Glucocorticoid action and mechanism of action in certain progesterone derivatives

Esta Tesis estudia: 1) la influencia de la 11βhidroxilación así como de la introducción de un doble enlace Δ1en la molécula de la progesterona, en las respuestas glucocorticoides (GC); 2) la relación entreconformaciones moleculares de éstas y otras 20 moléculas derivadas, con estas respuestas. Con notorias excepciones (dexametasona (DEX), RU28362 y 5β-dihidroprogesterona), las afinidades de los 22 esteroides estudiados obedecen con una muy buena linealidad a la correlación afinidad por el receptor deglucocorticoides (GR) vs afinidad por transcortina (CBG). Existe una correlación inversa, simétrica conrespecto a la observada para propiedades MC, del ángulo A/BCD de la mayoría de los esteroides estudiadoscon su afinidad por GR (y por consiguiente, por CBG). A estos efectos los esteroides se pueden dividir encuatro grupos: I)de alta afinidad; II)grupo conformacionalmente plano, de baja afinidad; III) los Δ1esteroides, correlacionados en una paralela a sus esteroides madres, que significa menor afinidad por GR o CBG de la que se esperaría de acuerdo con su ángulo de torsión; IV)grupo de esteroides muy torsionados (con baja unión). El conjunto de correlaciones sugiere una torsión óptima para unión a dichas proteínas (entre -20 y -28 para el grupo I. Entre -20 y -36 para el conjunto de los grupos I y III). Contrariamente a loobservado por Duax et al para efecto antiinflamatorio, no se observa correlación de ángulo de torsión vsinducción de TAT (ni utili7ando A/BCD ni C3/D). Las propiedades de 11βhidroxiprogesterona (HOP) y Δ1-11βhidroxiprogesterona (ΔHOP): este par deesteroides posee propiedades glucocorticoides apreciables, a veces muy intensas y carece de otras. Entre lasprimeras se cuentan la unión a GR y/o CBG, la disociación del complejo GR-hsp90, la gran capacidad deinducción de la TAT y la inhibición de la incorporación de nucleótidos y aminoácidos a timocitos (respuestas A). Por el contrario, ninguno de los dos esteroides afecta el peso del timo, ni sensiblemente las propiedadesapoptóticas habitualmente demostradas por otros GC Tampoco indujeron sensiblemente un gen reporter enuna línea celular que expresa el receptor de GC. (respuestas B). Finalmente, a diferencia de las respuestas a todos los demás corticoides ensayados, incluyendo HOP, larespuesta inhibitoria a ΔHOP de la incorporación de nucleótidos y aminoácidos a timocitos no es bloqueadatotalmente por el inhibidor RU486. Si consideramos las respuestas B, ni la progesterona ni sus derivados Δ1 u 11βhidroxilados las expresan. Experimentos con cultivos de timocitos o hepatocitos dependen de la presencia de suero de ternero para quelos esteroides no 11βhidroxilados no expresen respuestas A. En ausencia de dicho suero no existendiferencias de estos derivados con progesterona o su Δ1 derivado: todos expresan respuestas A. Pero ¿es la diferencia observada puramente artificial o acaso encierra un trasfondo fisiológico? El experimento in vivo, que relaciona orden de potencia esteroidea para depósitos de glucógeno con unión a GR así como CBG, sugiere que las proteínas del suero homólogo ejercerían un rol fisiológico "dirigido"como uno de los factores que confieren especificidad GC a la 11β hidroxilación. Los razonamientos sobre ausencia de efectos MC y de unión a MR de moléculas muy torsionadas (grupo IV)permitieron desarrollar el primer antiglucocorticoide (competitivo por GR) específico, ya que carece deafinidad por MR o receptores a progesterona.In this Thesis we study 1) The influence of 11βhydroxylation as well as a Δ1 doublebond on the glucocorticoid (GC) responses to progesterone. With noticeable exceptions (dexamethasone (DEX), RU28362, 5βdihidroprogesterone)the affinities of 22 steroids under investigation exhibit with optimal linearity acorrelation binding to glucocorticoid receptor (GR) vs binding to CBG. Most of themalso exhibit an inverse correlation of their A/BCD angle vs their affinity forglucocorticoid receptors and hence, CBG, this correlation being symmetrical to the oneobserved for the mineralocorticoid (MC) properties. For the first correlation steroidsmay be divided into 4 groups: 1)high affinity, 2)conformationally planar steroids withlow affinity, 3)Δ1 steroids correlating in a parallel with respect to their mother-steroids,amounting to smaller affinities for GR or CBG as those expected from their torsionangles, 4)Highly torsioned steroids with low affinity. Taken together, these correlationssuggest an optimal torsion angle for steroid binding for GR, equalling approx. -20° to 28°for group 1 or -20° to -36° for groups 1 plus 3. In contrast to the similar correlationobserved by Duax et al. for antiinflammatory properties of glucocorticoids, those herestudied failed to exhibit any correlation of TAT induction vs A/BCD or C3/D. Properties of 11βhydroxyprogesterone (HOP) and Δ1-11βhydroxyprogesterone (ΔHOP): This steroid pair exhibits certain noticeable, occasionally intense GCproperties but lacks others. Among the first group, binding to GR and/or CBGdissociation of the GR-hsp90 complex and an intense ability to induce TAT, as well asthe inhibition of nucleotide and aminoacid uptake by thymocytes (responses A). In contrast, none of these steroids affects thymus weight, nor significantly exhibitsapoptotic properties. Neither did they induce a reporter gene in a cellular line known toexpress GR (responses B). Finally, at variance with responses to all other steroids, including HOP, the inhibitoryresponse to ΔHOP of nucleotide or aminoacid uptake by thymocytes is not blocked bythe inhibitor RU486. Neither progesterone nor its Δ1 or 11βhydroxyderivatives express responses B. Experiments with thymocyte or hepatocyte cultures depend on the presence of calfserum for non-11βhydroxylated steroids not to express responses A. In the absence ofthis serum, all steroids express responses A. However, is this difference merelyartifactual, or, to a certain degree, physiological? An in vivo experiment relatingpotency order of steroids for glycogen deposits to their affinity for GR as well as CBGsuggests proteins of homologous serum to possess a physiological role as “targetdirecting factors". They might indeed be one of several factors conferring GCspecificity to 11βhydroxylation. The findings on the absence of MC effects and MRbinding for very torsioned molecules allowed us to develop the first specificantiglucocorticoid, competitive for GR but lacking affinity for MR or progesteronereceptors.Fil: Vicent, Guillermo Pablo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.Fil: Galigniana, Mario D.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Management of cytoskeleton architecture by molecular chaperones and immunophilins

Cytoskeletal structure is continually remodeled to accommodate normal cell growth and to respond to pathophysiological cues. As a consequence, several cytoskeleton-interacting proteins become involved in a variety of cellular processes such as cell growth and division, cell movement, vesicle transportation, cellular organelle location and function, localization and distribution of membrane receptors, and cell-cell communication. Molecular chaperones and immunophilins are counted among the most important proteins that interact closely with the cytoskeleton network, in particular with microtubules and microtubule-associated factors. In several situations, heat-shock proteins and immunophilins work together as a functionally active heterocomplex, although both types of proteins also show independent actions. In circumstances where homeostasis is affected by environmental stresses or due to genetic alterations, chaperone proteins help to stabilize the system. Molecular chaperones facilitate the assembly, disassembly and/or folding/refolding of cytoskeletal proteins, so they prevent aberrant protein aggregation. Nonetheless, the roles of heat-shock proteins and immunophilins are not only limited to solve abnormal situations, but they also have an active participation during the normal differentiation process of the cell and are key factors for many structural and functional rearrangements during this course of action. Cytoskeleton modifications leading to altered localization of nuclear factors may result in loss- or gain-of-function of such factors, which affects the cell cycle and cell development. Therefore, cytoskeletal components are attractive therapeutic targets, particularly microtubules, to prevent pathological situations such as rapidly dividing tumor cells or to favor the process of cell differentiation in other cases. In this review we will address some classical and novel aspects of key regulatory functions of heat-shock proteins and immunophilins as housekeeping factors of the cytoskeletal network.Fil: Quintá, Héctor Ramiro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: Galigniana, Natalia Maricel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: Erlejman, Alejandra Giselle. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Lagadari, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: Piwien Pilipuk, Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); ArgentinaFil: Galigniana, Mario Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental (i); Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentin

The interplay between serine proteases and caspase-1 regulates the autophagy-mediated secretion of Interleukin-1 beta in human neutrophils

Neutrophils play major roles against bacteria and fungi infections not only due to their microbicide properties but also because they release mediators like Interleukin-1 beta (IL-1β) that contribute to orchestrate the inflammatory response. This cytokine is a leaderless protein synthesized in the cytoplasm as a precursor (pro-IL-1β) that is proteolytically processed to its active isoform and released from human neutrophils by secretory autophagy. In most myeloid cells, pro-IL-1β is processed by caspase-1 upon inflammasome activation. Here we employed neutrophils from both healthy donors and patients with a gain-of-function (GOF) NLRP3-mutation to dissect IL-1β processing in these cells. We found that although caspase-1 is required for IL-1β secretion, it undergoes rapid inactivation, and instead, neutrophil serine proteases play a key role in pro-IL-1β processing. Our findings bring to light distinctive features of the regulation of caspase-1 activity in human neutrophils and reveal new molecular mechanisms that control human neutrophil IL-1β secretion.Fil: Keitelman, Irene Angélica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Medicina Experimental. Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires. Instituto de Medicina Experimental; ArgentinaFil: Shiromizu, Carolina Maiumi. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Medicina Experimental. Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires. Instituto de Medicina Experimental; ArgentinaFil: Zgajnar, Nadia Romina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Danielián, Silvia. Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Hospital de Pediatría "Juan P. Garrahan"; ArgentinaFil: Jancic, Carolina Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Medicina Experimental. Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires. Instituto de Medicina Experimental; ArgentinaFil: Marti, Marcelo Adrian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Fuentes, Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Medicina Experimental. Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires. Instituto de Medicina Experimental; ArgentinaFil: Yancoski, Judith. Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Hospital de Pediatría "Juan P. Garrahan"; ArgentinaFil: Vera Aguilar, Douglas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Medicina Experimental. Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires. Instituto de Medicina Experimental; ArgentinaFil: Rosso, David Antonio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Medicina Experimental. Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires. Instituto de Medicina Experimental; ArgentinaFil: Goris, Verónica. Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Hospital de Pediatría "Juan P. Garrahan"; ArgentinaFil: Buda, Guadalupe. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Katsicas, María Martha. Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Hospital de Pediatría "Juan P. Garrahan"; ArgentinaFil: Galigniana, Mario D.. Universidad de Buenos Aires; ArgentinaFil: Galletti, Jeremías Gastón. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Medicina Experimental. Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires. Instituto de Medicina Experimental; ArgentinaFil: Sabbione, Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Medicina Experimental. Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires. Instituto de Medicina Experimental; ArgentinaFil: Trevani, Analía Silvina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Medicina Experimental. Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires. Instituto de Medicina Experimental; Argentin

Steroid Receptor Coupling Becomes Nuclear

In this issue of Chemistry & Biology, Grossman et al. report a study on aldosterone-dependent nuclear translocation of the mineralocorticoid receptor (MR). They analyze the dependency of MR retrotransport, DNA-binding, and transcriptional activity on Hsp90 and demonstrate that MR dimerization is a nuclear event

Nucleocytoplasmic shuttling of the glucocorticoid receptor is influenced by tetratricopeptide repeat-containing proteins

It has been demonstrated that tetratricopeptide-repeat (TPR) domain proteins regulate the subcellular localization of glucocorticoid receptor (GR). This study analyses the influence of the TPR domain of high molecular weight immunophilins in the retrograde transport and nuclear retention of GR. Overexpression of the TPR peptide prevented efficient nuclear accumulation of the GR by disrupting the formation of complexes with the dynein-associated immunophilin FKBP52 (also known as FKBP4), the adaptor transporter importin-β1 (KPNB1), the nuclear pore-associated glycoprotein Nup62 and nuclear matrix-associated structures. We also show that nuclear import of GR was impaired, whereas GR nuclear export was enhanced. Interestingly, the CRM1 (exportin-1) inhibitor leptomycin-B abolished the effects of TPR peptide overexpression, although the drug did not inhibit GR nuclear export itself. This indicates the existence of a TPRdomain- dependent mechanism for the export of nuclear proteins. The expression balance of those TPR domain proteins bound to the GR–Hsp90 complex may determine the subcellular localization and nucleocytoplasmic properties of the receptor, and thereby its pleiotropic biological properties in different tissues and cell types