Biophysical investigation of the ligand-induced assembling of the human type I interferon receptor

Type I interferons (IFNs) elicit antiviral, antiproliferative and immunmodulatory responses through binding to a shared receptor consisting of the transmembrane proteins ifnar1 and ifnar2. Differential signaling by different interferons – in particular IFNalpha´s and IFNbeta – suggest different modes of receptor engagement. In this work either single ligand-receptor interactions or the formation of the extracellular part of a signaling complex were investigated referring to thermodynamics, kinetics, stoichiometry and structural organization. Initially an expression and purification strategy for the extracellular domain of ifnar1 (ifnar1-EC) using Sf9 insect cells yielding in mg amounts of glycosylated protein was established. Using reflectometric interference spectroscopy (RIfS) the interactions between IFNalpha2/beta and ifnar1-EC and ifnar2-EC was studied in order to understand the individual energetic contributions within the ternary complex. For IFNalpha2 a Kd of 5 µM for the interaction with ifnar1-EC was determined. Substantially tighter binding of IFNbeta with both ifnar2-EC and ifnar1-EC compared to IFNalpha2 was observed. For neither IFNalpha2 nor IFNbeta stabilization of the complex with ifnar1-EC in presence of soluble ifnar2-EC was detectable. In addition, no direct interaction between ifnar2 and ifnar1 was could be shown. Thus, stem-stem interactions between the extracellular domains of ifnar1 and ifnar2 do not seem to play a role for ternary complex formation. Furthermore, ligand-induced cross-talk between ifnar1-EC and ifnar2-EC being tethered onto solid-supported, fluid lipid bilayers was investigated by RIfS and total internal reflection fluorescence spectroscopy. A very stable binding of IFNalpha2 at high receptor surface concentrations was observed with an apparent kd approximately 200-times lower than for ifnar2-EC alone. This apparent kd was strongly dependent on the surface concentration of the receptor components, suggesting kinetic rather than static stabilization, which was corroborated by competition experiments. These results indicate that signaling is activated by transient cross-talk between ifnar1 and ifnar2, which is by several orders of magnitude more efficiently engaged by IFNbeta than by IFNalpha2. With respect to differential recognition of different IFNs ifnar1-EC was dissected into sub-fragments containing different of the four Ig-like domains. The appropriate folding and glycosylation of these proteins, also purified in mg amounts were confirmed by SDS-PAGE, size exclusion chromatography and CD-spectroscopy. Surprisingly, only one construct containing all three N-terminal Ig-like domains was active in terms of ligand binding, indicating that these domains were required. Competitive binding of IFNalpha2 and IFNbeta to both this fragment and ifnar1-EC was demonstrated. Cellular binding assays with different fragments, however, highlight the key role of the membrane-proximal Ig-like domain for the formation of an in situ IFN-receptor complex and the ensuing signal activation. Even substitution with Ig-like domains from homologous cytokine receptors did not restore high-affinity ligand binding. Receptor assembling analysis on supported lipid bilayer revealed that appropriate orientation of the receptor is required, which is controlled by the membrane-proximal Ig-domain. All results indicate that differential signalling is encoded by the efficiency of signalling complex formation, which is controlled by the binding affinity of IFNs to the extracellular domains of ifnar1 and 2.Die biochemischen und zellbiologischen Mechanismen der interzellulären Kommunikation über Zellbotenstoffe, die Zytokine, spielen eine bedeutende Rolle sowohl in der grundlagenorientierten als auch in der biomedizinischen Forschung. Eine Gruppe der Zytokine, die Typ I Interferone (IFN), stellt aufgrund ihrer antiviralen, antiproliferativen, immunmodulatorischen und antiinflammatorischen Aktivitäten eine wichtige Komponente des angeborenen Immunsystems dar. Von besonderer Bedeutung ist ihre Rolle bei der frühzeitigen Abwehr von Viren, in der sie die erste Antwort in einer Reihe von antiviralen Mechanismen bilden. Bisher sind 16 humane Typ I Interferone bekannt (13 IFNalpha, beta, eta und omega). Abhängig vom Zell- und Gewebetyp kann ein Interferon zu unterschiedlichen zellulären Aktivitäten führen, was als pleiotroper Effekt bezeichnet wird. Zentrales Element der Interferon-vermittelten Signaltransduktion ist der IFN Rezeptor ifnar, welcher sich aus den beiden Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 zusammensetzt und zur Familie der Klasse II Zytokin Rezeptoren gehört. Dieser Rezeptor fungiert als Verbindungselement zwischen extrazellulärem Milieu und dem Zytoplasma. Alle bekannten IFN rekrutieren ifnar, jedoch führen sie in Abhängigkeit vom jeweiligen Interferon und vom zellulären Kontext zu unterschiedlicher Akzentuierung der aktivierten Signalwege, was als differentielle Signalaktivierung bezeichnet wird. Dies lässt vermuten, dass die differentielle Signalaktivierung in der Erkennung der IFN durch den Rezeptor codiert ist. Ziel dieser Arbeit war es, die Ligand-induzierte Rezeptorassemblierung biophysikalisch zu untersuchen und damit die molekularen Prinzipien der differentiellen Signalaktivierung in vitro zu erforschen. Als Modellsystem dienten die extrazellulären Domänen ifnar1-EC und ifnar2-EC, welche für die Ligandenbindung verantwortlich sind. Die hochaffine Interaktion zwischen ifnar2-EC und IFNalpha2 ist detailliert in vitro untersucht worden, jedoch war nur wenig über ifnar1 bekannt. Da vermutet wird, dass die niedrigaffine Komponente ifnar1 für die differentielle Signalaktivierung verantwortlich ist, steht die extrazelluläre Domäne ifnar1-EC im Fokus dieser Arbeit. Die folgenden Aspekte lagen dabei im Zentrum des Interesses: - Thermodynamik, Kinetik und Stöchiometrie der Einzelinteraktionen zwischen allen involvierten Proteinen: ifnar1-EC, ifnar2-EC und Interferon, - Charakterisierung der Bindungsstelle für verschiedene Liganden auf ifnar1-EC, - Stabilität, Dynamik und Stöchiometrie des Signalkomplexes hinsichtlich verschiedener Liganden, - Strukturelle Organisation von ifnar1-EC im Signalkomplex Ifnar1-EC musste zunächst in quantitativen Mengen hergestellt werden, um die Etablierung eines Bindungsassays zu ermöglichen. Die heterologe, periplasmatische Expression in E. coli führte nur zu geringen Ausbeuten (50 µg/l), und auch andere Expressionsstrategien lieferten keine nachweisbaren Mengen an monomerem Protein. Aus diesem Grund wurde die Expression in Sf9 Insektenzellen eingesetzt. Mittels homologer Rekombination wurde das Gen ifnar1-EC mit einem C-terminalen Deca-Histidin-tag in das Genom des Baculovirus integriert. Von diesen Viren infizierte Sf9 Zellen exprimierten ifnar1-EC und sezernierten es in das Medium, was zugleich den ersten Reinigungsschritt darstellte. Durch Metall-Affinitätschromatographie wurde ifnar1-EC aus dem Medium extrahiert und von anderen Proteinen abgetrennt. Im abschließenden Reinigungsschritt, der Gelfiltration, wurden dann Aggregate und niedermolekulare Kontaminationen entfernt und gleichzeitig sichergestellt, dass ifnar1-EC als Monomer vorliegt. Die Ausbeute für lag bei ca. 10 mg pro Liter Zellkultur. Es zeigte sich, dass ifnar1-EC glykosyliert war, was durch Deglykosylierungsexperimente mittels PNGaseF bestätigt werden konnte. Die Glykosylierung erwies sich als protein-stabilisierender Faktor, der die Handhabung und Lagerung wesentlich erleichterte. Ebenso konnte die Ausbildung von Disulfidbrücken, welche bei Stabilität und Funktion eine wichtige Rolle spielen, nachgewiesen werden. Um Stöchiometrie und Kinetik der Rezeptor-Ligand-Interaktionen mittels Reflektometrischer Interferenzspektroskopie (RIfS) zu untersuchen, wurden ifnar1-EC und ifnar2-EC mit Hilfe des Deca-Histidin-tags gerichtet und funktional auf Oberflächen immobilisiert. Die Immobilisierung wurde wie bei der Reinigung über eine Metall-Chelator Interaktion gewährleistet. Dazu wurden multivalente Chelatoren auf einer modifizierten Glasoberfläche kovalent gebunden und Ni2+ über 4 Koordinationsstellen komplexiert. Der Deca-Histidin-tag konnte darauf über die freien Koordinationsstellen des Ni2+ binden und so das Protein stabil auf der Oberfläche verankert werden. Zur Untersuchung der Einzelinteraktionen wurde stets eine Untereinheit immobilisiert und anschließend der Assoziations- und Dissoziationsprozess für IFNalpha2 und IFNbeta untersucht. Alle Interaktionen zwischen ifnar1-EC bzw. ifnar2-EC und IFNalpha2/beta wiesen eine 1:1 Stöchiometrie auf. Es zeigten sich jedoch sowohl zwischen den Interferonen als auch zwischen den Rezeptoren große Unterschiede in der Affinität. Für ifnar2-EC wurde eine Dissoziationskonstante von 3 nM für IFNalpha2 bestimmt, wohingegen IFNbeta erheblich stärker bindet (KD < 0.1 nM). Ifnar1-EC bindet sowohl IFNalpha2 (KD = 5 ± 2 µM) als auch IFNbeta (KD = 50 ± 30 nM) etwa drei Größenordnungen schwächer als ifnar2-EC. Im Falle von IFNalpha2 wurde eine transiente Interaktion mit einer Lebensdauer ~ 1 s gemessen. Eine kooperative Bindung in Anwesenheit von ifnar2-EC ohne His-tag konnte weder für IFNalpha2 noch für IFNbeta gezeigt werden. Dieses Ergebnis wurde durch die Beobachtung gestützt, dass keinerlei Interaktion zwischen den beiden Rezeptoren nachgewiesen werden konnte. Eine Interaktion zwischen ifnar1-EC und ifnar2-EC konnte somit ausgeschlossen werden. Um die Bindungsstelle(n) für IFNalpha2 und IFNbeta genauer zu charakterisieren, wurden verschiedene Konstrukte von ifnar1-EC hergestellt, die eine unterschiedliche Anzahl an Immunglobulin-ähnlichen Sub-domänen (SD) beinhalteten. Da ifnar1-EC vier solcher Domänen mit einer Größe von je ~100 Aminosäuren enthält (SD1234), wurden die folgenden Sub-Fragmente anhand der Domänenanordnung und Stellung des His-tags benannt: H10-SD12, SD34-H10, SD123-H10, H10-SD123 und SD234-H10. Alle Sub-Fragmente ließen sich in vergleichbaren Ausbeuten wie der Wildtyp exprimieren und reinigen. Zudem wurde ein ifnar1-EC-Konstrukt mit N- und C-terminalem His-tag (SD1234-DT) hergestellt, welches eine doppelte Verankerung mit der Membran simulieren sollte. Um sicherzustellen, dass alle Konstrukte korrekt gefaltet waren, wurde die Sekundärstruktur mittels CD-Spektroskopie untersucht. Wie erwartet wiesen alle Proteine einen hohen Anteil an beta-Faltblättern auf (~ 80 %), was ein typisches Strukturmerkmal aller extrazellulären Domänen von Klasse I Zytokinrezeptoren darstellt. Bei der biochemischen Charakterisierung mittels analytischer Gelfiltration und SDS-PAGE fiel auf, dass H10-SD123 und SD234-H10 trotz etwa gleichem Molekulargewichts ein unterschiedliches Laufverhalten aufwiesen, wobei H10-SD123 zu einem höheren Molekulargewicht verschoben wurde. Diese auch nach Deglykosylierung reproduzierbare Verschiebung indiziert eine eher gestreckte Anordnung der drei N-terminalen gegenüber den drei C-terminalen Domänen und damit einen nicht symmetrischen Aufbau von ifnar1-EC. In Bindungsexperimenten zeigte sich, dass nur SD123-H10 und H10-SD123 Bindungsaktivität für IFNalpha2 und IFNbeta aufwiesen, alle anderen Sub-Fragmente zeigten keinerlei Bindung im detektierbaren Konzentrationsbereich. Auch eine Rekonstruktion der Bindungsstelle durch Co-Immobilisierung von H10-SD12 und SD34-H10 konnte nicht erreicht werden. Hieraus lässt sich folgern, dass für die Liganden-Bindung alle drei N-terminalen Domänen in einem Polypeptidstrang vorliegen müssen. Hinsichtlich der Bindungsaffinität waren keine signifikanten Unterschiede zwischen ifnar1-EC, SD1234-DT und H10-SD123 nachweisbar. Um mögliche Unterschiede in der Bindungsregion auf ifnar1-EC bzw. SD123 für IFNalpha2 und IFNbeta nachzuweisen, wurden Kompetitionsexperimente mit Fluoreszenz-markiertem IFNalpha2 durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass IFNalpha2 und IFNbeta, wie bei ifnar2-EC, um die gleiche Bindungsregion auf ifnar1-EC konkurrieren und damit auch in dieser Hinsicht kein Unterschied zwischen diesen beiden Interferonen in der Rekrutierung von ifnar1-EC besteht. Zur genaueren Charakterisierung der Liganden-Bindungsstelle wurden mehrere Mutationen auf allen 4 Sub-Domänen auf ifnar1-EC eingeführt. Diese Mutanten, von denen sich der größte Teil wie der Wildtyp exprimieren und reinigen ließ, wurden hinsichtlich ihrer Bindung an IFNalpha2 und IFNbeta untersucht. Anstelle von IFNalpha2wt wurde eine höher affine Mutante (IFNalpha2-HEQ) verwendet, die ähnliche Bindungseigenschaften wie IFNbeta aufwies, jedoch leichter zu handhaben war. Es wurden mehrere Reste identifiziert, die die Bindungsaffinität sowohl für IFNalpha2-HEQ als auch für IFNbeta um eine Größenordnung oder mehr reduzierten. Auf SD1 wurde eine Aminosäure (Y70), auf SD2 vier (E111, K113, W129 und F136) und auf SD3 auch eine Aminosäure (K251) identifiziert. Auf SD4 konnte keine Mutation erzeugt werden, welche die Bindungsaffinität reduziert. Diese Ergebnisse untermauerten die Beobachtungen mit den Sub-Fragmenten und stärkten die Vermutung, dass die 3 N-terminalen Domänen für die Ligandenbindung und SD4 für die Komplexbildung verantwortlich sind. Um die Bildung des Signalkomplexes durch IFN Zugabe zu untersuchen, wurden ifnar1-EC und ifnar2-EC auf einer Chelator-Lipid-Oberfläche co-immobilisiert. Die Verwendung einer Lipid-Doppelschicht ermöglichte laterale Mobilität. Dies wurde durch entsprechende FRAP-Messungen mit Fluoreszenz-markiertem ifnar2 bestätigt. Nach Zugabe von IFNalpha2 bildete sich ein stabiler Komplex mit einer 1:1:1 Stöchiometrie. Diese Stöchiometrie konnte in Lösung mittels Gelfiltration bestätigt werden. Durch Verwendung von IFNalpha2- und ifnar2-EC-Mutanten mit niedrigerer Affinität wurde gezeigt, dass die Stabilität der IFNalpha2-ifnar2-EC Interaktion durch ifnar1-EC um den Faktor 200 gesteigert wurde. Kontrollexperimente auf Glasoberflächen zeigten, dass die Mobilität der Rezeptorkomponenten, wie sie in Lipid-Doppelschichten vorliegt, für die Bildung eines solchen stabilen Komplexes essentiell ist. Es stellte sich nun die Frage, ob der ternäre Komplex statisch oder dynamisch stabilisiert wurde. Um diese Frage zu beantworten, wurde die Oberflächenkonzentration von ifnar1-EC und ifnar2-EC reduziert und die Bindung von Fluoreszenz-markiertem IFNalpha2 S136C mittels TIRFS (Totalinterne Reflektions-Fluoreszenz-Spektroskopie) aufgrund erheblich höherer Sensitivität gegenüber RIfS detektiert. Hierbei zeigte sich mit abnehmender Rezeptor-Oberflächenkonzentration eine zunehmende Dissoziationsratenkonstante, was einen ersten Hinweis auf eine dynamische Stabilisierung darstellte. Diese Vermutung wurde durch Austauschexperimente mit unmarkiertem IFNalpha2 bestätigt. Zudem wurde durch Injektion von löslichem ifnar2-EC gezeigt, dass die Stabilität des ternären Komplexes kein Diffusions-basiertes Rückbindungsphänomen aufgrund von Diffusionen an Grenzflächen ist. Diese Ergebnisse lassen sich durch ein zweistufiges Bindungsmodell erklären. Zunächst wird der Ligand an die hochaffine Rezeptorkomponente ifnar2 gebunden und bildet damit einen binären Komplex (beschrieben durch K1). Im zweiten Schritt, welcher in der Membranebene stattfindet (beschrieben durch K2), führt die Bindung von ifnar1 über die direkte Interaktion mit IFN zur Bildung des ternären Komplexes. Die Komplexbildung und die Dissoziation lassen sich durch die 2-dimensionale Assoziationsratenkonstante (k2) bzw. die Dissoziationsratenkonstante (k-2) der IFN/ifnar1-EC-Interaktion auf der Membran beschreiben. Da unterschiedliche Affinitäten für IFNalpha2 und IFNbeta bestimmt wurden, wird klar, dass die Stabilität des Komplexes und damit die Effizienz der Signalaktivierung von der Dissoziationsratenkonstante der IFN/ifnar1-EC-Interaktion abhängen. Die differentielle Signalaktivierung durch verschiedene Interferone ließe sich somit durch die unterschiedlichen Dissoziationsratenkonstanten erklären. Ebenso wird klar, dass die Komplexbildung und damit k2 zum einen von der Rezeptoroberflächenkonzentration, zum anderen von der Affinität von ifnar1 mit dem binären Komplex abhängen. Unterschiedliche Rezeptoroberflächenkonzentrationen auf verschiedenen Zelltypen könnten erklären, warum verschiedene Zelltypen unterschiedlich auf das gleiche IFN reagieren (pleitroper Effekt). Um diesen Prozess der Komplexbildung genauer zu untersuchen, wurde die Rezeptorassemblierung mit verschiedenen ifnar1-Varianten auf Lipid-Doppelschichten untersucht. SD123-H10, H10-SD123 und SD1234-DT waren bei hohen Oberflächenkonzentrationen in der Lage, einen stabilen ternären Komplex zu bilden. Bei niedrigeren Rezeptor-Oberflächenkonzentrationen jedoch waren deutliche Unterschiede in der Komplexstabilität zu beobachten. C-terminal und doppelt verankerter ifnar1-EC zeigten keinen Unterschied, jedoch wies SD123 unabhängig von der Position des His-tags eine deutlich gesteigerte Dissoziation auf. Offensichtlich erhöht SD4 die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Komplexbildung, was die reduzierte Komplexstabilität bei Entfernung dieser Domäne erklären könnte. Diese Vermutung wurde durch Bindungsexperimente auf Zellen bestätigt, in denen ausschließlich ifnar1-EC zu messbarer Bindung führte. Um den Einfluss der Orientierung von SD4 auf die Komplexbildung genauer zu untersuchen, wurden weitere Konstrukte hergestellt. Zum einen wurde ifnar1-EC mit einem N-terminalen His-tag ausgestattet (H10-SD1234), zum anderen wurde SD4 von ifnar1 durch SD2 des IFN&#955;-Rezeptors (SD123-LRD2-H10) bzw. des IL-10 Rezeptors (SD123-IL-10R2D2) ersetzt. Sowohl die N-terminale Verankerung als auch der Austausch von SD4 zeigte gegenüber der C-terminalen Immobilisierung eine reduzierte Komplexstabilität ähnlich wie SD123. Hieraus lässt sich der Schluss ziehen, dass SD4 offensichtlich für die optimale Orientierung der Ligandenbindungsstelle von ifnar1 verantwortlich ist und damit eine essentielle Rolle bei der Assemblierung des ternären Komlexes spielt

HOPs and COPs: Room frames with partitionable transversals

In this paper, we construct Room frames with partitionable transversals. Direct and recursive constructions are used to find sets of disjoint complete ordered partitionable (COP) transversals and sets of disjoint holey ordered partitionable (HOP) transversals for Room frames. Our main results include upper and lower bounds on the number of disjoint COP transversals and the number of disjoint HOP transversals for Room frames of type 2n. This work is motivated by the large number of applications of these designs

Post-politické dimenze městského plánování v Praze

The aim of this thesis is to provide a theoretical synthesis of the current literature reflecting upon the post-political critique of urban planning in the theoretical section, which is then applied to the context of urban planning in Prague in the empirical section. The post-political line of thought takes a critical view of recent efforts to render urban planning more inclusive, asserting that by focusing on consensus-building, planning practices exclude the emergence of the political; the fundamentally conflictual nature of politics as described by Chantal Mouffe and Jacques Rancière. The critique suggests that participatory planning practices can be effective at upholding the hegemonic order by which the city is constituted, by pacifying the antagonistic forces that challenge it. In the empirical section, the applicability of this critique within the context of Prague's urban planning process is examined. This is achieved through a case study of the efforts of the Prague Institute of Planning and Development (IPR) to develop a new land use plan, while dealing with dissent from a prominent antagonistic actor - the NGO Arnika.Cílem této práce je poskytnout teoretickou syntézu současné literatury reflektující post- politickou kritiku územního plánování v teoretické části, která je následně aplikována na kontext územního plánování v Praze v části empirické. Post-politická myšlenková linie kriticky nahlíží na nedávné snahy o dosažení inkluzivnějšího městského plánování a tvrdí, že plánovací praxe svým zaměřením na budování konsensu vylučuje vznik politična neboli zásadně konfliktní povahy politiky, jak ji popisují Chantal Mouffe a Jacques Rancière. Kritika naznačuje, že postupy participativního plánování mohou být účinné při udržování hegemonického řádu, kterým je město konstituováno, tím, že pacifikují antagonistické síly, které tento řád zpochybňují. V empirické části je zkoumána aplikovatelnost této kritiky v kontextu pražského procesu územního plánování, na základě případové studie pojímající snažení Institutu plánování a rozvoje hl. m. Prahy (IPR) vypracovat nový územní plánu, které naráží na silný odpor ze strany významného antagonistického aktéra, neziskové organizace Arnika.Katedra sociologieDepartment of SociologyFaculty of ArtsFilozofická fakult

A few more Kirkman squares and doubly near resolvable BIBDs with block size 3

AbstractA Kirkman square with index λ, latinicity μ, block size k, and v points, KSk(v;μ,λ), is a t×t array (t=λ(v-1)/μ(k-1)) defined on a v-set V such that (1) every point of V is contained in precisely μ cells of each row and column, (2) each cell of the array is either empty or contains a k-subset of V, and (3) the collection of blocks obtained from the non-empty cells of the array is a (v,k,λ)-BIBD. In a series of papers, Lamken established the existence of the following designs: KS3(v;1,2) with at most six possible exceptions [E.R. Lamken, The existence of doubly resolvable (v,3,2)-BIBDs, J. Combin. Theory Ser. A 72 (1995) 50–76], KS3(v;2,4) with two possible exceptions [E.R. Lamken, The existence of KS3(v;2,4)s, Discrete Math. 186 (1998) 195–216], and doubly near resolvable (v,3,2)-BIBDs with at most eight possible exceptions [E.R. Lamken, The existence of doubly near resolvable (v,3,2)-BIBDs, J. Combin. Designs 2 (1994) 427–440]. In this paper, we construct designs for all of the open cases and complete the spectrum for these three types of designs. In addition, Colbourn, Lamken, Ling, and Mills established the spectrum of KS3(v;1,1) in 2002 with 23 possible exceptions. We construct designs for 11 of the 23 open cases

Unravelling the convoluted biological roles of type I interferons (IFN-Is) in infection and immunity: a way forward for therapeutics and vaccine design

It has been well-established that type I interferons (IFN-Is) have pleiotropic effects and play an early central role in the control of many acute viral infections. However, their pleiotropic effects are not always beneficial to the host and in fact several reports suggest that the induction of IFN-Is exacerbate disease outcomes against some bacterial and chronic viral infections. In this brief review, we probe into this mystery and try to develop answers based on past and recent studies evaluating the roles of IFN-Is in infection and immunity as this is vital for developing effective IFN-Is based therapeutics and vaccines. We also discuss the biological roles of an emerging IFN-I, namely IFN-ε, and discuss its potential use as a mucosal therapeutic and/or vaccine adjuvant. Overall, we anticipate the discussions generated in this review will provide new insights for better exploiting the biological functions of IFN-Is in developing efficacious therapeutics and vaccines in the future.Danushka Kumara Wijesundara, Yank Xi and Charani Ranasingh