ESTUDO MOLECULAR DE FAMÍLIA COM APRESENTAÇÃO CLÍNICA DE TUMORES RELACIONADOS À SÍNDROME DE VON HIPPEL-LINDAU (VHL)

A síndrome de Von Hippel-Lindau (VHL) é uma desordem familiar autossômica dominante hereditária com penetrância superior a 90% em pessoas com mais de 60 anos e incidência de 1/36.000 nascimentos por ano. É caracterizada pelo desenvolvimento de neoplasias benignas e malignas, decorrentes de mutações no gene VHL, gene supressor tumoral, responsável pela síntese da proteína VHL, que regula, negativamente, a produção de fatores angiogênicos, localizado na região 3p25-26.2. A síndrome é causada pela inativação dessa proteína, sendo esse o fator responsável pelo aumento da produção de fatores de crescimento, o que explica a proliferação vascular dos tumores característicos dessa síndrome, como hemangioblastoma medular, carcinoma de células renais e o feocromocitoma, além de tumores na retina e no cerebelo. Feocromocitomas e paragangliomas são tumores neuroendócrinos raros, têm o diagnóstico baseado em evidências bioquímicas de produção de catecolaminas, podem ser diagnosticados em pacientes de diferentes idades e surgir de forma aleatória. Por outro lado, cerca de 90% desses tumores, quando encontrados em crianças, são associados a alguma síndrome hereditária. O objetivo é realizar um estudo de caso, clínico e molecular de uma família que apresenta como caso índice uma criança de 11 anos com feocromocitoma, diagnosticada e atendida pelo Hospital Universitário de Brasília. Foram coletadas amostras de sangue periférico dos pacientes por punção intravenosa, e feita a extração do DNA por meio do kit da QiAgen. O material genético obtido foi submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR), sendo realizada a amplificação do gene VHL por pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos. A amplificação dos produtos de PCR foi confirmada em gel de agarose a 1%, e os produtos foram submetidos ao sequenciamento automático de Sanger, cuja análise foi realizada pelo software Sequencher®, e os resultados encontrados foram comparados com os principais bancos de dados genômicos. A partir do histórico familiar do paciente e da confirmação de feocromocitoma, foram pesquisados os três éxons do gene VHL, sendo possível identificar a mutação missense R167Q em heterozigose no caso índice, assim como em sua genitora, confirmando a suspeita da síndrome familiar. O diagnóstico de qualquer um dos tumores característicos dessa mutação, principalmente em crianças, é uma indicação para realização de estudos moleculares no caso índice e em todos os membros familiares, assim como a supervisão do grupo familiar para conhecimento dos portadores da mutação. Os tumores advindos da mutação do gene VHL, quando malignos, são de evolução rápida e agressiva. Tendo em vista que a mutação ocorre em umgene supressor tumoral, com o avanço dos estudos dessa e de outras síndromes hereditárias, é possível melhorar o prognóstico e a qualidade de vida dos pacientes, diminuindo a morbidade dos portadores dessas síndromes. Os tumores derivados da síndrome de Von Hippel-Lindau, normalmente, são múltiplos e multifocais, aumentando a necessidade de acompanhamento constante dos pacientes, para avaliar a regressão ou a manifestação de novos tumore

ESTUDO DO GENE MKRN3 EM INDIVÍDUOS PORTADORES DE PUBERDADE PRECOCE CENTRAL IDIOPÁTICA RESIDENTES NO DISTRITO FEDERAL E ENTORNO

A puberdade é a fase que marca a transição da infância para a fase adulta, sendo evidenciada por mudanças fisiológicas, psicológicas e sociais que apontam o desenvolvimento de caracteres sexuais e o amadurecimento da capacidade reprodutiva. Dentro das reações endócrinas, a reativação do eixo Hipotálamo-Hipófise-Gonadal (HHG) é responsável pelo desenvolvimento dos caracteres sexuais e por estimular a síntese de hormônio folículo estimulante (FSH) e hormônio luteinizante (LH). A ativação prematura do eixo HHG resulta em indivíduos com puberdade precoce central (PPC), caracterizada pela evolução puberal prematura. Como consequência dessa afecção têm-se o aumento das gônadas, antecipação da menarca, desenvolvimento mamário e aumento do número e espessura dos pelos. Um paciente é diagnosticado com PPC quando os sinais e sintomas manifestam-se em meninos menores de 9 anos e meninas menores de 8 anos de idade. Estudos demonstram que mutações nos genes KISS1, KISS1R, LIN28B, GPR54 e MKRN3 estão associadas à puberdade precoce. Mutações no gene MKRN3 são descritas em estudos como responsáveis pela PPC idiopática. O objetivo do presente estudo foi investigar a ocorrência de mutações no gene MKRN3 em 30 pacientes previamente diagnosticados com PPC residentes no Distrito Federal e entorno. Para realização da pesquisa foram coletadas amostras de sangue periférico dos pacientes, por punção intravenosa, e extração do DNA por meio do kit da QiAgen. O material genético obtido foi submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR), sendo realizada a amplificação do gene MKRN3 por pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos. A amplificação dos produtos de PCR foi confirmada em gel de agarose a 1% e os produtos foram submetidos ao sequenciamento automático de Sanger. A análise do sequenciamento foi realizada pelo software Sequencher® e os resultados encontrados foram comparados com os principais bancos de dados genômicos. Foram identificados dois pacientes com mutações autossômicas dominantes de penetrância incompleta no gene MKRN3, sendo duas irmãs com mutação missense c.982C_T/p.Arg.328.Cys. A primeira paciente foi incluída no estudo com 7 anos e 11 meses de idade apresentando menarca e pubarca aos 7 anos 8 meses, telarca aos 7 anos, idade óssea de 11 anos, e P2M3 na escala de Tanner. A segunda paciente, com 7 anos e 2 meses de idade apresentando telarca e axilarca aos 6 anos, e P2M2 na escala de Tanner. Os resultados do presente estudo foram fundamentais por auxiliarem no desenvolvimento de pesquisas que estabelecem a relação fisiológica entre os achados genéticos e os fenótipos de afecções, nos quais é possível a ampliação das informações descritas na literatura sobre puberdade precoce. Os dados obtidos são importantes por possibilitarem o acompanhamento genético dos pacientes e a identificação de novos casos familiares, como apontados em estudos que evidenciam a ocorrência de PPC familiar. A investigação genética de outros membros das famílias com pacientes diagnosticados é de suma importância para detectar a patogênese das mutações e potencializar o sucesso do tratamento. Mesmo com o avanço dos estudos, a investigação das causas da puberdade precoce ainda necessita de maior aprofundamento sendo uma área de destaque para pesquisas científica

ESTUDO DA EXPRESSÃO DE GENES E PROTEÍNAS QUE REGULAM A SÍNTESE DE TESTOSTERONA EM CAMUNDONGOS COM OBESIDADE INDUZIDA POR DIETA HIPERLIPÍDICA SUBMETIDOS A DIFERENTES PROTOCOLOS DE EXERCÍCIOS

Kim Sampaio de Lacerda Mileski – UnB, pesquisador colaborador [email protected] obesidade é apontada como fator disruptivo da normalidade de níveis hormonais e físicos, estando relacionada a enfermidades com elevado grau de morbidade e mortalidade, como hipertensão, diabetes e acidentes vasculares. A velocidade de absorção e armazenamento de gordura no Tecido Adiposo (TA) estão associados diretamente a questões endócrinas, genéticas, sedentarismo, gasto energético e tipo de dieta do indivíduo. O gene UCP1 é alvo dos estudos que tem como temática a obesidade e a termogênese, por ter um papel importante no funcionamento do Tecido Adiposo Branco (WAT) e do Tecido Adiposo Marrom (BAT), assim como a enzima AMPK no tecido muscular. O hipogonadismo trata-se de um descontrole fisiológico, em alguns casos decorrente do grau de obesidade, caracterizado pela incapacidade de produzir testosterona, espermatozoides circulantes e consequentemente infertilidade, além de dificuldade de manutenção do tecido muscular. O objetivo do presente estudo foi avaliar a síntese de testosterona de camundongos (n=25) machos de linhagem C57BL/6 submetidos à Dieta Hiperlipídica (DHL) e diferentes protocolos de atividade física. Para realização da pesquisa os animais foram divididos em cinco grupos para avaliação física pré e pós indução de obesidade por DHL. Os grupos realizaram diferentes protocolos experimentais segregados em cinco grupos: (CC) grupo controle, (IF) grupo de inatividade física, (CH) grupo tratado com DHL sem exercício, (MO) grupo tratado com DHL submetido a exercício moderado contínuo, (IN) grupo tratado com DHL submetido a exercício intenso intervalado. Ao término dos experimentos os animais foram novamente avaliados fisicamente e tiveram seus dados, sangue e tecidos de interesse coletados. O material genético foi submetido à reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR), sendo realizada a amplificação do gene UCP1 por pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos. A dosagem de testosterona foi realizada por meio ensaio imunoenzimático competitivo (ELISA kit). Os grupos submetidos a DHL obtiveram um ganho mais acentuado de peso em relação ao CC no momento pré protocolos de atividade física. Após os testes de os grupos MO e IN ganharam menos peso que o CC. Os indivíduos do protocolo de atividade moderada melhoraram a distância percorrida no teste de esteira em relação aos CH e CC. Os grupos CH e MO apresentaram massa dos testículos menores que CC, enquanto o grupo de inatividade física foi semelhante à do grupo controle. A massa do BAT do grupo IN foi maior que o CC, apontando maior eficiência da termogênese neste protocolo. O período de protocolo experimental com camundongos com obesidade induzida por DHL minimizou o ganho de peso quandocomparado com o CC, como também o ganho de peso nos animais magros. Tais dados estabelecem uma relação direta de práticas de atividade física com prevenção de obesidade e afecções metabólicas. Outros estudos envolvendo a termogênese e o papel do BAT são importantes para compreender melhor relação entre tal tecido e a perda da massa de tecido testicular, como também, o aumento da termogênese em protocolos de atividade de alta intensidad

What determines mortality in malignant pheochromocytoma? : report of a case with eighteen-year survival and review of the literature

Pheochromocytoma (PCC) is a tumor derived from adrenomedullary chromaffin cells. Prognosis of malignant PCC is generally poor due to local recurrence or metastasis. We aim to report a case of malignant PCC with 18-year survival and discuss which factors may be related to mortality and long-term survival in malignant pheochromocytoma. The patient, a 45-year-old man, reported sustained arterial hypertension with paroxysmal episodes of tachycardia, associated with head and neck burning sensation, and hand and foot tremors. Diagnosis of PCC was established biochemically and a tumor with infiltration of renal parenchyma was resected. No genetic mutation or copy number variations were identified in SDHB, SDHD, SDHC, MAX and VHL. Over 18 years, tumor progression was managed with 131I-MIBG (iodine-metaiodobenzylguanidine) and 177Lutetium-octreotate therapy. Currently, the patient is asymptomatic and presents sustained stable disease, despite the presence of lung, para-aortic lymph nodes and femoral metastases. Adequate response to treatment with control of tumor progression, absence of significant cardiovascular events and other neoplasms, and lack of mutations in the main predisposing genes reported so far may be factors possibly associated with the prolonged survival in this case. Early diagnosis and life-long follow-up in patients with malignant pheochromocytoma are known to be crucial in improving survival

Síndrome de Pendred causada por mutação em homozigoze no gene SLC26A4 em uma família brasileira consangüínea

ABSTRACTPendred Syndrome (PS) is an autossomal recessive disorder characterized by sensorineural deafness, goiter and iodide organification defect. The hearing loss is associated with inner ear abnormalities, ranging from an isolated enlarged vestibular aqueduct (EVA) to a typical coclear dysplasia. Mutations in the gene that encodes pendrin (SLC26A4), a chloride/iodide transporter, have been shown to be associated with PS. We describe the clinical and molecular characteristics of a large consanguineous family harboring a mutation in the SLC26A4 gene. The proband was a 26-year-old deaf Brazilian woman who presented a bulky multinodular goiter and hypothyroidism since puberty. Five other siblings were deaf: one brother had a similar phenotype, three siblings also had goiters but normal thyroid function tests, and one brother had only a subtle thyroid enlargement. Other 4 siblings had no thyroid or hearing disorder. Parents were first degree cousins and had normal hearing. The mother was healthy, except for subclinical hypothyroidism; the father was deceased. A perchlorate test in the proband showed a discharge of 21% of the incorporated iodide 2h after the administration of 1g of KClO4. Audiological examinations showed profound hearing loss in all deaf subjects; CT and MRI of the temporal bones showed EVA in all of them. Genomic DNA was isolated from whole blood, from the 6 affected and 4 unaffected siblings, the mother and control. The coding region of the PDS gene (exons 2-21), including exon/intron boundaries, were amplified by PCR and sequenced. A single base-pair (T) deletion at position 1197 of exon 10 was detected in homozygous state in the 6 deaf siblings. The mother and 2 unaffected siblings were heterozygous for this mutation, which has been described by Everett et al. The 1197delT mutation is predicted to result in a frameshift and a truncated protein. The existence of PS phenocopies and intrafamilial phenotypic variability are well documented. The definite diagnosis requires molecular analysis. Our study illustrates the value and challenges of mutational analysis in selected patients with PS. __________________________________________________________________________________ RESUMOA syndrome de Pendred (SP) é uma doença autossômica recessiva caracterizada por surdez neurossensorial, bócio e defeito de organificação do iodo. A perda auditiva está associada a anormalidades do ouvido interno, desde a dilatação isolada do aqueduto vestibular (DAV) até uma típica displasia coclear. Mutações no gene que codifica a pendrina (SLC26A4), um transportador de cloreto/iodeto, têm sido associadas à SP. Descrevemos as características clínicas e moleculares de uma grande família consangüínea portadora de uma mutação no gene SLC26A4. O caso-índice era uma paciente do sexo feminino, brasileira, 26 anos, portadora de surdez congênita, que apresentava um volumoso bócio multinodular e hipotireoidismo desde a puberdade. Outros cinco irmãos eram surdos: um irmão tinha fenotipo semelhante, três também tinham bócio, porém com função tiroideana normal e um irmão tinha apenas um discreto aumento da tiróide. Outros quatro irmãos não apresentavam alteração tiroideana ou auditiva. Os pais eram primos de primeiro grau e tinham audição normal. A mãe era saudável, exceto por hipotireoidismo subclínico; o pai era falecido. O teste do perclorato no caso-índice revelou a liberação de 21% do iodo incorporado duas horas após a administração de 1 g de KClO4. Os exames audiológicos mostraram perda auditiva profunda em todos os indivíduos afetados; TC e RMN dos ossos temporais mostraram DAV em todos eles. O DNA genômico foi isolado do sangue total dos seis irmãos afetados e dos quatro não-afetados, da mãe e do controle. A região codificante do gene PDS (éxons 2-21), incluindo as junções éxon/íntron, foram amplificadas por PCR e seqüenciadas. Foi detectada a deleção de uma base (T) na posição 1197 do éxon 10, em homozigoze, nos seis irmãos afetados. A mãe e dois irmãos não-afetados eram heterozigotos para a mutação, que foi descrita inicialmente por Everett e cols. A mutação 1197delT provavelmente resulta em um erro de fase de leitura (frameshift) e em uma proteína truncada. A existência de fenocópias da SP e a variabilidade fenotípica intrafamiliar são bem conhecidas. O diagnóstico definitivo requer análise molecular. O presente estudo ilustra o valor e os desafios da análise mutacional em pacientes selecionados com SP

Cytotoxic effect of Erythroxylum suberosum combined with radiotherapy in head and neck cancer cell lines

O câncer de boca e de orofaringe emerge como o 6º tipo de câncer mais comum no mundo. O tratamento pode envolver cirurgia, quimioterapia e radioterapia. Mais de 50% das drogas com atividade de combate ao câncer foram isoladas de fontes naturais, tais como a Catharanthus roseus e a epipodofilotoxina, isolada de Podophyllum. O maior desafio é maximizar o controle da doença, enquanto minimiza a morbidade e toxicidade para os tecidos normais circundantes. O Erythroxylum suberosum é uma planta comum no bioma Cerrado brasileiro e é popularmente conhecida como "cabelo-de-negro". O objetivo deste estudo foi avaliar a citotoxicidade dos extratos da planta Erythroxylum suberosum do bioma Cerrado brasileiro, associados à radioterapia em linhagens celulares humanas de carcinomas de língua e de hipofaringe. As células foram tratadas com os extratos aquoso, etanólico e hexânico do Erythroxylum suberosum e irradiadas com 4 Gy, 6 Gy e 8 Gy. A citotoxidade foi avaliada pelo ensaio de MTT e a absorvância foi medida a 570 nm em uma leitora Beckman. A cisplatina, quimioterápico padrão, foi utilizada como controle positivo. O uso de extratos de Erythroxylum suberosum mostrou potencial efeito radiosensibilizante in vitro no câncer de cabeça e pescoço. O efeito da citotoxicidade nas linhagens foi de forma não seletiva e muito semelhante ao efeito da quimioterapia padrão. O extrato aquoso de Erythroxylum suberosum, combinado com radioterapia, foi o extrato mais citotóxico para os carcinomas de língua e hipofaringe, associados à radioterapia.The mouth and oropharynx cancer is the 6th most common type of cancer in the world. The treatment may involve surgery, chemotherapy and radiotherapy. More than 50% of drugs against cancer were isolated from natural sources, such as Catharanthus roseus and epipodophyllotoxin, isolated from Podophyllum. The biggest challenge is to maximize the control of the disease, while minimizing morbidity and toxicity to the surrounding normal tissues. The Erythroxylum suberosum is a common plant in the Brazilian Cerrado biome and is popularly known as "cabelo-de-negro". The objective of this study was to evaluate the cytotoxic activity of Erythroxylum suberosum plant extracts of the Brazilian Cerrado biome associated with radiotherapy in human cell lines of oral and hypopharynx carcinomas. Cells were treated with aqueous, ethanolic and hexanic extracts of Erythroxylum suberosum and irradiated at 4 Gy, 6 Gy and 8 Gy. Cytotoxicity was evaluated by MTT assay and the absorbance was measured at 570 nm in a Beckman Counter reader. Cisplatin, standard chemotherapy, was used as positive control. The use of Erythroxylum suberosum extracts showed a possible radiosensitizing effect in vitro for head and neck cancer. The cytotoxicity effect in the cell lines was not selective and it is very similar to the effect of standard chemotherapy. The aqueous extract of Erythroxylum suberosum, combined with radiotherapy was the most cytotoxic extract to oral and hypopharynx carcinomas

The Genetic Basis of Delayed Puberty.

Delayed pubertal onset has many etiologies, but on average two-thirds of patients presenting with late puberty have self-limited (or constitutional) delayed puberty. Self-limited delayed puberty often has a strong familial basis. Segregation analyses from previous studies show complex models of inheritance, most commonly autosomal dominant, but also including autosomal recessive, bilineal, and X-linked. Sporadic cases are also observed. Despite this, the neuroendocrine mechanisms and genetic regulation remain unclear in the majority of patients with self-limited delayed puberty. Only rarely have mutations in genes known to cause aberrations of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis been identified in cases of delayed puberty, and the majority of these are in relatives of patients with congenital hypogonadotropic hypogonadism (CHH), for example in the FGFR1 and GNRHR genes. Using next generation sequencing in a large family with isolated self-limited delayed puberty, a pathogenic mutation in the CHH gene HS6ST1 was found as the likely cause for this phenotype. Additionally, a study comparing the frequency of mutations in genes that cause GnRH deficiency between probands with CHH and probands with isolated self-limited delayed puberty identified that a significantly higher proportion of mutations with a greater degree of oligogenicity were seen in the CHH group. Mutations in the gene IGSF10 have been implicated in the pathogenesis of familial late puberty in a large Finnish cohort. IGSF10 disruption represents a fetal origin of delayed puberty, with dysregulation of GnRH neuronal migration during embryonic development presenting for the first time in adolescence as late puberty. Some patients with self-limited delayed puberty have distinct constitutional features of growth and puberty. Deleterious variants in FTO have been found in families with delayed puberty with extremely low BMI and maturational delay in growth in early childhood. Recent exciting evidence highlights the importance of epigenetic up-regulation of GnRH transcription by a network of miRNAs and transcription factors, including EAP1, during puberty. Whilst a fascinating heterogeneity of genetic defects have been shown to result in delayed and disordered puberty, and many are yet to be discovered, genetic testing may become a realistic diagnostic tool for the differentiation of conditions of delayed puberty.SH is funded by the NIHR (CL-2017-19-002), The Rosetrees Trust (M222-F1), and supported by the Academy of Medical sciences, Wellcome Trust, Medical Research Council, British Heart Foundation, Arthritis Research UK and Diabetes UK through the clinical lecturers scheme (SGL019\1043)

Novos aspectos do hipogonadismo hipogonadotrófico seletivo : avaliação da esteroidogênese gonadal na deficiência de FSH e análise do gene LHB na deficiência de LH

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2007.Mutações inativadoras dos genes das gonadotrofinas são raras e representam oportunidade única para estudo dos efeitos do FSH e do LH, separadamente, in vivo. Anteriormente, descrevemos uma família brasileira, na qual dois irmãos, um homem e uma mulher, apresentavam deficiência seletiva de FSH devido à mutação Tyr76X, em homozigose, no gene FSHB. Recentemente identificamos outra família, na qual três irmãos, dois homens e uma mulher, apresentavam deficiência seletiva de LH. Na primeira parte do presente estudo (ESTUDO A), foi aplicado protocolo de estimulação hormonal nos pacientes com deficiência de FSH, com o objetivo de analisar os efeitos da estimulação gonadotrófica seletiva na resposta esteroidogênica gonadal em ambos os sexos. Na segunda parte (ESTUDO B), descrevemos as características clínicas e aspectos fisiopatológicos da deficiência seletiva de LH em ambos os sexos e realizamos a análise do gene da subunidade beta do LH (LHB) nos indivíduos afetados e seus familiares. No ESTUDO A, o protocolo consistiu inicialmente de análise da pulsatilidade do LH, obtida por meio de coletas noturnas seriadas de amostras de sangue para dosagem de LH. Em seguida, após supressão adrenal com dexametasona dois dias antes e durante o protocolo, foram realizadas medidas de esteróides sexuais gonadais no estado basal e após administração de hCG apenas, FSH apenas, ou FSH seguido de hCG (FSH+hCG). Foram analisadas as seguintes variáveis: número de pulsos de LH, média ± DP de suas amplitudes, média ± DP dos valores de LH ao longo da noite, e concentrações séricas de testosterona (T), estradiol (E2, SDHEA, 17hidroxiprogesterona (17OHP), androstenediona (AD) e inibina B (InB), antes e depois de cada estímulo. Foram obtidos os seguintes resultados, na mulher e no homem, respectivamente: a média ± DP do LH ao longo da noite foi 49,2 ± 5,7 mIU/ml e 9,1 ± 2,9 mIU/ml; foram detectados 8 pulsos em 8 horas e 9 pulsos em 9 horas, com amplitudes de 53,4 ± 6,5 mIU/ml e 11,7 ± 1,9 mIU/ml. Não houve resposta esteroidogênica gonadal na mulher a nenhum dos estímulos utilizados, enquanto no homem, houve aumento de T e AD após hCG (55,2% e 125%, respectivamente), após FSH (76,3% e 40%) e após FSH+hCG (68% e 140%), houve aumento da 17OHP apenas após FSH+hCG (238,8%) e aumento do E2 após hCG (>116,1%) e após FSH+hCG (111,8%). A InB aumentou 480% após FSH. No ESTUDO B, a deficiência de LH caracterizou-se, nos homens, por ausência do desenvolvimento puberal e azoospermia e na mulher, por amenorréia secundária e infertilidade. As concentrações de séricas de LH foram indetectáveis e as de FSH, elevadas. O seqüenciamento do gene LHB revelou a presença da mutação IVS2+1G>C em homozigose nos indivíduos afetados. O rastreamento da mutação por digestão enzimática revelou que seis familiares férteis eram heterozigotos para a nova mutação, enquanto a mutação não foi identificada em nenhum dos 100 indivíduos normais, no grupo controle. A análise por RT-PCR do RNAm extraído de leucócitos dos indivíduos afetados demonstrou que a mutação resultou na inclusão do íntron 2 e, consequentemente, mudança da fase de leitura do éxon 3 do LHB. O alinhamento das seqüências da suposta proteína aberrante e do LH-beta normal evidenciou a perda de estruturas essenciais para a dimerização das subunidades e conseqüentemente comprometimento provável de sua secreção. Os resultados do ESTUDO A sugeriram que o FSH pode exercer efeito regulatório sobre a produção de andrógenos pelas células de Leydig normais, provavelmente agindo de forma parácrina, mediada por sua ação nas células de Sertoli. No ESTUDO B, a mutação identificada no gene LHB (IVS2+1G>C) resultou no fenótipo de deficiência seletiva de LH nos homozigotos, corroborando os efeitos fisiológicos principais do LH sobre a produção androgênica e fertilidade no sexo masculino e sobre a capacidade ovulatória e fertilidade, no sexo feminino. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACTInactivating mutations of gonadotropins genes are rare and represent a unique oportunity to study FSH and LH effects, separately, in vivo. We previously described a Brazilian family including two siblings, a man and a woman, with selective FSH deficiency due to a mutation (Tyr76X) in FSHB gene. Recently, we identified another family including three siblings, two men and a woman, with selective LH deficiency. In the first part of this study (STUDY A), we performed a hormonal stimulation protocol in the FSH-deficient patients, in order to analyse the effects of selective gonadotropin stimulation on gonadal steroidogenic response in both sexes. In the second part (STUDY B), we described the clinical characteristics and physiopathologic features of selective LH deficiency in both sexes and performed the analysis of the LHB gene in the affected patients and their relatives. In STUDY A, the protocol started with overnight serial LH sampling for the analysis of LH pulsatility. After adrenal suppression with oral dexametasone given two days before and during the protocol, gonadal steroids levels were assessed at baseline and after hCG, FSH or FSH +hCG administration. The following variables were analysed: LH pulse number, mean ± SD LH amplitude, mean ± SD overnight LH level and baseline and stimulated serum levels of testosterone (T), estradiol (E2), dehidroepiandrosterone sulphate (SDHEA), 17hydroxi-progesterone (17OHP), androstenedione (AD) and inhibin B. The following results were obtained, for the woman and the man, respectively: the mean overnight LH levels were 49.2 ± 5.7 mIU/mL and 9.1 ± 2.9 mIU/mL; there were 8 pulses/8h and 9 pulses/9h, with mean amplitudes of 53.4 ± 6.5mIU/mL and 11.7 ± 1.9mIU/mL. There was no steroid response to rFSH, hCG or FSH+hCG in the woman. In the man, there was an increase in T and AD after hCG (55.2% and 125%, respectively), after FSH (76.3% and 40%) and after FSH+hCG (68% and 140%); an increase in 17OHP was observed only after FSH+hCG (238.8%); estradiol increased after hCG (>116%) and after FSH+hCG (111.8%), and inhibin B increased by 480% after FSH. In STUDY B, LH deficiency was charactized by absent pubertal development and azoospermia in the men, and by secondary amenorrhea and infertility in the woman. LH levels were undetectable, whereas FSH was elevated. LHB gene sequencing revealed a mutation (IVS2+1G>C) in homozygous state in the affected subjects. Mutation screening by enzymatic digestion revealed that six fertile family members were heterozygotes for the new mutation, whereas the mutation was not found in any of the 100 normal subjects in the control group. RT-PCR analysis of the LHB mRNA extracted from leucocytes of the affected subjects demonstrated that the mutation resulted in the inclusion of intron 2 and, consequently, in an exon 3 frameshift. Sequence alignments of the supposed aberrant protein and wild-type LHB showed that the aberrant protein would lack structures essential for subunit dimerization, which would probably compromise its secretion. The results from STUDY A suggested that FSH may exert a regulatory role in androgen production by Leydig cells, probably acting in a paracrine way, mediated by its action on Sertoli cells. The LHB mutation identified in STUDY B (IVS2+1G>C) resulted in the phenotype of selective LH deficiency in homozygotes, reinforcing the main physiologic effects of LH on androgen production and fertility in men, and on ovulatory capacity and fertility in women

Deficiência de 3ß-hidroxiesteroide desidrogenase tipo 2 em teste de triagem neonatal

A deficiência da enzima 3β-hidroxiesteroide desidrogenase tipo 2 (3β-HSD) representa variante rara de hiperplasia adrenal congenital (HAC). Recém-nascidos afetados com a forma clássica apresentam perda de sal nas primeiras semanas de vida e ambiguidade genital em ambos os sexos. Concentrações elevadas de 17-hidroxipregnenolona (Δ517OHP) são características, porém sua conversão extra-adrenal a 17-hidroxiprogesterona (17OHP) pode resultar em resultados positivos no teste de triagem neonatal. A determinação da concentração de 17OHP obtida em amostra de sangue colhida em papel-filtro para triagem neonatal foi realizada por ensaio imunofluorimétrico, e as concentrações séricas de 17OHP and Δ517OHP, por radioimunoensaio. Um menino, 46,XY, com ambiguidade genital e crise adrenal aos 3 meses de vida, apresentou teste positivo na triagem neonatal para HAC. As concentrações séricas de 17OHP e Δ517OHP estavam aumentadas, bem como a relação Δ517OHP/cortisol, o que foi compatível com o diagnóstico de deficiência de 3β-HSD. A análise molecular do gene HSD3B2 revelou a mutação p.P222Q em homozigose na criança afetada e em heterozigose em seus pais, o que confirmou a deficiência de 3β-HSD com resultado moderadamente elevado na dosagem de 17OHP no “Teste do Pezinho” (Programa de Triagem Neonatal do Distrito Federal, Brasil). Esse caso corrobora a forte correlação genótipo-fenótipo associada à mutação p.P222Q no gene HSD3B2. Estudos futuros para avaliação dos ensaios utilizados na triagem neonatal para determinação de 17OHP poderão auxiliar na determinação do significado potencial de concentrações moderadamente elevadas de 17OHP como um indicador precoce para o diagnóstico de outras formas de HAC clássicas, além da deficiência de 21-hidroxilase.3b-hydroxysteroid dehydrogenase II (3β-HSD) deficiency represents a rare CAH variant. Newborns affected with its classic form have salt wasting in early infancy and genital ambiguity in both sexes. High levels of 17-hydroxypregnenolone (Δ517OHP) are characteristic, but extra-adrenal conversion to 17-hydroxyprogesterone (17OHP) may lead to positive results on newborn screening tests. Filter paper 17OHP on newborn screening test was performed by immunofluorometric assay, and serum determinations of 17OHP and Δ517OHP, by radioimmunoassay. A 46,XY infant with genital ambiguity and adrenal crisis at three months of age presented a positive result on newborn screening for CAH. Serum determinations of 17OHP and Δ517OHP were elevated, and a high Δ517OHP/cortisol relation was compatible with the diagnosis of 3β-HSD deficiency. Molecular analysis of the HSD3B2 gene from the affected case revealed the presence of the homozygous p.P222Q mutation, whereas his parents were heterozygous for it. We present the first report of 3β-HSD type II deficiency genotype-proven detected at the Newborn Screening Program in Brazil. The case described herein corroborates the strong genotype-phenotype correlation associated with the HSD3B2 p.P222Q mutation, which leads to a classic salt-wasting 3β-HSD deficiency. Further evaluation of 17OHP assays used in newborn screening tests would aid in determining their reproducibility, as well as the potential significance of moderately elevated 17OHP levels as an early indicator to the diagnosis of other forms of classic CAH, beyond 21-hydroxylase deficiency