Regulation of CXCR3 and CXCR4 expression during terminal differentiation of memory B cells into plasma cells

INHALTSVERZEICHNIS Deckblatt \- Impressum persönlicher Dank 1 Inhaltsverzeichnis 5 2 Einleitung 9 3 Schrifttum 10 4 Material und Methoden 24 5 Ergebnisse 43 6 Diskussion 75 7 Zusammenfassung 89 8 Summary 92 9 Referenzen 31 10 Abkürzungsverzeichnis 107 11 Publikationen und Kongressbeiträge 111 12 Danksagung 114 13 Lebenslauf 115 14 Erklärung 116### Expression und Regulation von CXCR3 und CXCR4 während der terminalen B-Zelldifferenzierung B-Zellen können nach Antigenkontakt in sekundär lymphatischen Organen weiter zu Plamazellvorläufern differenzieren. Ein Teil der entstandenen Plasmablasten kann später im Knochenmark oder entzündetem Gewebe akkumulieren. Bei der Maus spielt der Chemokinrezeptor CXCR4 eine wichtige Rolle bei der Akkumulation der Plasmablasten im Knochenmark. Die Liganden von CXCR3 werden in entzündetem Gewebe gebildet und können Plasmablasten dorthin dirigieren. In dieser Arbeit wurde die Expression und Regulation der Chemokinrezeptoren CXCR3 und CXCR4 während der Ausdifferenzierung von humanen Gedächtnis-B-Zellen zu Plasmazellen sowie deren Expression auf B-Zellpopulationen verschiedener lymphatischer Organe analysiert. B-Zellen wurden über das Oberflächenmolekül CD19 definiert, Gedächtnis-B-Zellen konnten über die Expression von CD27 von den naiven B-Zellen abgegrenzt werden. Plasmablasten und Plasmazellen sind CD19(+)/CD38(++)/CD20(-). Es konnte durchflusszytometrisch in mehr als zehn Experimenten gezeigt werden, dass CXCR3 nicht von naiven B-Zellen, jedoch von einem Teil der Gedächtnis-B-Zellen exprimiert wird. CXCR4 wird von der Mehrheit aller B-Zellen des Bluts ausgeprägt. Eine genauere Analyse der CXCR3-ausprägenden Gedächtnis-B-Zellen ergab in mehr als zehn Experimenten verglichen mit z.B. IgG2 eine signifikante Assoziation der Co-Expression von CXCR3 mit IgG1 (p<0,0001), welche für CXCR4 nicht feststellbar war. In sieben Exprimenten exprimierten die meisten Plasmablasten im Knochenmark CXCR4, während CXCR3 fast nur auf Plasmablasten in Blut von elf Spendern und entzündeten sekundär lymphatischen Organen - wie an acht Tonsillen und an der Schleimhaut des Darms von drei Proben getestet - ausgeprägt wird. Dieses Expressionsmuster lässt vermuten, dass beim Menschen CXCR4 bzw. CXCR3 ebenfalls am Homing in Knochenmark respektive entzündetes Gewebe beteiligt sind. Um die Regulation der CXCR3- bzw. CXCR4-Expression während der Differenzierung von Gedächtnis-B-Zellen zu analysieren, wurden humane B-Zellen in vitro mit unterschiedlichen Methoden T-Zell-abhängig und T-Zell-unabhängig zu Plasmablasten stimuliert. Dazu wurden über magnetisch-assoziierte Zellsortierung B-Zellen zu >98 % aufgereinigt und in > 25 Experimenten mit der konstitutiv CD40L-exprimierenden T-Zelllinie EL4B5 für drei Tage in Anwesenheit von rekombinatem IL-2 und IL-10 co-kultiviert. Anschließend wurden die EL4B5-Zellen entfernt und die B-Zellen für fünf weitere Tage mit IL-2 und IL-10 zu Zellen mit dem Plasmazellphänotyp CD38(++)/CD20(-) weiter stimuliert. Die Antikörpersekretion wurde im ELISpot-Assay überprüft. Die durchflusszytometrische Analyse der CXCR3- und CXCR4-Expression erfolgte am dritten und achten Tag der Kultur. Mit Staphylococcuc aureus Cowan I und CpG 2006 konnten B-Zellen in Anwesenheit von IL-2 und IL-10 T-Zell-unabhängig über den B-Zellrezeptor respektive Toll-like-receptor 9 zu Antikörper- sezernierenden Zellen aktiviert werden. Für die Analyse der Regulation von CXCR3 wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten inflammatorische sowie Th1- und Th2-Zytokine zugefügt. B-Zellen regulierten die Expression von CXCR3 hoch, wenn sie mit dem Th1-Zytokin IFN-g während der ersten drei Tage der Aktivierung co-stimuliert wurden, dies konnte in acht Experimenten nach Aktivierung mit EL4B5-Zellen und in fünf Experimenten nach CpG-Stimulation gezeigt werden. In vivo befinden sich die B-Zellen während dieser frühen Phase der Aktivierung co-lokalisiert mit den T-Zellen innerhalb eines Lymphknotens. Mit der Zugabe des Th2-Zytokins IL-4 sowie mit verschiedenen inflammatorischen Interleukinen konnte die Expression von CXCR3 nicht beeinflusst werden. In sechs parallel durchgeführten Chemotaxis-Assays konnte gezeigt werden, dass mit der Zugabe von IFN-g in Assoziation mit der CXCR3-Expression auch die Frequenz der gegen den CXCR3 Liganden CXCL9 migrierenden Zellen signifikant anstieg (p<0,0313). Ist CXCR3 bereits auf den Gedächtnis-B-Zellen exprimiert, konnte in fünf Experimten gezeigt werden, dass dieser Rezeptor unabhängig von der Co- Stimulation mit IFN-g auch auf späteren Differenzierungsstadien auf der Oberfläche nachweisbar bleibt. Daraus lässt sich folgendes Modell der Plasmazellmigration ableiten. IFN-g bildende Th1-Zellen können die Expression von CXCR3 auf mit ihnen interagierenden B-Zellen induzieren, welche zu CXCR3-ausprägenden Plasmablasten differenzieren. Die im entzündeten Gewebe gebildeten Liganden von CXCR3 locken die entstandenen CXCR3-exprimierenden Plasmablasten an und führen zur im entzündeten Gewebe beschriebenen Akkumulation von Plasmablasten. Möglicherweise ist IFN-g auch an einem Klassenwechsel zu IgG1 beteiligt, eine genaue Zuordnung von Zytokinen zu bestimmten Antikörpersubklassen wie bei der Maus ist jedoch beim Menschen noch nicht bekannt. Das Homing von Plasmablasten ins Knochenmark ist ein T-Zell-abhängiges Geschehen. Da das Ausdifferenzieren von CXCR4(-)-B-Zellen aber in mehr als drei Experimenten unabhängig von der Art der Aktivierung mit dem Hochregulieren der Expression dieses Chemokinrezeptors verbunden war, ist die Expression von CXCR4 kein T-Zell- abhängiges Phänomen. Trotz der tragenden Rolle von CXCR4 an der Akkumulation im Knochenmark, deuten diese Resultate darauf hin, dass das Akkumulieren im Knochenmark nicht ausschließlich über die Expression von CXCR4 reguliert ist. Während für die Expression von CXCR4 kein regulierender Faktor identifiziert werden konnte, wurde analysiert, dass die Induktion von CXCR3 präzise reguliert ist. Die Identifikation von IFN-g als induzierenden Faktor für CXCR3 und dessen korrespondierende Liganden führt zu einem besseren Verständnis der Akkumulation von Plasmablasten und Plasmazellen in chronisch entzündetem Gewebe. Langfristig könnte diese eventuell medikamentös inhibiert werden und so als Therapie von Autoimmunkrankheiten wie dem systemischen Lupus erythematodes oder der rheumatoiden Arthritis eingesetzt werden.### Regulation of CXCR3 and CXCR4 expression during terminal differentiation of memory B cells into plasma cells During antigenic stimulation at non-mucosal sites, the formation of plasma cells takes place in secondary lymphoid tissues. Later, a fraction of these cells can accumulate in bone marrow or inflamed tissues. In mice expression of CXCR4 is important for plasma cell accumulation in the bone marrow. Ligands for CXCR3 are expressed in inflamed tissues and can mediate plasma cell homing to those sites. In this study the expression and regulation of the chemokine receptors CXCR3 and CXCR4 during terminal differentiation of human memory B cells into plasma cells was analyzed. B cells were defined as CD19 positive cells. Memory B cells could be distinguished from naïve B cells by the expression of CD27. Plasmablast and plasma cells are CD38(++)/CD20(-). By flow cytometry it could be shown in more than ten experiments that CXCR3 is absent on naive B cells, but is expressed on a fraction of memory B cells. CXCR4 is expressed by the great majority of all B cells. To specify the CXCR3 expressing memory B cells in more than 10 experiments a significant correlation of the co-expression of CXCR3 and IgG1 could be shown which was absent in the case of CXCR4. In six samples the greater part of bone marrow plasmablasts expressed CXCR4, whereas CXCR3 was mainly expressed on plasmablasts of blood of eleven donors and inflamed secondary lymphoid organs like in seven tonsils and three samples of inflamed mucosa of the gut. These expression pattern leads to the assumption that in humans CXCR4 and CXCR3 are also involved in homing into the bone marrow or inflamed tissue, respectively. To analyse the regulation of the expression of CXCR3 and CXCR4 during differentiation of memory B cells, human B cells were T dependently and T independently activated into plasma blasts with various methods. Therefore purified B cells were co-cultured with the constitutively CD40L expressing cell line EL4B5 in the presence of IL-2 and IL-10. After three days the EL4B5 cells were depleted and the B cells further cultured for five more days with IL-2 and IL-10 by reaching the plasma cell phenotype CD38(++)/CD20(-). Secretion of antibodies was tested in ELISpot assay. The expression of CXCR3 and CXCR4 was studied on day 3 and day 8. B cells were activated T independently by Staphylococcus aureus Cowan I or CpG 2006 by triggering the B cell receptor or toll-like receptor 9, respectively. For the analysis of the regulation of CXCR3 inflammatory as well as Th1 and Th2 derived cytokines were added at various time points. In 13 experiments it could be shown that B cells up-regulated CXCR3 when co-stimulated with the Th1 cytokine IFN-g during the first three days of culture. In the course of an immune response in vivo, before day 3 after antigenic challenge, B cells are found in the lymph nodes adjacent to T helper cells. The addition of the Th2 cytokine IL-4 as well as various inflammatory cytokines did not alter the frequency of CXCR3 expressing cells. In correlation IFN-g could also enhance the frequency of migrating plasma blast towards the CXCR3 ligand CXCL9 shown insix chemotaxis assays . During their differentiation into plasma cells, five experiments showed that CXCR3(+) and CXCR3(-) memory B cells remained stable in the expression of this receptor. Indicating that once induced in memory B cells, CXCR3-Expression remains part of the individual cellular memory. The results presented in this study suggest that the following scenario is at least one mechanism leading to the accumulation of plasma cells within inflamed tissues. Th1 cells can stimulate activated B cells specific for the same antigen to express CXCR3, thus supporting their accumulation within the adjacent inflamed tissue (Fig.24). Plasma cell homing to bone marrow is a specific feature of T-dependent immune responses. As it could be shown in more than three experiments that differentiation of CXCR4(-) B cells is generally accompanied with the expression of this chemokine receptor, the expression of CXCR4 is not a T dependent phenomenon. Although CXCR4 is crucially involved in accumulation of plasma blasts in the bone marrow, these results indicate that the accumulation is not modulated about CXCR4, exclusively. Whereas there was no regulatory factor found for the expression of CXCR4, CXCR3-Expression was induced, precisely. The identification of IFN-g as an inducing factor for expression of CXCR3 and it s ligands leads to better understanding of the accumulation of plasma cells in chronically inflamed tissue. On the long run this migration could be inhibited and function as therapy for autoimmune diseases as systemic lupus erythematosus or rheumatoid arthritis

The principles of growth and isotopic fractionation of stalagmites : A numerical model to reconstruct temperature and precipitation records from stalagmites grown under disequilibrium conditions

Speleothems and stalagmites in particular are frequently used as archives of paleoclimate. Their growth, isotopic carbon and oxygen profiles and the possibility of an exact dating provide time series in a high temporal resolution. However, the interpretation of these profiles is difficult since the isotopic signal in stalagmites underlies several influences outside and inside the cave. In this study the basic principles of stalagmite growth and isotopic enrichment under equilibrium and disequilibrium conditions in dependence on climate related parameters are described quantitatively using numerical models. In a final step these basics are used to develop a combined model, which enables the reconstruction of temperature and drip interval records from isotopic profiles of kinetically grown stalagmites. In contrast to former models, which have been limited in their application to samples developed under equilibrium conditions, this model is able to cope with kinetically grown samples and hence extends the number of stalagmites, which might be investigated. Furthermore the model exceeds the results of former models by yielding drip intervals in addition to temperature records. The model is applied to two stalagmites from Southern Chile and reveals first temperature and drip interval records obtained by stalagmites from extremely low latitudes. The study was carried out in the framework of the daphne Forschergruppe in Heidelberg

Graphene nanoribbons with mixed cove-cape-zigzag edge structure

A recently developed bottom-up synthesis strategy enables the fabrication of graphene nanoribbons with well-defined width and non-trivial edge structures from dedicated molecular precursors. Here we discuss the synthesis and properties of zigzag nanoribbons (ZGNRs) modified with periodic cove-cape-cove units along their edges. Contrary to pristine ZGNRs, which show antiferromagnetic correlation of their edge states, the edge-modified ZGNRs exhibit a finite single particle band gap without localized edge states. We report the on-surface synthesis of such edge-modified ZGNRs and discuss tunneling conductance dI/dV spectra and dI/dV spatial maps that reveal a noticeable localization of electronic states at the cape units and the opening of a band gap without presence of edge states of magnetic origin. A thorough ab initio investigation of the electronic structure identifies the conditions under which antiferromagnetically coupled, edge-localized states reappear in the electronic structure. Further modifications of the ribbon structure are proposed that lead to an enhancement of such features, which could find application in nanoelectronics and spintronics

Historismus und Jugendstil: Verlagseinbände aus der Stadtbibliothek Mainz und der Sammlung Mühlinghaus

In 2009, the Wissenschaftliche Stadtbibliothek Mainz presented an exhibition entitled „Historismus und Jugendstil“ with more than 250 books in publishers' bindings from 1870 to 1914, belonging to the rara collection of the library and mainly to the private collection of Gerhard Mühlinghaus, Frankfurt/Main

Einfluss der Ernährung auf die Entwicklung frühgeborener Kinder in den ersten Lebensmonaten

Vergleichende Analyse des Wachstums frühgeborener Kinder mit einem Geburtsgewicht </= 1500g, die in den Zeiträumen Juni 2001 bis Januar 2005 und Mai 2005 bis Dezember 2007 nach unterschiedlichen Standards ernährt wurden. Fragestellung: Wie hat sich das postnatale Wachstum der Frühgeborenen nach Einführung eines neuen, intensivierten Ernährungsstandard im Vergleich zu dem herkömmlichen Ernährungsstandard bzgl. des initialen Gewichtsverlustes/des Wiedererlangen des Geburtsgewichtes/ der Entwicklung von Körpergewicht, Körperlänge und Kopfumfang/der Körperzusammensetzung verändert? Nach Einführung des neuen, intensivierten Ernährungsstandard zeigte sich ein höheres Wachstum der frühgeborenen Kinder. Die Kinder erreichten die Phase des stabilen Wachstums früher und zeigten infolge dessen im postmenstruellen Alter von 36 Wochen ein signifikant höheres Wachstum bezüglich Körpergröße und Kopfumfang, nicht jedoch bezüglich Körperlänge. Die Inzidenz einer Sepsis sank tendenziell ab und die Körperzusammensetzung der Kinder bei Entlassung unterschied sich im Vergleich der beiden Ernährungsstandards nicht voneinander.Likely due to inappropriate caloric intake the growth of very low birth weight infants often does not match intrauterine trajectories. After a modification of the standard nutritional schedule we investigated whether this can impact postnatal growth. Therefore we compared infants in a control group that included infants from June 2001 to January 2005, who had received nutrition according to the prevailing nutritional standard with infants in a study group, who were admitted during the period of May 2005 to December 2007, after an evidence-based bundle of practice changes to the feeding strategy had been introduced. All in all, optimisation of early postnatal nutrition and daily adjustment of milk intake according to weight gain improved growth, without an unfavourable outcome for body composition

Eigenständige Regionalentwicklung als Strategie für periphere ländliche Räume? Eine Untersuchung aus dem Schweizer Berggebiet

In diesem Artikel wird auf Grundlage zweier Fallstudien aufgezeigt, inwiefern eigenständige Regionalentwicklung eine sinnvolle Strategie für ländlich-periphere Räume darstellt. Für eine erfolgreiche Umsetzung eigenständiger Regionalentwicklung bedarf es einer Kombination interner und externer Ressourcen sowie eines regen Informationsaustausches. Die Hauptauswirkungen eigenständiger Regionalentwicklung sind nicht im wirtschaftlichen, sondern im soziokulturellen Bereich zu sehen. Letztere können sich aber positiv auf die wirtschaftliche Entwicklung auswirken, indem sie innovative Akteure motivieren in peripheren Gegenden zu bleiben und sich für lokale Anliegen zu engagieren. Mit einer gezielten Förderung könnte der Beitrag eigenständiger Regionalentwicklung gestärkt werden. Von Bedeutung sind insbesondere die Bereitstellung von Beratungsangeboten und finanziellen Mitteln, die Vernetzung von Akteuren sowie die Stärkung des sozialen Zusammenhalts

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