasikoita käyttäen mahdollisimman vähän vastaanottajia. Erityisesti jalostuksellisesti tärkeimmästä eläinryhmästä, eli hiehoista, saadaan lajitellulla siemenellä tuotettua tehokkaasti seuraava lehmäsukupolvi

Sensuurin määräysten uhmaamisen diskursseja ja niiden moniäänisyyttä Lauri Viidan sotarintamalta lähettämissä kirjeissä

Tutkielmassa tarkastellaan Lauri Viidan talvi- ja jatkosodan aikana puolisolleen kirjoittamien kirjeiden diskursseja. Aineistossa esiintyviä moniäänisyyden piirteitä tarkastellaan sensuurin määräysten ja sääntöjen uhmaamisen näkökulmasta. Lisäksi tehdään havaintoja, löytyykö Viidan henkilökohtaisista kirjeistä samoja moniäänisyyden piirteitä, joita tutkija Anneli Niinimäki on tarkastellut väitöskirjatutkimuksessaan Moniääninen Moreeni (2015). Tutkimusaineisto on poimittu Tampereen yliopiston Kansanperinteen laitoksen mittavasta yli 40 000 sotakirjeen kokoelmasta (SAK). Aineisto kattaa Lauri Viidan kirjekokoelman SAK 492, joka sisältää yhteensä 211 kirjettä ja korttia, ja ne kaikki ovat Lauri Viidan itsensä kirjoittamia. Tutkimus sijoittuu lingvistisen kirjetutkimuksen, erityisesti sota-ajan kirjetutkimuksen, kenttään, ja siinä hyödynnetään diskurssintutkimuksen menetelmiä. Diskurssintutkimus perustuu funktionaaliseen kielikäsitykseen, jonka mukaan kielenkäyttötilanteessa kielelliset merkitykset syntyvät sosiaalisessa vuorovaikutuksessa ja ovat tilannesidonnaisia: niiden taustalta löytyvät kontekstit, jotka tässä tutkielmassa ovat käynnissä olleet sodat ja niiden aiheuttamat vaikeudet, nuorenparin kehittyvä yhteiselämä, korsukumppanuus, sensuurin vaikutukset ja kirjoittajan monet mielenliikkeet. Sensuurin määräysten mukaan sota-ajan kirjeet eivät saaneet sisältää mitään sellaista tietoa, joka olisi hyödyttänyt vihollista. Määräykset on tutkielmassa luokiteltu 1) ankarasti kiellettyihin ja 2) sotilaalle sopimattomiin aiheisiin, kuten sodankäynnin kannalta strategiset tiedot joukkojen sijoituspaikoista, vahvuuksista, kunnosta ja siirroista. Sopimattomia aiheita ovat valheellisten juttujen sepittäminen, tosiasioiden vääristely, toisten parjaaminen, vaivoista ruikuttaminen ja muu sopimaton kirjoitus. Sensuurisääntöjä noudatettiin melko hyvin, mutta jotkut eivät niistä piitanneet. Lauri Viidan asenne sotaa kohtaan muuttui sotavuosien kuluessa vähitellen vastenmielisyydeksi, ja kiellettyjä diskursseja esiintyy hänen kirjeissään. Tutkielman tuloksena voidaankin esitellä kirjeiden teksteistä esiintyneet monet kielletyt aiheet, kuten sijoituspaikka- ja sotadiskurssi, väärien lomaperusteiden diskurssi, parjaamis- ja ruikuttamisdiskurssi sekä seksuaalidiskurssi. Kaikissa näissä Viita käytti suomen kielen moniäänisyyden eri keinoja, kuten intertekstuaalisuutta, alluusiota, metaforaa ja ironiaa. Tutkimus osoitti, että hänen käyttämänsä kielen keinot olivat samoja, joita Anneli Niinimäki nosti esiin väitöskirjassaan Moreeni-romaanista. Tutkimusaineiston perusteella Lauri Viidan sotakirjeillä voi tulkita olleen hänelle yhteydenpidon ja kokemusten jakamisen lisäksi myös kirjailijauran alkuun ajoittuva erilaisten kielellisten vaihtoehtojen kokeilu- ja harjoittelutehtävä, josta saamiaan kokemuksia hän myöhemmin hyödynsi luodessaan kaunokirjallista tekstiä

Daytime along-valley winds in the Himalayas as simulated by the Weather Research and Forecasting (WRF) model

Peer reviewe

Scribble and alpha-Catenin cooperatively regulate epithelial homeostasis and growth

Epithelial homeostasis is an emergent property of both physical and biochemical signals emanating from neighboring cells and across tissue. A recent study reveals that Scribble, an apico-basal polarity determinant, cooperates with alpha-Catenin, an adherens junction component, to regulate tissue homeostasis in the Drosophila wing imaginal disc. However, it remains to be addressed whether similar mechanisms are utilized in vertebrates. In this study, we first address how alpha-Catenin cooperates with Scribble to regulate epithelial homeostasis and growth in mammalian cells. Our data show that alpha-Catenin and Scribble interact physically in mammalian cells. We then found that both alpha-Catenin and Scribble are required for regulating nuclear translocation of YAP, an effector of the Hippo signaling pathway. Furthermore, ectopic Scribble suffices to suppress YAP in an alpha-Catenin-dependent manner. Then, to test our hypothesis that Scribble amounts impact epithelial growth, we use the Drosophila wing imaginal disc. We show that Scribble expression is complementary to Yorkie signal, the Drosophila ortholog of YAP. Ectopic expression of full-length Scribble or Scribble Leucine Rich Region (LRR):alpha-Catenin chimera sufficiently down-regulates Yorkie signal, leading to smaller wing size. Moreover, Scribble LRR:alpha-Catenin chimera rescues scribble mutant clones in the wing imaginal disc to maintain tissue homeostasis. Taken together, our studies suggest that the association of cell polarity component Scribble with alpha-Catenin plays a conserved role in epithelial homeostasis and growth.Peer reviewe

Quaternary ammonium-functionalized silica sorbents for the solid-phase extraction of aromatic amines under normal phase conditions

Quaternary ammonium-functionalized silica materials were synthesized and applied for solid-phase extraction (SPE) of aromatic amines, which are classified as priority pollutants by US Environmental Protection Agency. Hexamethylenetetramine used for silica surface modification for the first time was employed as SPE sorbent under normal phase conditions. Hexaminium-functionalized silica demonstrated excellent extraction efficiencies for o-toluidine, 4-ethylaniline and quinoline (recoveries 101–107%), while for N,N-dimethylaniline and N-isopropylaniline recoveries were from low to moderate (14–46%). In addition, the suitability of 1-alkyl-3-(propyl-3-sulfonate) imidazolium-functionalized silica as SPE sorbent was tested under normal phase conditions. The recoveries achieved for the five aromatic amines ranged from 89 to 99%. The stability of the sorbent was evaluated during and after 150 extractions. Coefficients of variation between 4.5 and 10.2% proved a high stability of the synthesized sorbent. Elution was carried out using acetonitrile in the case of hexaminium-functionalized silica and water for 1-alkyl-3-(propyl-3-sulfonate) imidazolium-functionalized silica sorbent. After the extraction the analytes were separated and detected by liquid chromatography ultraviolet detection (LC-UV). The retention mechanism of the materials was primarily based on polar hydrogen bonding and π–π interactions. Comparison made with activated silica proved the quaternary ammonium-functionalized materials to offer different selectivity and better extraction efficiencies for aromatic amines. Finally, 1-alkyl-3-(propyl-3-sulfonate) imidazolium-functionalized silica sorbent was successfully tested for the extraction of wastewater and soil samples.M.-L.R. and J.-P.M. would like to thank the Academy of Finland Centre of Excellence program (project. no.1118615) for financial support, and L.V. thanks “Generalitat Valenciana” (Spain) for her post-doctoral grant. In addition, financial support was provided by Kempe Foundations as well as Knut and Alice Wallenberg Foundations (J.-P.M.)

Protocol for Studying Embryonic Mammary Gland Branching Morphogenesis Ex Vivo

Mammary gland development starts during embryogenesis, and the process continues after birth. During development, the mammary gland undergoes massive morphological and physiological alterations including growth, invasion, and branching morphogenesis providing an ideal model for stem cell and cancer biology studies. Great efforts have been made in understanding mammary gland development during puberty and adulthood; however, the process during embryogenesis is still elusive. One reason is that the tools to study tissue dynamics during development are limited, which is partially due to the lack of an ex vivo culture method. Here we describe an updated organ culture protocol of the murine embryonic mammary gland. This powerful tool allows monitoring of growth and branching morphogenesis of mammary gland ex vivo by live imaging. In addition, we introduce a novel method for culturing intact, stroma-free mammary rudiments from late gestation mouse embryos in 3D in Matrigel. This approach can be used to identify the direct stromal cues for branching morphogenesis.Non peer reviewe

New insights into fetal mammary gland morphogenesis : differential effects of natural and environmental estrogens

An increased breast cancer risk during adulthood has been linked to estrogen exposure during fetal life. However, the impossibility of removing estrogens from the feto-maternal unit has hindered the testing of estrogen's direct effect on mammary gland organogenesis. To overcome this limitation, we developed an ex vivo culture method of the mammary gland where the direct action of estrogens can be tested during embryonic days (E) 14 to 19. Mouse mammary buds dissected at E14 and cultured for 5 days showed that estrogens directly altered fetal mammary gland development. Exposure to 0.1 pM, 10 pM, and 1 nM 17 beta-estradiol (E2) resulted in monotonic inhibition of mammary buds ductal growth. In contrast, Bisphenol-A (BPA) elicited a non-monotonic response. At environmentally relevant doses (1 mu M), BPA significantly increased ductal growth, as previously observed in vivo, while 1 mu M BPA significantly inhibited ductal growth. Ductal branching followed the same pattern. This effect of BPA was blocked by Fulvestrant, a full estrogen antagonist, while the effect of estradiol was not. This method may be used to study the hormonal regulation of mammary gland development, and to test newly synthesized chemicals that are released into the environment without proper assessment of their hormonal action on critical targets like the mammary gland.Peer reviewe