Wechselwirkungen von SARS-Coronavirus mit zellulären Abwehrmechanismen

Das im Jahre 2003 erstmals isolierte SARS-Coronavirus (SARS-CoV) verursacht bei Menschen ein schweres akutes Atemwegssyndrom mit einer Mortalitätsrate von 10%. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob SARS-CoV in zelluläre Abwehrmechanismen eingreift, was zu der für CoV einzigartigen Humanpathogenität beitragen könnte. Zu diesen Abwehrmechanismen zählen die Typ-I-Interferon (IFN)- Antwort sowie die Induktion von Apoptose. Die IFN-Antwort wird in SARS-CoVinfizierten Zellen nicht induziert, obwohl doppelsträngige (ds) RNA, bekannt als IFNInduktor, anwesend ist. Daher wurde vermutet, dass Proteine des SARS-CoV die Induktion von IFNs inhibieren. Zunächst wurden die Proteinprodukte aller offener Leserahmen (ORFs) des SARSCoV auf ihre Fähigkeit überprüft, die IFN-Antwort zu hemmen. In einem IFNsensitiven Reportergen-Assay konnte jedoch keines der Proteine als IFN-Antagonist identifiziert werden. Die Expression der viralen Proteine ORF 7a und ORF 7b führte sogar zur Induktion der IFN-Antwort sowie zur Induktion von Apoptose. Eine natürlich entstandene Deletionsmutante von ORF 7b induzierte dagegen weder die IFNAntwort noch Apoptose. Die Inhibition von ORF 7a und 7b führte im Falle eines ORF 7a-spezifischen Inhibitors zur Reduktion freigesetzter SARS-CoV-Partikel, was vermutlich auf eine unspezifische Bindung des Inhibitors an regulatorische Sequenzen im 5’-nicht translatierten Bereich des SARS-CoV-Genoms zurückzuführen ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass SARS-CoV in der späten Phase der Infektion Apoptose induziert. Nachgewiesen wurde die Spaltung der Caspasen 3 und 8 sowie die der poly-ADP-ribose-polymerase-1 (PARP). Die Infektion hatte jedoch keinen Einfluss auf die relativen Proteinmengen von Bcl2 und Bax. Ein wichtiges Bindeglied zwischen IFN-Antwort und Apoptose ist die antivirale Protein Kinase PKR. Sie wird durch Typ-I-IFNs induziert und phosphoryliert die a-Untereinheit des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor-2 (eIF2a), was zum Stopp der Translation in Zellen führen kann. Über diesen Weg, wie auch über direkte Interaktionen mit pro-apoptotischen Proteinen, ist PKR an der Induktion von Apoptose beteiligt. Weitere Kinasen, die eIF2a als Antwort auf virale Infektionen phosphorylieren, sind PERK und GCN2. Im Rahmen dieser Arbeit wurde festgestellt, dass die PKR in SARS-CoV-infizierten Zellen durch dsRNA aktiviert wird. Um die Konsequenzen dieser Aktivierung zu untersuchen, wurde die PKR-Expression in SARS-CoV-infizierten Zellen durchsynthetische DNA-Analoga, Peptid-gekoppelte Phosphorodiamidat-Morpholino- Oligomere (PPMO), die sich an die Ziel-mRNA anlagern, gehemmt. Der effizienteste Inhibitor exon-8 (ex-8) konnte die PKR-Expression um 98% reduzieren. Durch die Bindung von ex-8 an die PKR-mRNA werden Spleißstellen maskiert, was zum Entfernen von Exons aus der mRNA und damit zur Synthese trunkierter Proteine führt. Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass die Inhibition der PKR durch PPMO ex-8 zu einer verminderten Induktion von Apoptose durch SARS-CoV führte. Die Phosphorylierung von eIF2a hingegen war in diesen Zellen nicht reduziert. Das lässt vermuten, dass SARS-CoV die PKR-vermittelte Apoptose nicht über eIF2a induziert. Überraschenderweise hatte die Inhibition der PKR und die daraus resultierende Reduktion der Apoptose keinen Einfluss auf die Vermehrung von SARS-CoV. Wurde die Inhibition von Apoptose in SARS-CoV-infizierten Zellen durch die Behandlung mit einem Caspase-Inhibitor gehemmt, so beeinflusste das die Virusreplikation ebenfalls nicht. Das heißt die Induktion von Apoptose ist für die effiziente Vermehrung des SARS-CoV nicht von Bedeutung. Weitergehende Analysen anderer eIF2a-phosphorylierender Kinasen ergaben, dass PERK, nicht jedoch GCN2 durch eine Infektion mit SARS-CoV induziert wurde. Die Vorbehandlung SARS-CoV-infizierter Zellen mit IFN b führte zur reduzierten Phosphorylierung von eIF2a und PERK, auch die Menge freigesetzter SARS-CoV war deutlich reduziert. Da die Phosphorylierungsmuster von eIF2a und PERK in SARS-CoV-infizierten Zellen übereinstimmten, und die Inhibition der PKR keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von eIF2a hatte, wird vermutet, dass die Phosphorylierung von eIF2a in SARS-CoV-infizierten Zellen hauptsächlich durch PERK vermittelt wird. Die Phosphorylierung von eIF2a hatte keinen Einfluss auf die Vermehrung von SARS-CoV. Das Virus hat daher vermutlich Strategien entwickelt die inhibitorischen Effekte von eIF2a zu umgehen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Induktion der PKR sowie der Apoptose durch SARS-CoV keinen Einfluss auf die Vermehrung des Virus hat. Ob die Aktivierung von PERK und die Phosphorylierung von eIF2a von Vorteil für SARSCoV sind, könnte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein

Reverse genetic characterization of the natural genomic deletion in SARS-Coronavirus strain Frankfurt-1 open reading frame 7b reveals an attenuating function of the 7b protein in-vitro and in-vivo

During the outbreak of SARS in 2002/3, a prototype virus was isolated from a patient in Frankfurt/Germany (strain Frankfurt-1). As opposed to all other SARS-Coronavirus strains, Frankfurt-1 has a 45-nucleotide deletion in the transmembrane domain of its ORF 7b protein. When over-expressed in HEK 293 cells, the full-length protein but not the variant with the deletion caused interferon beta induction and cleavage of procaspase 3. To study the role of ORF 7b in the context of virus replication, we cloned a full genome cDNA copy of Frankfurt-1 in a bacterial artificial chromosome downstream of a T7 RNA polymerase promoter. Transfection of capped RNA transcribed from this construct yielded infectious virus that was indistinguishable from the original virus isolate. The presumed Frankfurt-1 ancestor with an intact ORF 7b was reconstructed. In CaCo-2 and HUH7 cells, but not in Vero cells, the variant carrying the ORF 7b deletion had a replicative advantage against the parental virus (4- and 6-fold increase of virus RNA in supernatant, respectively). This effect was neither associated with changes in the induction or secretion of type I interferon, nor with altered induction of apoptosis in cell culture. However, pretreatment of cells with interferon beta caused the deleted virus to replicate to higher titers than the parental strain (3.4-fold in Vero cells, 7.9-fold in CaCo-2 cells)

Adjuvant formulated virus-like particles expressing native-like forms of the Lassa virus envelope surface glycoprotein are immunogenic and induce antibodies with broadly neutralizing activity

Lassa mammarenavirus (LASV) is a rodent-borne arenavirus endemic to several West African countries. It is the causative agent of human Lassa fever, an acute viral hemorrhagic fever disease. To date, no therapeutics or vaccines against LASV have obtained regulatory approval. Polyclonal neutralizing antibodies derived from hyperimmunized animals may offer a useful strategy for prophylactic and therapeutic intervention to combat human LASV infections. The LASV envelope surface glycoprotein complex (GP) is the major target for neutralizing antibodies, and it is the main viral antigen used for the design of an LASV vaccine. Here, we assessed the immunogenic potential of mammalian cell-derived virus-like particles (VLPs) expressing GP from the prototypic LASV strain Josiah in a native-like conformation as the sole viral antigen. We demonstrate that an adjuvanted prime-boost immunization regimen with GP-derived VLPs elicited neutralizing antibody responses in rabbits, suggesting that effective antigenic epitopes of GP were displayed. Notably, these antibodies exhibited broad reactivity across five genetic lineages of LASV. VLP-based immunization strategies may represent a powerful approach for generating polyclonal sera containing cross-reactive neutralizing antibodies against LASV

Investigating the zoonotic origin of the West African Ebola epidemic

The severe Ebola virus disease epidemic occurring in West Africa stems from a single zoonotic transmission event to a 2‐year‐old boy in Meliandou, Guinea. We investigated the zoonotic origins of the epidemic using wildlife surveys, interviews, and molecular analyses of bat and environmental samples. We found no evidence for a concurrent outbreak in larger wildlife. Exposure to fruit bats is common in the region, but the index case may have been infected by playing in a hollow tree housing a colony of insectivorous free‐tailed bats (Mops condylurus). Bats in this family have previously been discussed as potential sources for Ebola virus outbreaks, and experimental data have shown that this species can survive experimental infection. These analyses expand the range of possible Ebola virus sources to include insectivorous bats and reiterate the importance of broader sampling efforts for understanding Ebola virus ecology

Establishment of Fruit Bat Cells (Rousettus aegyptiacus) as a Model System for the Investigation of Filoviral Infection

Marburg virus and several species of Ebola virus are endemic in central Africa and cause sporadic outbreaks in this region with mortality rates of up to 90%. So far, there is no vaccination or therapy available to protect people at risk in these regions. Recently, different fruit bats have been identified as potential reservoirs. One of them is Rousettus aegyptiacus. It seems that within huge bat populations only relatively small numbers are positive for filovirus-specific antibodies or filoviral RNA, a phenomenon that is currently not understood. As a first step towards understanding the biology of filoviruses in bats, we sought to establish a model system to investigate filovirus replication in cells derived from their natural reservoir. Here, we provide the first insights into this topic by monitoring filovirus infection of a Rousettus aegyptiacus derived cell line, R06E. We were able to show that filoviruses propagate well in R06E cells, which can, therefore, be used to investigate replication and transcription of filovirus RNA and to very efficiently perform rescue of recombinant Marburg virus using reverse genetics. These results emphasize the suitability of the newly established bat cell line for filovirus research

Safety and immunogenicity of rVSVΔG-ZEBOV-GP Ebola vaccine in adults and children in Lambaréné, Gabon: A phase I randomised trial.

BACKGROUND: The rVSVΔG-ZEBOV-GP vaccine prevented Ebola virus disease when used at 2 × 107 plaque-forming units (PFU) in a trial in Guinea. This study provides further safety and immunogenicity data. METHODS AND FINDINGS: A randomised, open-label phase I trial in Lambaréné, Gabon, studied 5 single intramuscular vaccine doses of 3 × 103, 3 × 104, 3 × 105, 3 × 106, or 2 × 107 PFU in 115 adults and a dose of 2 × 107 PFU in 20 adolescents and 20 children. The primary objective was safety and tolerability 28 days post-injection. Immunogenicity, viraemia, and shedding post-vaccination were evaluated as secondary objectives. In adults, mild-to-moderate adverse events were frequent, but there were no serious or severe adverse events related to vaccination. Before vaccination, Zaire Ebola virus (ZEBOV)-glycoprotein (GP)-specific and ZEBOV antibodies were detected in 11% and 27% of adults, respectively. In adults, 74%-100% of individuals who received a dose 3 × 104, 3 × 105, 3 × 106, or 2 × 107 PFU had a ≥4.0-fold increase in geometric mean titres (GMTs) of ZEBOV-GP-specific antibodies at day 28, reaching GMTs of 489 (95% CI: 264-908), 556 (95% CI: 280-1,101), 1,245 (95% CI: 899-1,724), and 1,503 (95% CI: 931-2,426), respectively. Twenty-two percent of adults had a ≥4-fold increase of ZEBOV antibodies, with GMTs at day 28 of 1,015 (647-1,591), 1,887 (1,154-3,085), 1,445 (1,013-2,062), and 3,958 (2,249-6,967) for the same doses, respectively. These antibodies persisted up to day 180 for doses ≥3 × 105 PFU. Adults with antibodies before vaccination had higher GMTs throughout. Neutralising antibodies were detected in more than 50% of participants at doses ≥3 × 105 PFU. As in adults, no serious or severe adverse events related to vaccine occurred in adolescents or children. At day 2, vaccine RNA titres were higher for adolescents and children than adults. At day 7, 78% of adolescents and 35% of children had recombinant vesicular stomatitis virus RNA detectable in saliva. The vaccine induced high GMTs of ZEBOV-GP-specific antibodies at day 28 in adolescents, 1,428 (95% CI: 1,025-1,989), and children, 1,620 (95% CI: 806-3,259), and in both groups antibody titres increased up to day 180. The absence of a control group, lack of stratification for baseline antibody status, and imbalances in male/female ratio are the main limitations of this study. CONCLUSIONS: Our data confirm the acceptable safety and immunogenicity profile of the 2 × 107 PFU dose in adults and support consideration of lower doses for paediatric populations and those who request boosting. TRIAL REGISTRATION: Pan African Clinical Trials Registry PACTR201411000919191

Electron Tomography Reveals the Steps in Filovirus Budding

The filoviruses, Marburg and Ebola, are non-segmented negative-strand RNA viruses causing severe hemorrhagic fever with high mortality rates in humans and nonhuman primates. The sequence of events that leads to release of filovirus particles from cells is poorly understood. Two contrasting mechanisms have been proposed, one proceeding via a “submarine-like” budding with the helical nucleocapsid emerging parallel to the plasma membrane, and the other via perpendicular “rocket-like” protrusion. Here we have infected cells with Marburg virus under BSL-4 containment conditions, and reconstructed the sequence of steps in the budding process in three dimensions using electron tomography of plastic-embedded cells. We find that highly infectious filamentous particles are released at early stages in infection. Budding proceeds via lateral association of intracellular nucleocapsid along its whole length with the plasma membrane, followed by rapid envelopment initiated at one end of the nucleocapsid, leading to a protruding intermediate. Scission results in local membrane instability at the rear of the virus. After prolonged infection, increased vesiculation of the plasma membrane correlates with changes in shape and infectivity of released viruses. Our observations demonstrate a cellular determinant of virus shape. They reconcile the contrasting models of filovirus budding and allow us to describe the sequence of events taking place during budding and release of Marburg virus. We propose that this represents a general sequence of events also followed by other filamentous and rod-shaped viruses

Cryo-Electron Tomography of Marburg Virus Particles and Their Morphogenesis within Infected Cells

Ultrastructural analysis of a filovirus assembling within infected eukaryotic cells reveals differences in structure and assembly mechanisms between related RNA viruses

Marburg virus regulates the IRE1/XBP1-dependent unfolded protein response to ensure efficient viral replication

ABSTRACTViruses regulate cellular signalling pathways to ensure optimal viral replication. During Marburg virus (MARV) infection, large quantities of the viral glycoprotein GP are produced in the ER; this may result in the activation of the unfolded protein response (UPR). The most conserved pathway to trigger UPR is initiated by IRE1. Activation of IRE1 results in auto-phosphorylation, splicing of the XBP1 mRNA and translation of the XBP1s protein. XBP1s binds cis-acting UPR elements (UPRE) which leads to the enhanced expression of genes which should restore ER homeostasis. XBP1u protein is translated, if IRE1 is not activated. Here we show that ectopic expression of MARV GP activated the IRE1-XBP1 axis of UPR as monitored by UPRE luciferase assays. However, while at 24 h of infection with MARV IRE1 was phosphorylated, expression of XBP1s was only slightly enhanced and UPRE activity was not detected. The IRE1-XBP1 axis was not active at 48 h p.i. Co-expression studies of MARV proteins demonstrated that the MARV protein VP30 suppressed UPRE activation. Co-immunoprecipitation analyses revealed an RNA-dependent interaction of VP30 with XBP1u. Knock-out of IRE1 supported MARV infection at late time points. Taken together, these results suggest that efficient MARV propagation requires specific regulation of IRE1 activity

Wechselwirkungen von SARS-Coronavirus mit zellulären Abwehrmechanismen

Das im Jahre 2003 erstmals isolierte SARS-Coronavirus (SARS-CoV) verursacht bei Menschen ein schweres akutes Atemwegssyndrom mit einer Mortalitätsrate von 10%. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob SARS-CoV in zelluläre Abwehrmechanismen eingreift, was zu der für CoV einzigartigen Humanpathogenität beitragen könnte. Zu diesen Abwehrmechanismen zählen die Typ-I-Interferon (IFN)- Antwort sowie die Induktion von Apoptose. Die IFN-Antwort wird in SARS-CoVinfizierten Zellen nicht induziert, obwohl doppelsträngige (ds) RNA, bekannt als IFNInduktor, anwesend ist. Daher wurde vermutet, dass Proteine des SARS-CoV die Induktion von IFNs inhibieren. Zunächst wurden die Proteinprodukte aller offener Leserahmen (ORFs) des SARSCoV auf ihre Fähigkeit überprüft, die IFN-Antwort zu hemmen. In einem IFNsensitiven Reportergen-Assay konnte jedoch keines der Proteine als IFN-Antagonist identifiziert werden. Die Expression der viralen Proteine ORF 7a und ORF 7b führte sogar zur Induktion der IFN-Antwort sowie zur Induktion von Apoptose. Eine natürlich entstandene Deletionsmutante von ORF 7b induzierte dagegen weder die IFNAntwort noch Apoptose. Die Inhibition von ORF 7a und 7b führte im Falle eines ORF 7a-spezifischen Inhibitors zur Reduktion freigesetzter SARS-CoV-Partikel, was vermutlich auf eine unspezifische Bindung des Inhibitors an regulatorische Sequenzen im 5’-nicht translatierten Bereich des SARS-CoV-Genoms zurückzuführen ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass SARS-CoV in der späten Phase der Infektion Apoptose induziert. Nachgewiesen wurde die Spaltung der Caspasen 3 und 8 sowie die der poly-ADP-ribose-polymerase-1 (PARP). Die Infektion hatte jedoch keinen Einfluss auf die relativen Proteinmengen von Bcl2 und Bax. Ein wichtiges Bindeglied zwischen IFN-Antwort und Apoptose ist die antivirale Protein Kinase PKR. Sie wird durch Typ-I-IFNs induziert und phosphoryliert die a-Untereinheit des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor-2 (eIF2a), was zum Stopp der Translation in Zellen führen kann. Über diesen Weg, wie auch über direkte Interaktionen mit pro-apoptotischen Proteinen, ist PKR an der Induktion von Apoptose beteiligt. Weitere Kinasen, die eIF2a als Antwort auf virale Infektionen phosphorylieren, sind PERK und GCN2. Im Rahmen dieser Arbeit wurde festgestellt, dass die PKR in SARS-CoV-infizierten Zellen durch dsRNA aktiviert wird. Um die Konsequenzen dieser Aktivierung zu untersuchen, wurde die PKR-Expression in SARS-CoV-infizierten Zellen durchsynthetische DNA-Analoga, Peptid-gekoppelte Phosphorodiamidat-Morpholino- Oligomere (PPMO), die sich an die Ziel-mRNA anlagern, gehemmt. Der effizienteste Inhibitor exon-8 (ex-8) konnte die PKR-Expression um 98% reduzieren. Durch die Bindung von ex-8 an die PKR-mRNA werden Spleißstellen maskiert, was zum Entfernen von Exons aus der mRNA und damit zur Synthese trunkierter Proteine führt. Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass die Inhibition der PKR durch PPMO ex-8 zu einer verminderten Induktion von Apoptose durch SARS-CoV führte. Die Phosphorylierung von eIF2a hingegen war in diesen Zellen nicht reduziert. Das lässt vermuten, dass SARS-CoV die PKR-vermittelte Apoptose nicht über eIF2a induziert. Überraschenderweise hatte die Inhibition der PKR und die daraus resultierende Reduktion der Apoptose keinen Einfluss auf die Vermehrung von SARS-CoV. Wurde die Inhibition von Apoptose in SARS-CoV-infizierten Zellen durch die Behandlung mit einem Caspase-Inhibitor gehemmt, so beeinflusste das die Virusreplikation ebenfalls nicht. Das heißt die Induktion von Apoptose ist für die effiziente Vermehrung des SARS-CoV nicht von Bedeutung. Weitergehende Analysen anderer eIF2a-phosphorylierender Kinasen ergaben, dass PERK, nicht jedoch GCN2 durch eine Infektion mit SARS-CoV induziert wurde. Die Vorbehandlung SARS-CoV-infizierter Zellen mit IFN b führte zur reduzierten Phosphorylierung von eIF2a und PERK, auch die Menge freigesetzter SARS-CoV war deutlich reduziert. Da die Phosphorylierungsmuster von eIF2a und PERK in SARS-CoV-infizierten Zellen übereinstimmten, und die Inhibition der PKR keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von eIF2a hatte, wird vermutet, dass die Phosphorylierung von eIF2a in SARS-CoV-infizierten Zellen hauptsächlich durch PERK vermittelt wird. Die Phosphorylierung von eIF2a hatte keinen Einfluss auf die Vermehrung von SARS-CoV. Das Virus hat daher vermutlich Strategien entwickelt die inhibitorischen Effekte von eIF2a zu umgehen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Induktion der PKR sowie der Apoptose durch SARS-CoV keinen Einfluss auf die Vermehrung des Virus hat. Ob die Aktivierung von PERK und die Phosphorylierung von eIF2a von Vorteil für SARSCoV sind, könnte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein