Development and function of brain photoreceptors in the annelid Platynereis dumerilii

The aim of this thesis was the molecular, developmental and functional characterization of brain photoreceptors in the annelid Platynereis dumerilii. These results shed new light on the evolution of photoreceptors and circadian centers within Bilateria. Ciliary-type photoreceptors expressing c-opsin1 and the circadian marker bmal were previously identified in the dorsal brain of Platynereis larvae (Arendt et al., 2004), indicating that these brain photoreceptors might be involved in the entrainment of the circadian clock. To study their development, I used EdU incorporation analyses, together with time lapse imaging of embryos expressing fluorescent markers of histones and membranes. This showed that the brain circadian center (demarcated by the expression of bmal and cry1) is mostly formed by cells that belong to the same lineage. These cells are generated by asymmetric cell divisions of neural progenitors expressing the transcription factor rx (retinal homeobox), a crucial regulator of vertebrate pineal, retina and hypothalamus development. Next, I established methods to study gene function in the developing Platynereis embryos (morpholino-mediated knockdown, overexpression of mRNA, knockout with zinc finger nucleases). I applied these methods to study the role of Rx in the development of the ciliary photoreceptor lineage. Rx knockdown resulted in the loss of ciliary photoreceptors and in extensive changes in brain development, consistent with a role of Rx in the maintenance and/or multipotency of neural progenitors. The analysis of the molecular identity of these cells showed that they all express a peropsin gene, the melatonin synthesis marker hiomt and several markers of the pineal complex, the structure that in vertebrates releases the hormone melatonin. Among these cells, a new photoreceptor type was identified, which is an asymmetric serotoninergic cell expressing c-ops1 and several pineal markers. Hierarchical clustering of Platynereis and vertebrate cell types revealed that this serotoninergic cell and the “canonical” ciliary photoreceptors are the Platynereis cells more similar to the vertebrate pineal and retinal photoreceptors. To understand the function of these brain hiomt expressing cells, I investigated the expression of melatonin receptors. In the trochophore larva, the only site of ex- pression of melatonin receptors was the prototroch, a belt of ciliated cells used for locomotion. Melatonin can specifically decrease the activity of the prototroch cells. Ciliary locomotion follows a circadian rhythm (with higher speed during daytime, and lower speed at night), which can be reset by phototransduction. This suggests that melatonin is the clock output mediating nighttime decrease of locomotor activity. This study indicates that serotoninergic and melatonin releasing ciliary photoreceptors existed at the base of Bilateria. These photoreceptors have a conserved regulatory signature (rx, tbx2/3, lhx2/9, miR-7) and their ancestral function was the direct control of ciliary locomotion

A claustrum in reptiles and its role in slow-wave sleep

The mammalian claustrum, owing to its widespread connectivity with other forebrain structures, has been hypothesized to mediate functions that range from decision-making to consciousness(1). Here we report that a homologue of the claustrum, identified by single-cell transcriptomics and viral tracing of connectivity, also exists in a reptile-the Australian bearded dragon Pogona vitticeps. In Pogona, the claustrum underlies the generation of sharp waves during slow-wave sleep. The sharp waves, together with superimposed high-frequency ripples(2), propagate to the entire neighbouring pallial dorsal ventricular ridge (DVR). Unilateral or bilateral lesions of the claustrum suppress the production of sharp-wave ripples during slow-wave sleep in a unilateral or bilateral manner, respectively, but do not affect the regular and rapidly alternating sleep rhythm that is characteristic of sleep in this species(3). The claustrum is thus not involved in the generation of the sleep rhythm itself. Tract tracing revealed that the reptilian claustrum projects widely to a variety of forebrain areas, including the cortex, and that it receives converging inputs from, among others, areas of the mid- and hindbrain that are known to be involved in wake-sleep control in mammals(4-6). Periodically modulating the concentration of serotonin in the claustrum, for example, caused a matching modulation of sharp-wave production there and in the neighbouring DVR. Using transcriptomic approaches, we also identified a claustrum in the turtle Trachemys scripta, a distant reptilian relative of lizards. The claustrum is therefore an ancient structure that was probably already present in the brain of the common vertebrate ancestor of reptiles and mammals. It may have an important role in the control of brain states owing to the ascending input it receives from the mid- and hindbrain, its widespread projections to the forebrain and its role in sharp-wave generation during slow-wave sleep

Ruolo di proteine che legano l'RNA (RBP) nello sviluppo della retina neurale

Nel corso dello sviluppo embrionale la formazione di tessuti neurali avviene a partire da progenitori multipotenti e richiede una regolazione integrata della loro proliferazione, dell'uscita dal ciclo cellulare e dell'attivazione di fattori necessari al differenziamento La retina di X. laevis e' un sistema ideale per lo studio di questi processi, poiche' e' costituita da cinque tipi di neuroni (fotorecettori, cellule gangliari, orizzontali, amacrine e bipolari) e un tipo di cellula gliale (glia di Müller), facilmente riconoscibili per morfologia e localizzazione negli strati retinici. I diversi tipi cellulari retinici sono generati in una sequenza temporale ben definita ed evolutivamente conservata. Il destino cellulare viene stabilito dall’attivazione di geni specifici, tra i quali geni homeobox come Xotx5b (fotorecettori), Xotx2 e Xvsx1 (bipolari). Come atteso, l’attivazione di questi geni avviene secondo la stessa successione temporale con la quale i corrispettivi tipi cellulari sono generati. E' stato recentemente dimostrato che l'attivazione di questi geni homeobox e' regolata a livello traduzionale, ovvero gli mRNA sono espressi in tutti i progenitori precoci ma le proteine corrispondenti sono tradotte solo nelle cellule destinate a differenziare in bipolari o fotorecettori (Decembrini et al., PloS Biol. 2006). Questo controllo traduzionale e' esercitato da fattori tuttora ignoti in grado di riconoscere segnali in cis nella regione non tradotta in 3' (3'UTR) degli mRNA. E' inoltre ancora sconosciuto se meccanismi di regolazione traduzionale simili agiscano anche a livello di altri geni chiave per la retinogenesi. Da quanto noto in letteratura i principali fattori in grado di regolare la traduzione legando il 3'UTR possono essere microRNA (miRNA) e proteine che legano l'RNA (RBP). Nel mio lavoro di tesi ho studiato alcune RBP candidate per analizzarne il ruolo nella retinogenesi e per verificare se potessero regolare la traduzione dei geni chiave per la specificazione del destino cellulare. In primo luogo, ho determinato il pattern di espressione di mRNA codificanti per RBP candidate sia nell'embione intero (ibridazioni in situ whole-mount) sia con risoluzione cellulare nella retina a diversi stadi di sviluppo (ibridazioni in situ su sezione). Scopo di questa analisi e' stato identificare RBP espresse in progenitori cellulari retinici non ancora usciti dal ciclo cellulare, e quindi soggetti a regolazione traduzionale di geni chiave del destino differenziativo. Da questa analisi sono emerse due proteine piu' interessanti, Xlin-28A e Nrp-1, che ho ulteriormente caratterizzato con esperimenti di tipo funzionale. Per verificare se queste proteine sono coinvolte nel differenziamento, ho condotto saggi di guadagno di funzione. Ho innanzitutto generato i costrutti plasmidici per l'espressione di queste proteine, e ho lipofettato i costrutti nelle vescicole ottiche a stadio embrionale 17 (st.17). Successivamente ho caratterizzato i diversi tipi cellulari generati nelle retine lipofettate in embrioni a st. 42 (stadio di retina matura), utilizzando criteri morfologici o marcatori dei tipi cellulari retinici. Da questi esperimenti e' emerso che Xlin-28A e Nrp-1 alterano in modo diverso le proporzioni dei neuroni retinici. La sovraespressione di Xlin-28A causa un aumento della proporzione di cellule amacrine a discapito dei tipi cellulari piu' tardivi. La sovraespressione di Nrp-1 invece causa la diminuzione della proporzione di fotorecettori e l'aumento della proporzione di cellule gliali. Per capire se queste alterazioni fossero dovute ad effetti delle proteine studiate sulla proliferazione cellulare, ho condotto esperimenti di birthdating (determinazione del momento di uscita dal ciclo cellulare) di progenitori retinici lipofettati, utilizzando iniezioni di Bromodeossiuridina (BrdU) a diversi stadi della retinogenesi. Questi esperimenti mostrano che Xlin-28A non ha effetti sulla proliferazione cellulare, ma causa la generazione di cellule amacrine tardive, producendo un fenotipo eterocronico. Nrp-1 invece induce il differenziamento precoce di tutti i neuroni retinici. I risultati ottenuti suggeriscono che queste due RBPs hanno ruoli differenti nell'istogenesi retinica. Nrp-1 non e' probabilmente coinvolto nella regolazione della traduzione dei geni chiave per la specificazione dei diversi neuroni retinici. Xlin-28A invece altera il timing della retinogenesi e potrebbe agire sui geni responsabili del destino cellulare. Ulteriori esperimenti sono necessari per capire quali siano gli mRNA regolati da queste proteine e caratterizzarne piu' dettagliatamente la funzione nel controllo dell'istogenesi retinica

Update on forebrain evolution: From neurogenesis to thermogenesis

Comparative developmental studies provide growing understanding of vertebrate forebrain evolution. This short review directs the spotlight to some newly emerging aspects, including the evolutionary origin of the proliferative region known as the subventricular zone (SVZ) and of intermediate progenitor cells (IPCs) that populate the SVZ, neural circuits that originated within homologous regions across all amniotes, and the role of thermogenesis in the acquisition of an increased brain size. These data were presented at the 8th European Conference on Comparative Neurobiology

Spatial tissue profiling by imaging-free molecular tomography

Several techniques are currently being developed for spatially resolved omics profiling, but each new method requires the setup of specific detection strategies or specialized instrumentation. Here we describe an imaging-free framework to localize high-throughput readouts within a tissue by cutting the sample into thin strips in a way that allows subsequent image reconstruction. We implemented this framework to transform a low-input RNA sequencing protocol into an imaging-free spatial transcriptomics technique (called STRP-seq) and validated it by profiling the spatial transcriptome of the mouse brain. We applied the technique to the brain of the Australian bearded dragon, Pogona vitticeps. Our results reveal the molecular anatomy of the telencephalon of this lizard, providing evidence for a marked regionalization of the reptilian pallium and subpallium. We expect that STRP-seq can be used to derive spatially resolved data from a range of other omics techniques. A refined spatial sampling technique transforms standard RNA sequencing into a spatial transcriptomics method

Cell-type profiling in salamanders identifies innovations in vertebrate forebrain evolution

The evolution of advanced cognition in vertebrates is associated with two independent innovations in the forebrain: the six-layered neocortex in mammals and the dorsal ventricular ridge (DVR) in sauropsids (reptiles and birds). How these innovations arose in vertebrate ancestors remains unclear. To reconstruct forebrain evolution in tetrapods, we built a cell-type atlas of the telencephalon of the salamander Pleurodeles waltl. Our molecular, developmental, and connectivity data indicate that parts of the sauropsid DVR trace back to tetrapod ancestors. By contrast, the salamander dorsal pallium is devoid of cellular and molecular characteristics of the mammalian neocortex yet shares similarities with the entorhinal cortex and subiculum. Our findings chart the series of innovations that resulted in the emergence of the mammalian six-layered neocortex and the sauropsid DVR