Development, validation and clinical evaluation of a broad-range pan-filovirus RT-qPCR

Background: During the five decades since their discovery, filoviruses of four species have caused human hemorrhagic fever outbreaks: Marburg (MARV) marburgvirus, and Zaire (EBOV), Sudan (SUDV) and Bundybugyo (BDBV) ebolaviruses. The largest, devastating EBOV epidemic in West Africa in 2014-16, has been followed by outbreaks of MARV in Uganda, 2017, and EBOV in Democratic Republic of Congo, 2018, emphasizing the need to develop preparedness to diagnose all filoviruses. Objectives: The aim of this study was to optimize a new filovirus RT-qPCR to detect all filoviruses, define its limits of detection (LOD) and perform a field evaluation with outbreak samples. Study design: A pan-filovirus RT-qPCR targeting the L gene was developed and evaluated within the EbolaMoDRAD (Ebola virus: modern approaches for developing bedside rapid diagnostics) project. Specificity and sensitivity were determined and the effect of inactivation and PCR reagents (liquid and lyophilized format) were tested. Results: The LODs for the lyophilized pan-filovirus L-RT-qPCR assay were 9.4 copies per PCR reaction for EBOV, 9.9 for MARV, 1151 for SUDV, 65 for BDBV and 289 for Tai Forest virus. The test was set at the Pasteur Institute, Dakar, Senegal, and 83 Ebola patient samples, with viral load ranging from 5 to 5 million copies of EBOV per reaction, were screened. The results for the patient samples were in 100% concordance with the reference EBOVspecific assay. Discussion: Overall, the assay showed good sensitivity and specificity, covered all filoviruses known to be human pathogens, performed well both in lyophilized and liquid-phase formats and with EBOV outbreak clinical samples.Peer reviewe

Nopea taudinaiheuttajien tunnistaminen biologisiin uhkiin varauduttaessa

Rapid and accurate detection and diagnosis of infectious agents is crucial in preparedness for diseases and biothreats. Due to a lack of rapid diagnostic capabilities, diseases and outbreaks may remain undetected. Currently available point-of-care tests often lack the sensitivity to directly detect pathogens in samples, thus there is a need for quick and robust solutions for identification of pathogens in order to mount appropriate responses. The spread of infectious diseases is a global challenge and outbreaks and epidemics place great strains to healthcare and economy. Several of the pathogens causing these diseases are not only major public health issues but pose also potential biothreats. This thesis describes the performance of field-capable gene amplification methods in the detection of three bacterial pathogens (Francisella tularensis, Bacillus anthracis, and Yersinia pestis) and a viral pathogen causing respiratory infections (influenza A virus). The methods include on-site nucleic-acid extraction and rapid real-time PCR amplification of selected gene regions in these pathogens occurring in animal tissue and human nasopharyngeal samples. Results confirm that currently-available portable thermocyclers can generate highly accurate diagnostic results in field. Furthermore, genetic characterization of a common respiratory pathogen, adenovirus is presented by investigating adenoviruses circulating in Finnish garrisons with molecular sequence analysis. Genetic characterization of a pathogen is also an important tool in investigations of alleged use of biological weapons. The presented methodology and workflow serves as an effective tool for decision makers in biothreat preparedness and in case of deliberate spread of pathogens.Biologisella uhalla tarkoitetaan mikrobin tai muun biologisen materiaalin, kuten toksiinin aiheuttamaa joukkosairastumista tai sen vaaraa, silloin kun tauti ei tartuntavaaransa vuoksi ole hoidettavissa normaalitoimin. Maailmanlaajuisiin biologisiin uhkiin on varauduttava riippumatta siitä, ovatko ne luonnollisia epidemioita tai onko taustalla taudin tahallinen levittäminen, kuten bioterrorismi tai biologisen aseen käyttö. Biologisia uhkia voidaan vähentää tehokkaimmin ehkäisemällä epidemioiden syntyä paikallisesti. Biouhkamikrobit (esim. pernaruttobakteeri tai ebolavirus) aiheuttavat edelleen luonnollisia epidemioita. Kasvanut maailmanlaajuinen liikkuvuus on mahdollistanut taudinaiheuttajien nopean leviämisen ja lisännyt laajojen epidemioiden ja pandemian riskiä. Biolääketieteen uudet menetelmät ja tekniikat ovat entistä helpommin ja yhä useampien saatavilla. Tämä on tuonut uusia haasteita bioterrorismin ehkäisyyn ja kansainvälisen biologiset aseet kieltävän sopimuksen valvonnalle. Bioterrorismin uhkaa voidaan vähentää tiedeyhteisön valveutuneisuutta lisäämällä sekä laboratorioturvallisuutta parantamalla ja näin estää vaarallisten mikrobien joutumista vääriin käsiin. Suomessa toimii Biologisten uhkien osaamiskeskus, joka on Terveyden- ja hyvinvoinnin laitoksen ja Puolustusvoimien logistiikkalaitokseen kuuluvan Sotilaslääketieteen keskuksen yhteinen asiantuntijaorganisaatio. Sen päätehtäviin kuuluu biologisiin uhkiin varautuminen. Biologisiin uhkiin varautumisessa taudinaiheuttajamikrobin nopea tunnistaminen on tärkeää, sillä se mahdollistaa vastatoimien ripeän suunnittelun ja toteutuksen. Perinteiset menetelmät taudinaiheuttajien tunnistamiseksi (esim. mikrobien viljely) ovat usein hitaita tai epäherkkiä, joten molekyylibiologiset testit, kuten reaaliaikaiset geenimonistusmenetelmät, ovat saavuttaneet keskeisen aseman taudinaiheuttajien diagnostiikassa. Luotettavat, kenttäkelpoiset ja helppokäyttöiset tunnistusmenetelmät tehostavat operatiivista toimintakykyä biouhkatilanteissa. Samaa teknologiaa voidaan hyödyntää myös normaaliolojen diagnostiikassa. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin kenttäkäyttöön soveltuvien kannettavien reaaliaikaisten geenimonistusteknologian käytettävyyttä ja kykyä tunnistaa luotettavasti biouhkabakteereita sekä hengitystieviruksia kenttäolosuhteissa. Työssä käytettiin kolmen biouhkabakteerin (Francisella tularensis (jänisruttobakteeri), Bacillus anthracis (pernaruttobakteeri) ja Yersinia pestis (ruttobakteeri)) ja influenssa A -viruksen tunnistavia menetelmiä. Työhön sisältyi lisäksi kenttäolosuhteisiin soveltuvien näytteiden esikäsittelymenetelmien tutkiminen. Väitöskirjatyössä selvitettiin myös geenisekvensaation avulla yleisimmät suomalaisissa varuskunnissa kiertävät ja hengitystieinfektioita aiheuttavat adenoviruksen alatyypit. Geenisekvensointi on tärkeä työkalu epäillyn tahallisen levityksen tutkinnassa. Sen avulla saadaan tarkkaa tietoa taudinaiheuttajasta ja sen alkuperästä. Tulokset vahvistivat, että nykyaikaisella kenttäkelpoisella geenimonistusteknologialla ja kenttäkelpoisilla näytteen esikäsittelymenetelmillä saadaan nopeita ja luotettavia tuloksia kenttäolosuhteissa. Tällaista teknologiaa yhdistettynä geenisekvensointiin voidaan käyttää työkaluna infektioepidemioiden selvitystyössä tai tutkittaessa epäiltyä taudinaiheuttajien tahallista levitystä. Väitöskirjatyön esittämiä menetelmiä voidaan käyttää kaikissa Puolustusvoimien päätehtävissä: maanpuolustuksessa, viranomaisyhteistyössä sekä kansainvälisissä tehtävissä

Monitoring biothreat agents (Francisella tularensis, Bacillus anthracis and Yersinia pestis) with a portable real-time PCR instrument

201