Expression of recombinant multi-coloured fluorescent antibodies in gor -/trxB- E. coli cytoplasm

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Antibody-fluorophore conjugates are invaluable reagents used in contemporary molecular cell biology for imaging, cell sorting and tracking intracellular events. However they suffer in some cases from batch to batch variation, partial loss of binding and susceptibility to photo-bleaching. In theory, these issues can all be addressed by using recombinant antibody fused directly to genetically encoded fluorescent reporters. However, single-chain fragment variable domains linked by long flexible linkers are themselves prone to disassociation and aggregation, and in some cases with isoelectric points incompatible with use in physiologically relevant milieu. Here we describe a general approach that permits fully functional intracellular production of a range of coloured fluorescent recombinant antibodies with optimally orientated V_H/V_Linterfaces and isoelectric points compatible for use in physiological solutions at pH 7.4 with a binding site to fluorophore stoichiometry of 1:1.</p> <p>Results</p> <p>Here we report the design, assembly, intracellular bacterial production and purification of a panel of novel antibody fluorescent protein fusion constructs. The insertion of monomeric fluorescent protein derived from either <it>Discosoma </it>or <it>Aequorea </it>in-between the variable regions of anti-p185^HER2-ECDantibody 4D5-8 resulted in optimal V_H/V_Linterface interactions to create soluble coloured antibodies each with a single binding site, with isoelectric points of 6.5- 6. The fluorescent antibodies used in cell staining studies with SK-BR-3 cells retained the fluorophore properties and antibody specificity functions, whereas the conventional 4D5-8 single chain antibody with a (Gly₄Ser)₃linker precipitated at physiological pH 7.4.</p> <p>Conclusions</p> <p>This modular monomeric recombinant fluorescent antibody platform may be used to create a range of recombinant coloured antibody molecules for quantitative <it>in situ, in vivo </it>and <it>ex vivo </it>imaging, cell sorting and cell trafficking studies. Assembling the single chain antibody with monomeric fluorescent protein linker facilitates optimal variable domain pairing and alters the isoelectric point of the recombinant 4D5-8 protein conferring solubility at physiological pH 7.4. The efficient intracellular expression of these functional molecules opens up the possibility of developing an alternative approach for tagging intracellular targets with fluorescent proteins for a range of molecular cell biology imaging studies.</p

Statistical Description of Hydrodynamic Processes in Ionic Melts with taking into account Polarization Effects

Statistical description of hydrodynamic processes for ionic melts is proposed with taking into account polarization effects caused by the deformation of external ionic shells. This description is carried out by means of the Zubarev nonequilibrium statistical operator method, appropriate for investigations of both strong and weak nonequilibrium processes. The nonequilibrium statistical operator and the generalized hydrodynamic equations that take into account polarization processes are received for ionic-polarization model of ionic molten salts when the nonequilibrium averaged values of densities of ions number, their momentum, dipole momentum and total energy are chosen for the reduced description parameters. A spectrum of collective excitations is investigated within the viscoelastic approximation for ion-polarization model of ionic melts.Comment: 24 pages, RevTex4.1-format, no figure

The experimental prophylaxis of the peroxide periodontitis by antidysbiotic means

Aim: To determine the periodontoprotective properties of antidysbiotic means (ADM) at the peroxide periodontitis.Methods: ADM (quertulyn, lequin, lecasil and lysozyme-forte) were used. The peroxide periodontitis was reproduced by peroxide sunflower oil introduction in during 2,5 month. The levels of MDA, elastase, urease, lysozyme, catalase were determined into gum. The levels of alkaline and acid phosphatase, calcium and protein were determined into periodontal bone.Results: The introduction of ADM the reduced the levels of inflammation markers (MDA and elastase) and to the degree of  dysbiosis but raised the levels of lysozyme and catalase into gum. ADM reduced the acid phosphatase activity but raised the alkaline phosphatase into bone.Conclusion: Lequin was more effective means as antiinflammation, quertulyn was more effective means as antidysbiotic action, lysozyme-forte was more effective means mineralization action. The lecitine contents means lequin and lecasil possessed more effective action on the degree mineralization of periodontal bone

Маркетингові інструменти впливу на розвиток сфери послуг у час війни в Україні

The article discusses various definitions of marketing, its essence, and its main elements. Different interpretations of these concepts by domestic and foreign scientists have been studied. The main key units of service marketing have been determined. Various marketing concepts and the importance of applying new methods and techniques of marketing in the service sector have been studied. The necessity of applying the main types of services in the development of the economy under market conditions has been highlighted. The role of marketing as a factor in the modern development of the service sector in Ukraine, from the perspective of defining the peculiarities and the need for applying its main instruments and methods, has been highlighted. Attention has been drawn to the peculiarities of marketing and its instruments used in market competition when providing relevant services. Conclusions have been made that different types of services require the application of various management approaches, among which marketing occupies a central place. Marketing strategies that allow enterprises to maintain and develop services have been investigated. The market for various services and transportation services has been analyzed, in particular. It has been proven that the role of marketing in the service sector lies in maximizing consumer and producer satisfaction through the application of modern marketing instruments in Ukraine's market economy, regardless of peacetime or wartime conditions. The authors have formulated proposals for improving the application of marketing instruments in the service market during war and post-war times in Ukraine.У статі розглянуто різні визначення маркетингу, його сутність та основні елементи. Вивчено різні трактування даних понять вітчизняними та зарубіжними науковцями. Визначено основні ключові одиниці маркетингу послуг. Вивчено різні концепції маркетингу та важливість застосування новітніх методів та прийомів маркетингу в сфері послуг. Висвітлено необхідністі застосування основних видів послуг у розвитку економіки у ринкових умовах. Висвітлено роль маркетингу як чинника сучасного розвитку сфери послуг в Україні з погляду визначення особливостей і потреби в застосуванні його головних інструментів і методів. Звернено увагу на особливості маркетингу, його інструменти, що використовуютьсяв умовах ринкової конкуренціїу наданні відповідних послуг. Зроблено висновки.що різні види послуг потребують застосування різноманітних управлінських підходів, центральне місце серед яких займає маркетинг. Досліджено стратегії маркетингу, які дозволяють підтримувати та розвивати послуги,надані підприємствами. Проаналізовано ринок різноманітних послуг і транспортних послуг,.зокрема. Доведено, що роль маркетингу у сфері послуг полягає в максимізації рівня задоволення споживачів і виробників через застосування сучасних маркетингових інструментів у ринковій економіці України не залежно від умов мирного, чи воєнного часу. Авторами сформовано пропозиції щодо покращення застосування маркетингових інструментів на ринку послуг в умовах війни та повоєнний час&nbsp; в Україні

Aluminum surface layer strengthening using intense pulsedbeam radiation of substrate film system

The paper presents formation of the substrate film system (Zr-Ti-Cu/Al) by electric arc spraying of cathode having the appropriate composition. It is shown that the intense beam radiation of the substrate film system is accompanied by formation of the multi-phase state, the microhardness of which exceeds the one of pure A7 aluminum by = 4.5 times

Identification of O-Linked Glycoproteins Binding to the Lectin Helix pomatia Agglutinin as Markers of Metastatic Colorectal Cancer

Background Protein glycosylation is an important post-translational modification shown to be altered in all tumour types studied to date. Mucin glycoproteins have been established as important carriers of O-linked glycans but other glycoproteins exhibiting altered glycosylation repertoires have yet to be identified but offer potential as biomarkers for metastatic cancer. Methodology In this study a glycoproteomic approach was used to identify glycoproteins exhibiting alterations in glycosylation in colorectal cancer and to evaluate the changes in O-linked glycosylation in the context of the p53 and KRAS (codon 12/13) mutation status. Affinity purification with the carbohydrate binding protein from Helix pomatia agglutinin (HPA) was coupled to 2-dimensional gel electrophoresis with mass spectrometry to enable the identification of low abundance O-linked glycoproteins from human colorectal cancer specimens. Results Aberrant O-linked glycosylation was observed to be an early event that occurred irrespective of the p53 and KRAS status and correlating with metastatic colorectal cancer. Affinity purification using the lectin HPA followed by proteomic analysis revealed annexin 4, annexin 5 and CLCA1 to be increased in the metastatic colorectal cancer specimens. The results were validated using a further independent set of specimens and this showed a significant association between the staining score for annexin 4 and HPA and the time to metastasis; independently (annexin A4: Chi square 11.45, P = 0.0007; HPA: Chi square 9.065, P = 0.0026) and in combination (annexin 4 and HPA combined: Chi square 13.47; P = 0.0002). Conclusion Glycoproteins showing changes in O-linked glycosylation in metastatic colorectal cancer have been identified. The glycosylation changes were independent of p53 and KRAS status. These proteins offer potential for further exploration as biomarkers and potential targets for metastatic colorectal cancer

ВИКОРИСТАННЯ КОМБІНОВАНОГО ГЕПАТОПРОТЕКТОРА “ЛЕСФАЛЬ ВІТ” ДЛЯ КОМПЛЕКСНОГО ЛІКУВАННЯ ТА ПРОФІЛАКТИКИ ТОКСИЧНОГО ГЕПАТИТУ В ПАЦІЄНТІВ ІЗ ЛІМФОПРОЛІФЕРАТИВНИМИ ЗАХВОРЮВАННЯМИ

За даними сучасних епідеміологічних і статистичних досліджень, останнім часом в Україні відмічено збільшення зростання частоти захворюваності на хронічну патологію печінки. Перебіг супроводжується виснаженням системи антиоксидантного захисту, на тлі чого розвивається хронічна інтоксикація з метаболічними порушеннями, які негативно впливають на функціональний стан печінки. Мета дослідження – вивчити ефективність застосування комбінованого гепатопротектора “Лесфаль Віт” у складі комплексної терапії у хворих на гемобластози. Матеріали і методи. Під нашим спостереженням перебувало 29 пацієнтів із лімфопроліферативними захворюваннями (5 – із гострими лімфобластними лейкеміями, 15 – із хронічними лімфоїдними лейкеміями, 9 – з неходжкінськими лімфомами: 6 – з неходжкінськими лімфомами з малих лімфоцитів, а 3 хворих – з неходжкінськими лімфомами з великих гранулярних клітин). Вік пацієнтів був від 32 до 67 років. Середня тривалість захворювання становила 5–6 років. Усім хворим проводили ультра­звукове дослідження органів черевної порожнини (УЗД ОЧП) та біохімічні показники функції печінки, а саме, аланінамінотрансфарази (АЛТ), аспартатамінотрансферази (АСТ), білірубіну, лужної фосфатази, тимолової та сулемової проб. Результати досліджень та їх обговорення. Окрім скарг основного захворювання (а це загальна слабість, недомагання, тяжкість у нижніх кінцівках, головокружіння), пацієнтів турбували тяжкість та відчуття розпирання у правому підребер’ї, нудота. Інколи шкіра та слизові оболонки набували жовтяничності. При УЗД ОЧП у 22 хворих спостерігали збільшення розмірів печінки. У середньому вона була збільшена як за рахунок правої частки, так і лівої. У 19 пацієнтів спостерігали підвищення АЛТ та АСТ, в 11 хворих також підвищився білірубін через непряму фракцію. Активність процесу переважно відповідала середньому 58,7 % та вираженому 21,3 % ступеням. У процесі отримання як моно-, так і поліхіміотерапії активність вираження токсичного впливу на стан функції гепатоцитів посилювалася, на що вказували печінкові проби. Так, показники АЛТ та АСТ підвищувалися, також було збільшення лужної фосфатази, білірубіну через непряму фракцію. У 5 хворих на гемобластоз спостерігали жовтяничність шкіри та склер. Висновки. На основі комплексного лікування із застосуванням препарату “Лесфаль Віт” відмічали позитивну динаміку клінічного перебігу основного захворювання, що проявлалася поліпшенням самопочуття, загального стану, зникненням тяжкості в правому підребер’ї. Аналіз показників функціональних проб печінки під впливом терапії показав зниження активності запального процесу в гепатоцитах, на що вказували АЛТ, АСТ, білірубін, лужна фосфатаза. У хворих із мінімальною та середньою активністю ці показники повертались до нормальних величин. У пацієнтів із вираженою активністю дані показники зменшувались. Також встановлено позитивний вплив препарату на білковий метаболізм, про що свідчить підвищення загального білка сироватки крові

Cellular glycosylation affects Herceptin binding and sensitivity of breast cancer cells to doxorubicin and growth factors

Alterations in protein glycosylation are a key feature of oncogenesis and have been shown to affect cancer cell behaviour perturbing cell adhesion, favouring cell migration and metastasis. This study investigated the effect of N-linked glycosylation on the binding of Herceptin to HER2 protein in breast cancer and on the sensitivity of cancer cells to the chemotherapeutic agent doxorubicin (DXR) and growth factors (EGF and IGF-1). The interaction between Herceptin and recombinant HER2 protein and cancer cell surfaces (on-rate/off-rate) was assessed using a quartz crystal microbalance biosensor revealing an increase in the accessibility of HER2 to Herceptin following deglycosylation of cell membrane proteins (deglycosylated cells Bmax: 6.83 Hz; glycosylated cells Bmax: 7.35 Hz). The sensitivity of cells to DXR and to growth factors was evaluated using an MTT assay. Maintenance of SKBR-3 cells in tunicamycin (an inhibitor of N-linked glycosylation) resulted in an increase in sensitivity to DXR (0.1 µM DXR P<0.001) and a decrease in sensitivity to IGF-1 alone and to IGF-1 supplemented with EGF (P<0.001). This report illustrates the importance of N-linked glycosylation in modulating the response of cancer cells to chemotherapeutic and biological treatments and highlights the potential of glycosylation inhibitors as future combination treatments for breast cancer

Robust estimation of bacterial cell count from optical density

Optical density (OD) is widely used to estimate the density of cells in liquid culture, but cannot be compared between instruments without a standardized calibration protocol and is challenging to relate to actual cell count. We address this with an interlaboratory study comparing three simple, low-cost, and highly accessible OD calibration protocols across 244 laboratories, applied to eight strains of constitutive GFP-expressing E. coli. Based on our results, we recommend calibrating OD to estimated cell count using serial dilution of silica microspheres, which produces highly precise calibration (95.5% of residuals &lt;1.2-fold), is easily assessed for quality control, also assesses instrument effective linear range, and can be combined with fluorescence calibration to obtain units of Molecules of Equivalent Fluorescein (MEFL) per cell, allowing direct comparison and data fusion with flow cytometry measurements: in our study, fluorescence per cell measurements showed only a 1.07-fold mean difference between plate reader and flow cytometry data