Characterization of human IL-35+ regulatory T cells induced by Rhinovirus-treated dendritic cells

IL-35 ist ein Heterodimer, bestehend aus EBV-induziertem Gen 3 (EBI3) und p35, einer der beiden Untereinheiten von IL-12. Dieses Zytokin wurde kürzlich als inhibitorisch beschrieben und wird von den natürlich regulatorischen T-Zellen der Maus, jedoch nicht von denen des Menschen produziert. In dieser Dissertation wird gezeigt, dass Dendritische Zellen, die mit humanem Rhinovirus (HRV) aktiviert sind (R-DZs), die Produktion und Freisetzung von IL-35 in humanen T-Zellen induzieren. Werden T-Zellen mit R-DZs kokultiviert, wird in den T-Zellen eine supprimierende Funktion auf andere T-Zellen beobachtet. Sowohl in CD4+ als auch in CD8+ T-Zellen des peripheren Blutes, jedoch nicht in aus humanem Nabelschnurblut gewonnenen naiven T-Zellen, konnte diese inhibierende Funktion durch R-DZs induziert werden. Weiters wird gezeigt, dass der Zellkulturüberstand von T-Zellen des peripheren Blutes (CD4+ als auch CD8+ T-Zellen), die mit R-DZs kokultiviert wurden, inhibierend ist. Diese Beobachtung lässt den Schluss zu, dass die Effekte nicht durch Zell-Zell-Kontakt, sondern durch lösliche Faktoren hervorgerufen wurden. Die klassischen immun-inhibitorischen Zytokine IL-10, TGF-ß oder IFN-α waren jedoch nicht für diesen Effekt verantwortlich, da ein Blockieren dieser Faktoren durch Antikörper nichts an der hemmenden Eigenschaft des Zellkulturüberstandes änderte. Wir konnten mittels qPCR, Durchflusszytometrie und Immun-Präzipitation zeigen, dass IL-35 von mit R-DZs kokultivierten T-Zellen produziert und freigesetzt wird. Ein Blockieren der beiden IL-35 Untereinheiten (EBI3 und p35) mit Antikörpern gegen diese Strukturen konnte die Hemmung aufheben. Damit wird gezeigt, dass IL-35 für die inhibitorische Eigenschaft des Zellkulturüberstandes verantwortlich ist. Depletion von IL-35 aus dem zuvor hemmenden Zellkulturüberstand führte ebenso zum Verlust dieser Funktion. Die Induktion dieser IL-35 produzierenden T-Zellen (IL-35+ T-Zellen) durch R-DZs zeigte keine Korrelation mit erhöhter Foxp3 Expression. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass keine klassischen regulatorischen T-Zellen induziert werden. Durch das Hochregulieren der inhibitorischen Oberflächenmoleküle B7-H1 (CD274) und Sialoadhesin (CD169) sind R-DZs schlechte T-Zell-Stimulatoren. Als wir diese beiden Oberflächenmoleküle mit Antikörpern, die gegen diese Strukturen gerichtet sind, blockierten, verhinderten wir die Induktion von IL-35. Wir schließen daraus, dass ein kombinatorisches Signal der R-DZs, vermittelt durch B7-H1 und Sialoadhesin, an die T-Zellen für die Induktion der IL-35+ T-Zellen verantwortlich ist. Unsere Ergebnisse beschreiben einen neuen Weg und seine Bausteine in der Induktion von immun-inhibitorischen T-Zellen. IL-35 wird zum ersten Mal als inhibitorisches Zytokin im Humansystem nachgewiesen. Weiters bekommen wir Einblick in die Strategien von HRV, dem Haupterreger des Schnupfens, dem Immunsystem zu entgehen.IL-35 is a heterodimer of EBV-induced gene 3 (EBI3) and of the p35 subunit of IL-12, which has recently been identified as an inhibitory cytokine produced by natural regulatory T cells in mice, but not in humans. Here we demonstrate that dendritic cells (DCs) activated by human rhinoviruses (R-DCs) induce IL-35 production and release in human T cells. The first finding of this thesis was that R-DCs induce a suppressor function in cocultured T cells. This suppressor function was induced in CD4+ and CD8+ T cells derived from human peripheral blood but not in naïve T cells from cord blood. It was further observed that the cell culture supernatant (SN) of peripheral blood T cells (both CD4+ and CD8+) cocultured with R-DCs had an inhibitory effect on T cells. Therefore the inhibition was not cell-cell contact dependent and we focused on soluble factors. When we blocked the classical inhibitory cytokines including IL-10, TGF-ß or IFN-α with antibodies against the respective factors, the SN was still inhibitory. Therefore the inhibition was not caused by the release of these cytokines. Via qPCR, flow cytometry and immuno-precipitation it was shown that, R-DC-induced regulatory T cells produced and released IL-35. When we blocked the inhibitory SN with Abs against either subunit of IL-35, the inhibitory effect was gone. Hence IL-35 was responsible for the inhibitory effect of the SN. In addition, the p35 depleted SN was no longer inhibitory. The induction of IL-35 producing T cells (IL-35+ regulatory T cells) by R-DCs did not correlate with an increased Foxp3 expression, indicating that R-DCs do not induce classical regulatory T cells. In order to determine which structures on R-DCs influence the generation of IL-35+ regulatory T cells, blocking antibodies against R-DCs inhibitory surface molecules B7-H1 (CD274) and sialoadhesin (CD169) were added. Most importantly we observed that, when we blocked B7-H1 and sialoadhesin on the R-DC side with specific mAb against both receptors, the induction of IL-35 was prevented. Thus, the combinatorial signal delivered by R-DCs to T cells via B7-H1 and sialoadhesin is crucial for the induction of human IL-35+ regulatory T cells, defining a new route of T-cell instruction. These results demonstrate a novel pathway and its components for the induction of immune-inhibitory T cells and show for the first time that IL-35 is immune-inhibitory in humans. The findings of this thesis contribute to a better understanding of immune evasion strategies of human rhinoviruses (HRV) the major cause of the common cold

β-Catenin Promotes the Differentiation of Epidermal Langerhans Dendritic Cells

The epithelial signaling protein and transcriptional regulator β-catenin has recently been implicated in hematopoietic dendritic cell (DC) differentiation as well as in DC-mediated tolerance. We here observed that epidermal Langerhans cells (LCs) but not interstitial/dermal DCs express detectable β-catenin. LCs are unique among the DC family members in that LC networks critically depend on epithelial adhesion molecules as well as on the cytokine transforming growth factor-β1 (TGF-β1). However, despite the important functions of LCs in the immune system, the molecular mechanisms governing LC differentiation and maintenance remain poorly defined. We found that TGF-β1 induces β-catenin in progenitor cells undergoing LC differentiation and that β-catenin promotes LC differentiation. Vitamin D, another epidermal signal, enhanced TGF-β1-mediated β-catenin induction and promoted the expression of multiple epithelial genes by LCs. Moreover, full-length vitamin D receptor (VDR) promoted, whereas a truncated VDR diminished, the positive effects of ectopic β-catenin on LC differentiation. Therefore, we here identified β-catenin as a positive regulator of LC differentiation in response to TGF-β1 and identified a functional interaction between β-catenin and VDR in these cells

Identification of bone morphogenetic protein 7 (BMP7) as an instructive factor for human epidermal Langerhans cell differentiation

Human Langerhans cell (LC) precursors populate the epidermis early during prenatal development and thereafter undergo massive proliferation. The prototypic antiproliferative cytokine TGF-β1 is required for LC differentiation from human CD34(+) hematopoietic progenitor cells and blood monocytes in vitro. Similarly, TGF-β1 deficiency results in LC loss in vivo. However, immunohistology studies revealed that human LC niches in early prenatal epidermis and adult basal (germinal) keratinocyte layers lack detectable TGF-β1. Here we demonstrated that these LC niches express high levels of bone morphogenetic protein 7 (BMP7) and that Bmp7-deficient mice exhibit substantially diminished LC numbers, with the remaining cells appearing less dendritic. BMP7 induces LC differentiation and proliferation by activating the BMP type-I receptor ALK3 in the absence of canonical TGF-β1-ALK5 signaling. Conversely, TGF-β1-induced in vitro LC differentiation is mediated via ALK3; however, co-induction of ALK5 diminished TGF-β1-driven LC generation. Therefore, selective ALK3 signaling by BMP7 promotes high LC yields. Within epidermis, BMP7 shows an inverse expression pattern relative to TGF-β1, the latter induced in suprabasal layers and up-regulated in outer layers. We observed that TGF-β1 inhibits microbial activation of BMP7-generated LCs. Therefore, TGF-β1 in suprabasal/outer epidermal layers might inhibit LC activation, resulting in LC network maintenance