An integration into the diagnostic workflow in a pediatric patient suspected of having Marfan syndrome

Abstract Background The genetic approach to Marfan syndrome (MFS) has evolved over the last few decades, as has our understanding of the variants' potential structural and functional consequences. It has been proposed that next-generation sequencing be used to improve genetic diagnosis and patient management. To this end, we used a targeted NGS custom panel to perform genetic analysis in a patient with MFS and his or her family members. Case presentation Here, we describe a novel germ-line heterozygous missense variant (transversion c.5371 T > A) found in exon 43 of the FBN1 gene of a patient (proband) with MFS. FBN1 (ENSG0000166147) and TGFB2 (ENSG0000166147) were included in a targeted sequencing panel for MFS (ENSG0000163513). This new variant c.5371 T > A was identified only in the proband, not in unaffected family members or healthy controls. Conclusions Given the massive amount of data generated by gene panel analysis, clinical interpretation of genetic variants may become more difficult. As a result, 3D modeling and multidisciplinary approaches should be used in the analysis and annotation of observed variants. The analysis of the protein's conformational structure in relation to the identified variant could provide useful information. These data can be used to classify observed variants (pathogenic vs non-pathogenic) linked to the MFS phenotype, as well as to track disease progression and potential target treatments

Reducing the environmental impact of surgery on a global scale: systematic review and co-prioritization with healthcare workers in 132 countries

Abstract Background Healthcare cannot achieve net-zero carbon without addressing operating theatres. The aim of this study was to prioritize feasible interventions to reduce the environmental impact of operating theatres. Methods This study adopted a four-phase Delphi consensus co-prioritization methodology. In phase 1, a systematic review of published interventions and global consultation of perioperative healthcare professionals were used to longlist interventions. In phase 2, iterative thematic analysis consolidated comparable interventions into a shortlist. In phase 3, the shortlist was co-prioritized based on patient and clinician views on acceptability, feasibility, and safety. In phase 4, ranked lists of interventions were presented by their relevance to high-income countries and low–middle-income countries. Results In phase 1, 43 interventions were identified, which had low uptake in practice according to 3042 professionals globally. In phase 2, a shortlist of 15 intervention domains was generated. In phase 3, interventions were deemed acceptable for more than 90 per cent of patients except for reducing general anaesthesia (84 per cent) and re-sterilization of ‘single-use’ consumables (86 per cent). In phase 4, the top three shortlisted interventions for high-income countries were: introducing recycling; reducing use of anaesthetic gases; and appropriate clinical waste processing. In phase 4, the top three shortlisted interventions for low–middle-income countries were: introducing reusable surgical devices; reducing use of consumables; and reducing the use of general anaesthesia. Conclusion This is a step toward environmentally sustainable operating environments with actionable interventions applicable to both high– and low–middle–income countries

Caratterizzazione biochimica e funzionale del gene pvf-1, membro della famiglia PDGF/VEGF, in Caenorhabditis elegans

PVF-1 (PDGF/VEGF Factor-1) è un membro della famiglia PDGF/VEGF in C.elegans. I membri di tale famiglia presentano il motivo “PDGF like”, contenente otto residui di cisteina con una caratteristica spaziatura, importante per la formazione di dimeri attivi. Questi ultimi sono fattori angiogenici: inducono angiogenesi in vivo, proliferazione e migrazione di cellule endoteliali in vitro. L’azione è mediata da recettori ad attività tirosin-chinasica e da recettori chiamati Neuropiline, identificate la prima volta nelle cellule nervose e poi ritrovate anche nelle cellule endoteliali. Questa scoperta è stata la prima evidenza di un coinvolgimento nello sviluppo del sistema vascolare di proteine importanti nello sviluppo del sistema nervoso, in particolare nella guida degli assoni. Recentemente è stato dimostrato che i membri della famiglia delle Semaforine mediante l’interazione con la famiglia di recettori delle Plessine e delle Neuropiline, sono in grado di regolare la migrazione non solo degli assoni ma anche delle cellule endoteliali. Lo scopo della tesi è caratterizzare biochimicamente e funzionalmente PVF-1 in C.elegans per chiarire i meccanismi molecolari che regolano la funzione dei geni della famiglia PDGF/VEGF coinvolti non solo nello sviluppo del sistema vascolare, ma anche del sistema nervoso ed identificare nuovi geni che possono interagire nello stesso “pathway”. Nella prima parte del lavoro di tesi è stato dimostrato che PVF-1, prodotta in cellule di mammifero, è una proteina N-glicosilata secreta dalle cellule come dimero. Tale proteina è in grado di legare i recettori umani VEGFR-1 e VEGFR-2 e di indurre la fosforilazione dei residui di tirosina che attivano a loro volta la cascata di trasduzione intracellulare del segnale. Inoltre i risultati ottenuti da due tipi di saggi, l “Capillary-like tube formation” in vitro e “Chorioallantoic Membrane Assay” (CAM) in vivo dimostrano che PVF-1 induce angiogenesi proprio come gli altri membri della famiglia PDGF/VEGF. PVF-1 quindi è l’unico membro della famiglia PDGF/VEGF in C.elegans che conserva le caratteristiche biochimiche e le attività biologiche dei fattori di crescita PDGF/VEGF. Nella seconda parte del lavoro di tesi si analizza l’espressione e la funzione di pvf-1 in C.elegans con tecniche di biologia molecolare ed approcci di genetica classica avendo isolato un putativo mutante nullo del gene. Linee di vermi transgenici esprimono in tutte le cellule muscolari striate durante il secondo ed il terzo stadio larvale di sviluppo un gene marcatore la cui espressione è regolata dalla putativa regione regolativa di pvf-1. Questo dato di espressione spazio-temporale di pvf-1 è stato confermato anche da esperimenti di immunofluorescenza usando un anticorpo policlonale prodotto in coniglio che riconosce PVF-1. In collaborazione con il gruppo di ricerca canadese del Prof. Culotti, è stato isolato da una libreria di mutanti di delezione per PCR con oligo specifici per il gene d’interesse, un putativo mutante nullo di pvf-1, chiamato pvf-1(ev763). L’analisi preliminare dei vermi pvf-1(ev763) evidenzia la mancanza di un ruolo cruciale del fattore sia durante lo sviluppo embrionale e larvale che nella vita adulta. Infatti i vermi omozigoti nulli sono vitali, fertili e non presentano alterazioni morfologiche evidenti. Inoltre considerando che il gene è espresso nelle cellule muscolari striate, si è analizzata la capacità di movimento del mutante rispetto al ceppo selvatico N2. Dall’osservazione di questi vermi risulta che il modo di muoversi dei due ceppi non mostra differenze. Il fatto che pvf-1, come è stato dimostrato nella prima parte del lavoro di tesi, è in grado di indurre angiogenesi in vivo ed in vitro ed è espresso in una precisa finestra temporale di sviluppo del verme in C.elegans suggerisce un suo possibile coinvolgimento in processi di migrazione cellulare che avvengono proprio durante lo stadio larvale L2 e L3. Allo scopo di osservare la migrazione di specifiche cellule nel ceppo mutante del gene d’interesse, pvf-1(ev763) è stato incrociato con ceppi di vermi che mostrano alcune classi di motoneuroni, neuroni sensoriali e due cellule somatiche della gonade, chiamate DTC, marcate con proteine fluorescenti. L’osservazione, mediante microscopio ad alta risoluzione ed a fluorescenza, di questi vermi rivela che pvf-1 non è coinvolto nei processi di migrazione di queste specifiche cellule. La ricerca di un fenotipo dei vermi omozigoti nulli per pvf-1 è proseguita incrociando il ceppo pvf-1(ev763) questa volta con mutanti di geni la cui funzione è già nota al fine non solo di capire in quale processo biologico è coinvolto pvf-1, ma anche di scoprire gli altri geni con cui può interagire. In C.elegans sono stati identificati geni omologhi alle famiglie delle Semaforine e delle Plessine dei vertebrati e per alcuni di essi sono stati anche isolati e caratterizzati i mutanti. In particolare il gene plx-1 che codifica il recettore Plessina-A è coinvolto nel processo di migrazione delle cellule di tipo neuronale che costituiscono il primo raggio della coda del maschio. pvf-1(ev763) è stato incrociato con due alleli mutanti di plx-1, chiamati plx-1(nc37) e plx-1(ev724). L’analisi dei doppi mutanti rivela che l’assenza di PVF-1 determina un aumento di penetranza del fenotipo del primo raggio della coda del maschio rispetto ai singoli mutanti di plx-1. Recentemente è stato anche dimostrato che il gene unc-73 e mig-2, codificanti rispettivamente una proteina coinvolta nell’attivazione dei geni RAC-GTPase, ed una RAC-GTPasica, sono richiesti per la corretta migrazione del primo raggio. I doppi mutanti ottenuti dall’incrocio di pvf-1(ev763) con i mutanti di unc-73 e mig-2 mostrano anch’essi un aumento del fenotipo rispetto ai singoli mutanti. Ciò conferma che PVF-1 è coinvolto nel processo di migrazione del primo raggio della coda del maschio ed agisce mediante una proteina RAC-GTPasi. In seguito si è cercato di scoprire il recettore con cui PVF-1 interagisce per attivare questo meccanismo molecolare. In C.elegans sono stati indetificati, per omologia di sequenza ai VEGFRs dei vertebrati, quattro recettori tirosin-chinasici, chiamati ver-1,ver-2,ver-3 e ver-4. In particolare sono stati isolati i mutanti di ver-3 e ver-4 che sono vitali e non mostrano, come pvf-1(ev763), alcuna alterazione morfologica evidente. I risultati dei doppi mutanti, ottenuti dall’incrocio di ciascun mutante dei recettori con plx-1 rivelano che solo il gene ver-4 si comporta come pvf-1 la cui assenza determina l’aumento del difetto di migrazione del primo raggio, mentre l’assenza di ver-3 sembra sopprimere tale fenotipo. Ciò suggerisce che PVF-1 potrebbe essere il ligando di VER-4. Questa ipotesi è stata successivamente smentita dai risultati ottenuti dal triplo mutante dei geni plx-1, ver-4 e pvf-1. Quest’ultimo infatti non mostra una penetranza del fenotipo uguale a quella del doppio mutante di plx-1 e ver-4 ma maggiore dimostrando che il recettore VER-4 agisce in questo processo con un meccanismo molecolare diverso da quello di PVF-1. Si può concludere che il processo che determina la migrazione delle cellule che costituiscono il primo raggio della coda del maschio è regolato da più meccanismi molecolari. Quello costituito dal ligando SMP-1 ed il recettore PLX-1 è il principale, come è dimostrato dal fatto che i singoli mutanti di questi geni mostrano il difetto di migrazione del primo raggio della coda del maschio, al contrario dei singoli mutanti di pvf-1 e ver-4 che non hanno questo fenotipo. Infine un altro dato interessante emerso in questo lavoro di tesi è che i meccanismi molecolari di SMP-1 e di PVF-1 utilizzano entrambi per la trasduzione del segnale i geni RAC-GTPasi che sono coinvolti in diversi processi di migrazione e crescita degli assoni

In Silico Analysis of Possible Interaction between Host Genomic Transcription Factors (TFs) and Zika Virus (ZikaSPH2015) Strain with Combinatorial Gene Regulation; Virus Versus Host—The Game Reloaded

In silico analysis is a promising approach for understanding biological events in complex diseases. Herein we report on the innovative computational workflow allowed to highlight new direct interactions between human transcription factors (TFs) and an entire genome of virus ZikaSPH2015 strain in order to identify the occurrence of specific motifs on a genomic Zika Virus sequence that is able to bind and, therefore, sequester host’s TFs. The analysis pipeline was performed using different bioinformatics tools available online (free of charge). According to obtained results of this in silico analysis, it is possible to hypothesize that these TFs binding motifs might be able to explain the complex and heterogeneous phenotype presentation in Zika-virus-affected fetuses/newborns, as well as the less severe condition in adults. Moreover, the proposed in silico protocol identified thirty-three different TFs identical to the distribution of TFBSs (Transcription Factor Binding Sites) on ZikaSPH2015 strain, potentially able to influence genes and pathways with biological functions confirming that this approach could find potential answers on disease pathogenesis

In Silico Analysis of Possible Interaction between Host Genomic Transcription Factors (TFs) and Zika Virus (ZikaSPH2015) Strain with Combinatorial Gene Regulation; Virus Versus Host—The Game Reloaded

In silico analysis is a promising approach for understanding biological events in complex diseases. Herein we report on the innovative computational workflow allowed to highlight new direct interactions between human transcription factors (TFs) and an entire genome of virus ZikaSPH2015 strain in order to identify the occurrence of specific motifs on a genomic Zika Virus sequence that is able to bind and, therefore, sequester host’s TFs. The analysis pipeline was performed using different bioinformatics tools available online (free of charge). According to obtained results of this in silico analysis, it is possible to hypothesize that these TFs binding motifs might be able to explain the complex and heterogeneous phenotype presentation in Zika-virus-affected fetuses/newborns, as well as the less severe condition in adults. Moreover, the proposed in silico protocol identified thirty-three different TFs identical to the distribution of TFBSs (Transcription Factor Binding Sites) on ZikaSPH2015 strain, potentially able to influence genes and pathways with biological functions confirming that this approach could find potential answers on disease pathogenesis

Magnesium supplementation in swine finishing stage: performance, carcass characteristics and meat quality

O objetivo deste experimento foi avaliar o efeito da inclusão de óxido de magnésio (MgO) na fase de terminação sobre o desempenho, as características de carcaça e qualidade de carne de suínos. Foram utilizados 48 suínos, suplementados com MgO por 7 dias antes do abate, sendo os tratamentos: rações com 0; 0,2; 0,4 e 0,6% de inclusão de MgO. O delineamento experimental foi em blocos casualizados, sendo os animais blocados de acordo com o peso inicial em leves, médios e pesados. O ganho diário em peso foi influenciado pelos tratamentos, apresentando efeito quadrático com ponto de máxima inclusão de 0,3% de MgO. A suplementação com MgO diminuiu as concentrações séricas de cortisol, apresentando efeito de regressão linear decrescente. A espessura de toucinho apresentou efeito de regressão quadrática, em que o ponto de mínima deposição ocorreu com a inclusão de 0,37% de MgO. Quantidade de carne na carcaça resfriada, rendimento de carne na carcaça e índice de bonificação apresentaram efeito quadrático para suplementação dietética com MgO sendo os pontos de máxima 0,31, 0,37 e 0,28% respectivamente. A porcentagem de perda de água e a perda de água no descongelamento apresentaram efeito quadrático, com pontos de mínima perda iguais a 0,31 e 0,35%, respectivamente.There was evaluated the performance, carcass characteristics and meat quality parameters of swine on the finishing stage receiving a dietetic supplementation with magnesium oxide (MgO). The animals were 48 male swine, supplemented 7 days before the slaughter by the following treatments: feed with 0; 0.2; 0.4 e 0.6% of MgO inclusion. The pigs were blocked by the initial weight as: lights, medium and heavy. The treatments had influence on the daily weight gain showing a quadratic effect, maximum inclusion point 0.3% MgO. The effect on the plasmatic cortisol and on the carcass yield was a linear decreasing regression. Back fat thickness shows a quadratic effect, minimal deposition point 0.37% MgO. Amount of meat in chilled carcass, meat yield and gratification index showed quadratic effect for the treatments, the maximum points are 0.31, 0.37 and 0.28% of inclusion respectively. Water losses and liquid losses on defrosting presented quadratic effect; the minimal point was to 0.31 and 0.35% of inclusion, respectively