Biomarkers of exposure to organophosphates deposition assessment of non specific metabolites in hair samples in vivo: quantitative and qualitative analysis using gas chromatography/mass spectrometry (GC-MS)

The purpose of the present PhD dissertation was the in vivo assessment of long term exposure to sub-acute doses of organophosphate pesticides Diazinon {O,O-diethyl-O-(2-isopropyl-4methyl-6-pyrimidinyl)} and Chlorpyrifos-ethyl {O,O-diethyl-O-3,5,6-trichloro-2-pyridylphosphorothioate} in terms of determination of the levels of their metabolites in hair. The influence of dose and exposure duration of each pesticide on the concentrations of the non specific metabolites DEP and DETP in hair was also investigated. Also, their role as appropriate biomarkers for the assessment of chronic and past exposure was evaluated. Determination of Diazinon, Chlorpyrifos-ethyl and Propoxur residues in rabbit heart tissue was conducted in order to investigate their cariotoxic effect. In addition, all pesticides were tested to evaluate their potential of inducing oxidative stress and oxidative modifications in the genomic DNA content of the cardiac tissues. The present PhD thesis is constisted of five sections.The first section consists of the in vivo study protocol of exposure to organophosphates Diazinon and Chlorpyrifos-ethyl in rabbits (N=12). Rabbits were divided into four treatment groups of three animals each and were treated with two sub-acute doses of diazinon (3.0, 6.0 mg /kg /day) for four months and with a single dose of Chlorpyrifos-ethyl (18.0 mg /kg /day) for three months. Sample collection was performed monthly during the treatment period. Hair samples were also collected seven months after the last dose for diazinon treated animals.The second section describes the procedure of collection and processing of hair samples. During in vivo experimental project, samples of rabbit hair were collected for the measurement of the pesticides metabolites levels and the assessment of chronic accumulative exposure. Before the beginning of the dosage period, specific parts of the animals back were shaved. Sampling began a month after the first dose administration and samples were collected at the end of every month of the dosage period and seven months after the last in the case of Diazinon treated test animals. Also, urine, blood and faeces samples were abtained at the end of every month. In the next part, the conditions of detection and quantitive analysis of the non specific dialkylphosphates metabolites of the organophosphate Diazinon and Chlorpyrifos-ethyl, in the hair shaft, are described. Specifically, the levels of diethylthiophosphate (DETP) and diethylphosphate (DEP) were estimated at the end of every month of the exposure period by the analytical procedures which included decontamination step, solid-liquid extraction, derivatization process and gas chromatography tandem mass spectrometry (GC-MS) analysis. During the extraction procedure the parameters of extraction duration, temperature and sonication duration were evaluated. The suitability of the exraction solvent was also investigated in regard to the polarity of the analytes DEP and DETP. For GC-MS analysis, a previously proposed method was employed. The procedure was shown to be linear over a wide range of concentrations. The obtained recoveries in rabbit hair were 85 % and 105% for DEP and DETP, respectively. Quantification limits were 15 pg / mg and 37 pg / mg for DEP and DETP respectively.In the third section, the results of analysis of the hair samples are discussed in detail. The mean levels of DEP and DETP in the hair samples of Diazinon treated animals range from 112 to 585 pg / mg and 295 to 988 pg / mg for low and high level dose respectively throughout the four months of exposure. The mean levels of DEP and DETP, obtained from the Cholorpyrifos-ethyl treated animals, ranged from 138 to 1070 pg / mg and 554 to 886 pg / mg respectively during the three months of exposure. Also, the analysis of hair samples seven months after the last Diazinon administration showed that the mean levels of DEP and DETP are within the range of values recorded for the 1-month-exposed sample.Results of hair analysis revealed correlation between Diazinon dosage and detected concentrations of the non specific metabolites DEP and DETP. This seemed to be significant, certainly for DEP, while a tendency is observed for DETP. The quantification of diethyl phosphates also, manifests that increase of the duration of exposure to Chlorpyrifos-ethyl and Diazinon is associated with an increase of accumulation of DEP and DETP in hair samples. These data confirms the ability of hair analysis to assess the chronic exposure to low levels of organophosphates and the usefulness of the employed method of analysis for such purpose.The detected values of diethyl phosphates several months after the last dose administration suggest that hair could be a valuable tool for the assessment of past exposure to pesticides.In the last part, the aim of the study was to assess the effects of long term and low-level exposure to these pesticides on the heart function, simulating the occupational exposure of the agricultural workers. Another eight rabbits were divided into four groups consisting of two animals each. The groups of rabbits were exposed to two different doses of Diazinon (2.6-5.2 mg/Kg /day), Chlorpyrifos-ethyl (8.7-18 mg/Kg/day) and Propoxur (8.8-17.5 mg/Kg/day). Several echocardiographic techniques were used for the assessment of myocardial size and performance. The main findings suggested the presence of impaired systolic and diastolic myocardial function, impaired cardiac index as well as reduced myocardial mass in the pesticide-treated animals compared to controls. Also, histopathologic analysis of cardiac muscle tissue was performed in order to identify possible alterations. The main findings were fibrosis and hemorrhagic infiltration. The levels of localized and systemic oxidative stress parameters like TBARS, protein carbonyls, catalase activity and TAC were also investigated. The data suggest that all tested pesticides induced oxidative stress. At last, all the pesticides were tested for inducing oxidative DNA modifications and the results revealed that they caused significant DNA modifications.Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποσκοπεί στην εκτίμηση της χρόνιας υπό-τοξικής έκθεσης πειραματόζωων στα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα Diazinon {O,O-diethyl-O-[4-methyl-6-propan-2-yl)]pyrimidin-2-yl phosphorothioate} και Chlorpyrifos-ethyl {O,O-diethyl-O-[3,5,6-trichloro-pyridin-2-yl]phosphorothioate} μέσω του προσδιορισμού των επιπέδων των μη ειδικών μεταβολιτών τους στην τρίχα. Διερευνήθηκε η σχέση του επιπέδου των δόσεων και της διάρκειας της έκθεσης με την συσσώρευση των μη ειδικών μεταβολιτών DEP και DETP στην τρίχα και αξιολογήθηκε ο ρόλος τους ως βίο-δεικτών (biomarkers) της χρόνιας και παρελθοντικής έκθεσης. Μετρήθηκαν τα επίπεδα των Diazinon, Chlorpyrifos-ethyl και Propoxur σε καρδιακούς ιστούς εκτεθειμένων κουνελιών και διερευνήθηκε η καρδιοτοξική τους δράση. Τέλος, εκτιμήθηκε η επίδραση τους στο φορτίο του οξειδωτικού στρες στο μυοκαρδιακό ιστό και η ικανότητα πρόκλησης οξειδωτικών βλαβών στο DNA των μυοκυττάρων. Η διδακτορική διατριβή περιλαμβάνει πέντε ενότητες.Η πρώτη ενότητα αναφέρεται στον σχεδιασμό του ερευνητικού πρωτοκόλλου της μελέτης έκθεσης στα Diazinon και Chlorpyrifos-ethyl. Για τη διεξαγωγή του πειράματος επιλέχτηκαν δώδεκα κουνέλια τα οποία οργανώθηκαν σε τέσσερις ομάδες (treatment groups) των τριών ζώων. Η διάρκεια έκθεσης στο Diazinon ήταν τέσσερις μήνες και στο Chlorpyrifos-ethyl τρεις μήνες. Επιλέχτηκαν χαμηλές δόσεις με σκοπό να προσομοιαστεί η διαδικασία με την χρόνια υπότοξική έκθεση επαγγελματικού και γενικού πληθυσμού. Οι δόσεις του Diazinon διαμορφώθηκαν στα 3.0 mg/day/kg και 6.0 mg/day/kg και χορηγήθηκε μια σταθερή δόση του οργανοφωσφορικού φυτοφαρμάκου Clorpyrifos –ethyl (18.0 mg /day /kg).Η δεύτερη ενότητα περιλαμβάνει τη διαδικασία συλλογής και επεξεργασίας των υπό ανάλυση δειγμάτων τρίχας. Κατά τη διάρκεια της in vivo πειραματικής διαδικασίας, συλλέχτηκαν δείγματα τριχών από τα πειραματόζωα στα οποία μετρήθηκαν τα επίπεδα των μεταβολιτών των χορηγούμενων φυτοφαρμάκων με σκοπό την εκτίμηση της χρόνιας συσσωρευτικής έκθεσης. Δείγματα συλλέχτηκαν στο τέλος κάθε μήνα καθ’ όλη τη διάρκεια του πειράματος. Στις ομάδες που εκτέθηκαν στο Diazinon συλλέχτηκαν επίσης δείγματα επτά μήνες μετά το πέρας της τελευταίας δόσης.Στην επόμενη ενότητα, διερευνώνται οι συνθήκες ποιοτικού και ποσοτικού προσδιορισμού των μη ειδικών (non-specific) μεταβολιτών των εντομοκτόνων Diazinon και Chlorpyrifos-ethyl στο στέλεχος της τρίχας. Συγκεκριμένα, μετρήθηκαν τα επίπεδα των diethyl-thiophosphate (DETP) και diethyl-lphosphate (DEP), στο σύνολο των πειραματόζωων, ανά μήνα έκθεσης, με αναλυτικές τεχνικές όπως η αέρια χρωματογραφία σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας (Gas Chromatography-Μass Spectrometry) μετά από στερεά–υγρή επεξεργασία (solid-liquid extraction) των δειγμάτων.Κατά την εκχύλιση των μεταβολιτών από την τρίχα διερευνήθηκαν παράμετροι όπως ο χρόνος εκχύλισης των αναλυτών από την ομογενοποιημένη τρίχα στους υπερήχους (sonication), η θερμοκρασία και ο βέλτιστος διαλύτης εκχύλισης συναρτήσει της πολικότητας των αναλυτών DEP και DETP. Οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν στο 85% και στο 108% για το DEP και DETP αντίστοιχα.Για την ανάλυση απαιτήθηκε παραγωγοποίηση (derivatization) των αναλυτών με 2,3,4,5,6 πεντα-φθορο-βενζυλο-βρωμίδιο και διερευνήθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες αυτής. Το όριο ποσοτικοποίησης της ανάλυσης (LOQ) υπολογίστηκε στα 15 pg/mg για το DEP και στα 37 pg/mg για το DETP. Οι χρόνοι κατακράτησης (Rt) των προς ανάλυση μεταβολιτών DEP και DETP ήταν 18.66 min και 22.08 min αντίστοιχα.Η επόμενη ενότητα αναφέρεται στα αποτελέσματα της ανάλυσης τριχών των πειραματόζωων που εκτέθηκαν στα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα Diazinon και Chlorpyrifos-ethyl. Η ανάλυση των τριχών που συλλέχτηκαν από τα group των πειραματόζωων έδειξε ότι τα προϊόντα μεταβολισμού των Diazinon και Chlorpyrifos-ethyl ανιχνεύονται στο συγκεκριμένο βιολογικό υλικό. Αποδεικνύεται ότι η τρίχα μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν αξιόπιστο βιολογικό υπόστρωμα για την εκτίμηση της επιβάρυνσης σε φυτοφάρμακα. Η ανίχνευση επιπέδων των DEP και DETP επτά μήνες μετά την τελευταία χορήγηση δόσης καθιστά την ανάλυση τρίχας χρήσιμο εργαλείο για την εκτίμηση της παρελθοντικής έκθεσης μέσω της μέτρησης των επιπέδων των συσσωρευμένων μεταβολιτών. Η πειραματική μελέτη έδειξε ακόμα ότι το επίπεδο της δόσης του φυτοφαρμάκου επηρεάζει τα ανιχνευόμενα επίπεδα των μεταβολιτών. Στην περίπτωση του DEP η σχέση ήταν στατιστικά σημαντική (p=0.047) ενώ για το DETP υπήρχε σχετική τάση (p=0.095). Διαπιστώθηκε ότι το DETP ανιχνεύεται στην τρίχα σε μεγαλύτερο βαθμό σε σχέση με το DEP γεγονός που αποδίδεται στο μοτίβο του μεταβολισμού των μητρικών ουσιών αλλά και στις διαφορές στη λιποφιλικότητα και στη βασικότητα μεταξύ των μεταβολιτών που επηρεάζουν τον βαθμό ενσωμάτωσης στη τρίχα.Στην τελευταία ενόητητα παρουσιάζονται τα αποτελέσματα μελέτης που είχε σκοπό να εκτιμήσει την επίδραση των Diazinon, Chlorpyrifos-ethyl και Propoxur στην καρδιακή λειτουργία μετά από μακροχρόνια έκθεση σε υποτοξικές δόσεις. Μελετήθηκαν οι ιστολογικές αλλοιώσεις του μυοκαρδίου, οι παράμετροι του οξειδωτικού στρες και οι τροποποιήσεις στο DNA του καρδιακού ιστού. Στο πειραματικό πρωτόκολλο, τα πειραματόζωα χωριστήκαν σε ομάδες των δύο μελών και σχηματίστηκαν τέσσερα group. Στο πρώτο χορηγήθηκαν δύο δόσεις του οργανοφωσφορικού εστέρα Diazinon, οι οποίες ήταν 2.6 και 5.2 mg/kg/day. Στο δεύτερο group χορηγήθηκαν δύο δόσεις του οργανοφωσφορικού εστέρα Chlorpyrifos-ethyl οι οποίες ήταν 8.7 και 18 mg/ kg/ day. Το τρίτο group εκτέθηκε στο καρβαμιδικό φυτοφάρμακο Propoxur σε δόσεις 8.8 και 17.5 mg/kg/day. Ο σχεδιασμός του in vivo πειραματικού σχήματος περιελάμβανε δύο περιόδους χορήγησης των φυτοφαρμάκων διάρκειας 90 και 30 ημερών ανάμεσα στις οποίες μεσολάβησαν επτά μήνες κατά τους οποίους δεν χορηγήθηκαν ουσίες στα πειραματόζωα. Μετά τη θανάτωση των ζώων, συλλέχτηκαν καρδιακοί ιστοί και ολικό αίμα.Η μελέτη ανέδειξε την καρδιοτοξική επίδραση των υπό μελέτη φυτοφαρμάκων. Παρατηρήθηκε τάση για αύξηση του καρδιακού ρυθμού, εξασθένηση της συστολικής και διαστολικής λειτουργίας καθώς και μείωση της μάζας του μυοκαρδίου. Στα ιστό-παθολογικά ευρήματα περιλαμβάνονταν επιπτώσεις όπως η ίνωση και η αιμορραγική διήθηση. Η αξιολόγηση δεικτών όπως η ενεργότητα της τελομεράσης, η συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα, η ενεργότητα της καταλάσης και τα επίπεδα των TBARS κατέδειξε ότι όλα τα παρασιτοκτόνα που μελετήθηκαν προκαλούν οξειδωτικό στρες στο κυτταρικό περιβάλλον ενώ ταυτόχρονα επιφέρουν οξειδωτικές αλλοιώσεις στο DNA των εκτεθειμένων κουνελιών

Development and application of GC-MS method for monitoring of long-term exposure to the pesticide cypermethrin

Cypermethrin (CPMN) is a synthetic pyrethroid used as an insecticide in large-scale commercial agricultural applications as well as for domestic purposes. In the present study a gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) based method was developed and validated for the quantitation of CPMN metabolites, 3-phenoxybenzoic acid (3-PBA) and cis- and trans- 3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethyl-1-cyclopropane (cis- and trans- Cl(2)CA). The developed method was applied for the monitoring of CPMN metabolites in hair of laboratory animals (rabbits) intentionally exposed per os to CPMN at 40 (low dose) and 80 (high dose) mg/kg weight/day for 16 weeks. The analytical method comprises three main steps: isolation of analytes from hair, analytes derivatization, and subsequent instrumental analysis by GC-MS. The limits of detection ensured by the method are 4.0, 3.9 and 1.0 pg/mg hair for cis-Cl(2)CA, trans-Cl(2)CA and 3-PBA, respectively. The instrument responce is linear (r(2) > 0.99) in the investigated concentrations range from 25 to 1000 pg/mg. With and between-run precision as well as accuracy were estimated and found satisfactory. Analytes were efficiently isolated by solid-liquid extraction from hair with recoveries greater than 84.8% for cis-Cl(2)CA, 87.2% for trans-Cl(2)CA and 96.4% for 3-PBA. Rabbit's hair showed increasing levels for all metabolites (metabolites accumulation in a time and dose dependent manner) over time and in a dose-dependent manner. The developed experimental procedure could be used for biomonitoring of population exposure to CPMN. Copyright (c) 2014 John Wiley & Sons, Ltd

Cardiotoxicity in rabbits after a low-level exposure to diazinon, propoxur, and chlorpyrifos

Lethal cardiac complications leading to death and various arrhythmias have been reported after organophosphate and/or carbamate poisonings. The present study focuses on the long-term effects of repeated low-level exposure to diazinon, propoxur, and chlorpyrifos (CPF) on cardiac function in rabbits. The yearly based experimental scheme of exposure consisted of two oral administration periods, lasting 3 months and I month each, interrupted by an 8-month washout period (total duration 12 months). At the end of the experimental scheme, the rabbits underwent an echocardiographic evaluation under sedation, after which they were killed and the tissue and serum samples were collected. A mild localized cardiotoxic effect was established by echocardiography for the three pesticides tested. Severe histological alterations were identified, especially in the diazinon-treated animals in agreement with increased persistence of this pesticide established in the cardiac tissue. In addition, all pesticides tested increased the oxidative stress and oxidative modifications in the genomic DNA content of the cardiac tissues, each one following a distinct mechanism