Assessing the relevance of different sources of variability on the survival of foodborne pathogens: stress adaptation against genetic heterogeneities

[SPA] La evaluación de riesgos microbianos es crucial para proteger la salud pública, así como para que la cadena de suministro de alimentos sea eficiente. La evaluación debe considerar varias fuentes variabilidad en la respuesta microbiana, tales como la adaptación al estrés y las heterogeneidades genéticas, ya que éstas pueden afectar la supervivencia, el crecimiento y la virulencia de los patógenos alimentarios influyendo a su capacidad para causar enfermedades en humanos o alteraciones en los alimentarios. Actualmente existen grandes lagunas de conocimiento en cuanto a la variabilidad de la respuesta microbiana, por lo que su elucidación es esencial para una estimación precisa del riesgo, así como para el desarrollo de medidas de control eficaces. En base a esto, esta tesis de doctorado tiene como objetivo evaluar y comparar la importancia de la adaptación al estrés y las heterogeneidades genéticas en los microorganismos para la supervivencia de las bacterias a los tratamientos térmicos. En el Capítulo I se estudia la inactivación térmica de dos cepas de Salmonella (Salmonela Enteritidis CECT4300 y Senftenberg CECT4565) tanto en condiciones isotérmicas como dinámicas. Para los tratamientos isotérmicos, se encontró que S. Senftenberg era mucho más resistente que S. Enteritidis (por un factor de aproximadamente 10). También observamos diferencias cualitativas: las curvas de supervivencia isotermas de la cepa de S. Senftenberg fueron de tipo Weibull, mientras que el modelo Bigelow (lineal) fue capaz de describir la respuesta de S. Enteritidis. Así mismo, los modelos basados en experimentos isotérmicos fueron capaces de describir la inactivación dinámica de S. Senftenberg, mientras que S. Enteritidis necesitó de un modelo dinámico que consideraba la aclimatación del estrés. El estudio destaca que, además de la variabilidad cuantitativa, la inactividad microbiana también tiene una componente cualitativa. Esto enfatiza la importancia de considerar diferentes hipótesis de modelo para las condiciones isotérmicas y dinámicas. El Capítulo II va más allá en la inactivación térmica de Salmonella spp. centrándose en la importancia de la variabilidad fenotípica en la evaluación del riesgo microbiano. Esta fuente de variabilidad incluye las diferencias en el estado fisiológico de diferentes células de las mismas especies bacterianas debido a una exposición previa a diferentes entornos. Se estudió tanto el impacto de las condiciones de pre-cultivo subóptimas en la resistencia térmica de las mismas dos cepas de Salmonella como el efecto de un choque ácido. Los resultados muestran que la variabilidad fenotípica también es dependiente de la cepa. Para la cepa de Salmonella altamente resistente (S. Senftenberg), se observó una reducción de la resistencia térmica con respecto a las condiciones óptimas de incubación. Por otro lado, las condiciones de incubación subóptimas tuvieron el efecto opuesto en la cepa de referencia (S. Enteritidis), aumentando su resistencia térmica a través de la inducción de mecanismos de resistencia cruzada. En base a estos resultados, el estudio sugiere que la variabilidad fenotípica debería ser un aspecto central en la microbiología predictiva y la evaluación de riesgos, e ilustra un ejemplo hipotético de incorporación de esta fuente de variabilidad en el análisis de riesgos vinculando las condiciones pre-cultivo al origen de la contaminación bacteriana. El Capítulo III utiliza un organismo modelo (Bacillus subtilis) para profundizar en el estudio de las diferencias entre la inactivación bacteriana bajo condiciones isotermas y dinámicas. Con el objetivo de relacionar la respuesta microbiana observada a nivel poblacional con información a nivel molecular, se realizaron experimentos utilizando tanto una cepa silvestre como un mutante “sigB null”. Se observaron curvas de supervivencia con una curvatura hacia arriba, que a menudo se atribuye a la heterogeneidad en la resistencia térmica (hipótesis vitalística). Sin embargo, las curvas de inactivación tras la aplicación de un pretratamiento fueron log-lineales, indicando la adaptación dinámica al estrés durante el tratamiento isotérmico como una posible explicación de la curvatura observada. Esta interpretación de los resultados permite definir, en base a resultados isotermos, límites para la adaptación microbiana que se pueda desarrollar durante un tratamiento dinámico. Por lo tanto, este estudio proporciona una interpretación alternativa de las curvas de supervivencia bajo condiciones isotermas que podría llegar a mejorar nuestra capacidad de predecir la respuesta microbiana durante los tratamientos de pasteurización. [ENG] Microbial risk assessment is crucial for protecting public health and the food supply chain. Sources of variability in microorganisms, such as stress adaptation and genetic heterogeneities, can affect the survival, growth and virulence of microorganisms, and their ability to cause disease or food spoilage. There are currently large knowledge gaps regarding variability of the microbial response, and understanding it is essential for accurately estimating potential risks and to develop effective control measures. In light of this, this PhD thesis aims to compare and evaluate the importance of stress adaptation and genetic heterogeneities in microorganisms for the survival of bacteria to thermal treatments. Chapter I discusses the thermal inactivation of two Salmonella strains (Salmonella Enteritidis CECT4300 and Salmonella Senftenberg CECT4565) under both isothermal and dynamic conditions. For isothermal treatments, S. Senftenberg was found to be much more resistant than S. Enteritidis (by approximately a factor of 10). We also observed qualitative differences, with the inactivation models used to describe the response of S. Senftenberg were weibullian, while the Bigelow model was successful in describing the isothermal response of S. Enteritidis. Models based on isothermal experiments were able to describe dynamic inactivation of S. Senftenberg, while S. Enteritidis required a dynamic model that considered stress acclimation. The study highlights that, besides quantitative, variability in microbial inactivation is also qualitative. This underlies importance of considering different model hypotheses for both isothermal and dynamic conditions. Chapter II goes further in the thermal inactivation of Salmonella spp. focusing on the importance of phenotypic variability in microbial risk assessment, which refers to the physiological differences of cells of the same bacterial species due to prior exposure to different environments. The impact of sub-optimal pre-culture conditions or the application of an acid shock on the thermal resistance of the same two Salmonella strains was studied, founding that phenotypic variability is also strain-dependent. For the highly resistant strain (S. Senftenberg), the conditions tested resulted in a reduction of thermal resistance with respect to optimal incubation conditions. On the other hand, sub-optimal incubation conditions had the opposite effect on the reference strain (S. Enteritidis), increasing its thermal resistance through the induction of cross-resistance mechanisms. The study suggests that phenotypic variability should be a main focus in predictive microbiology and risk assessment, and illustrates a hypothetical example of how this could be achieved in practice by linking pre-incubation conditions to the origin of bacterial contamination. Chapter III uses a common model organism (Bacillus subtilis) to further study the differences between isothermal and dynamic bacterial inactivation. To link differences in the response to molecular mechanisms, experiments were made using both a wild type strain and a marker-free sigB null mutant. Survivor curves with an upward curvature were observed, which is often attributed to heterogeneity in thermal resistance (vitalistic hypothesis). However, a pretreatment resulted in log-linear survivor curves, indicating dynamic stress adaptation during the isothermal treatment as a possible explanation for the upward curvature. Based on this hypothesis, bounds were defined based on isothermal experiments to account for acclimation under dynamic conditions. The study provides an alternative interpretation for survivor curves, which can improve predictions of microbial response during pasteurization treatments.Escuela Internacional de Doctorado de la Universidad Politécnica de CartagenaUniversidad Politécnica de CartagenaPrograma de Doctorado en Técnicas Avanzadas en Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentari

Describing the heat shock response of Bacillus spp. under isothermal inactivation conditions

[ESP] El estrés ambiental y los métodos de procesamiento de alimentos, como el calentamiento, la acidez, son responsables de provocar respuestas adaptativas a las bacterias. La respuesta general al estrés en la mayoría de las bacterias Gram positivas, incluidas B. subtilis, L. monocytogenes, está regulada por el factor sigma alternativo σΒ que induce la transcripción de genes capaces de proporcionar a las células vegetativas resistencia al estrés. En este estudio, se analizó la resistencia al calor de las células vegetativas de B. subtilis bajo calentamiento isotérmico, así como la influencia de la ausencia del gen sigB en la resistencia al calor bacteriano. Los experimentos isotérmicos se llevaron a cabo en agua peptonada (pH 7) a 51, 52,5, 55 y 57,5°C y mostraron que ambas cepas eran bastante sensibles al calor. El mutante sigB presentó mayor inactivación a 51 y 52.5°C. [ENG] Adaptive responses to bacteria are triggered by environmental conditions and food processing processes such as heating and acidity. In the majority of Gram positive bacteria, including B. subtilis and L. monocytogenes, the overall stress response is governed by the alternative sigma factor σB (sigB), which stimulates the transcription of genes that provide resistance to stress to the vegetative cells. The heat resistance of B. subtilis vegetative cells was investigated under isothermal heating, as well as the effect of the sigB gene absence on bacterial heat resistance. Isothermal studies at 51, 52.5, 55, and 57.5°C in peptone water (pH 7) demonstrated that both strains were extremely heat sensitive. At 51 and 52.5°C, the sigB mutant presented more inactivation.Leonidas Georgalis is grateful for the “beca asociada a actividades de I+D+I”, convocatoria B- 077/20, for awarding him a pre−doctoral grant

Evaluation and prioritization of biological risk in Ready-To-Eat (RTE) meat products through mathematical modelling

[SPA] La producción moderna de alimentos ha reducido el coste y ha aumentado la variedad de alimentos disponibles, pero esta centralización del suministro de alimentos presenta una oportunidad para que los patógenos y toxinas transmitidos por los alimentos infecten y envenenen a un gran número de consumidores. El modelado es una herramienta clave para garantizar la seguridad de los alimentos producidos a partir de materias primas para el consumidor final. La hipótesis inicial es que es posible mejorar la seguridad de los productos cárnicos listos para comer (LPC) mediante la evaluación/priorización de riesgos biológicos. La clasificación de riesgos de los riesgos para la salud de los alimentos y la seguridad alimentaria y nutricional se reconoce generalmente como el punto de partida para el establecimiento de prioridades basadas en el riesgo y la asignación de recursos, ya que permite a los encargados de formular políticas asignar sus recursos al problema de salud pública más importante. El resultado de esta tesis será una herramienta sólida de gestión de la inocuidad de los alimentos que puede ser implementada por todos los interesados, como las agencias de protección al consumidor (EFSA, ECDC) y la industria. [ENG] Modern food production has reduced the cost and increased the variety of food available, but this centralisation of the food supply presents an opportunity for foodborne pathogens and toxins to infect and poison large numbers of consumers. Modelling is a key tool to ensure the safety of food produced from raw material to the final consumer. The starting hypothesis is that it is possible to improve the safety of Ready To Eat (RTE) meat products by evaluation / prioritization of biological risks. Risk ranking of feed/food safety and nutritional related health risks is generally recognised as the starting point for risk-based priority setting and resource allocation, as it permits policymakers to allocate their resources on the most significant public health problem. The outcome of the thesis will be a robust tool for food safety management that can be implemented by all stakeholders, such as agencies related to consumer protection (EFSA, ECDC) and industry.Leonidas Georgalis is grateful to the MINECO for awarding him a pre−doctoral grant, through Project AGL2017-86840-C2-1-R. To EFSA for awarding him an EU FORA fellowship, 2019-2020

Different model hypotheses are needed to account for qualitative variability in the response of two strains of Salmonella spp. under dynamic conditions

In this article, the thermal inactivation of two Salmonella strains (Salmonella Enteritidis CECT4300 and Salmonella Senftenberg CECT4565) was studied under both isothermal and dynamic conditions. We observed large differences between these two strains, with S. Senftenberg being much more resistant than S. Enteritidis. Under isothermal conditions, S. Senftenberg had non-linear survivor curves, whereas the response of S. Enteritidis was log-linear. Therefore, weibullian inactivation models were used to describe the response of S. Senftenberg, with the Mafart model being the more suitable one. For S. Enteritidis, the Bigelow (log-linear) inactivation model was successful at describing the isothermal response. Under dynamic conditions, a combination of the Peleg and Mafart models (secondary model of Mafart; t* of Peleg) fitted to the isothermal data could predict the response of S. Senftenberg to the dynamic treatments tested (heating rates between 0.5 and 10 °C/min). This was not the case for S. Enteritidis, where the model predictions based on isothermal data underestimated the microbial concentrations. Therefore, a dynamic model that considers stress acclimation to one of the dynamic profiles was fitted, using the remaining profiles as validation. In light of this, besides its quantitative impact, variability between strains of bacterial species can also cause qualitative differences in microbial inactivation. This is demonstrated by S. Enteritidis being able to develop stress acclimation where S. Senftenbenberg could not. This has important implications for the development of microbial inactivation models to support process design, as every industrial treatment is dynamic. Consequently, it is crucial to consider different model hypotheses, and how they affect the model predictions both under isothermal and dynamic conditions.The financial support of this research was provided by the Ministerio de Economía, Industria y Competitividad, Spain, through Project PID2020-116318RB-C32 and by FEDER funds. Dr. Alberto Garre was supported by a Maria Zambrano scholarship

Transmission Clusters, Predominantly Associated With Men Who Have Sex With Men, Play a Main Role in the Propagation of HIV-1 in Northern Spain (2013-2018)

Viruses of HIV-1-infected individuals whose transmission is related group phylogenetically in transmission clusters (TCs). The study of the phylogenetic relations of these viruses and the factors associated with these individuals is essential to analyze the HIV-1 epidemic. In this study, we examine the role of TCs in the epidemiology of HIV-1 infection in Galicia and the Basque County, two regions of northern Spain. A total of 1,158 HIV-1-infected patients from both regions with new diagnoses (NDs) in 2013-2018 were included in the study. Partial HIV-1 pol sequences were analyzed phylogenetically by approximately maximum-likelihood with FastTree 2. In this analysis, 10,687 additional sequences from samples from HIV-1-infected individuals collected in Spain in 1999-2019 were also included to assign TC membership and to determine TCs' sizes. TCs were defined as those which included viruses from ≥4 individuals, at least 50% of them Spaniards, and with ≥0.95 Shimodaira-Hasegawa-like node support in the phylogenetic tree. Factors associated to TCs were evaluated using odds ratios (OR) and their 95% CI. Fifty-one percent of NDs grouped in 162 TCs. Male patients (OR: 2.6; 95% CI: 1.5-4.7) and men having sex with men (MSM; OR: 2.1; 95% CI: 1.4-3.2) had higher odds of belonging to a TC compared to female and heterosexual patients, respectively. Individuals from Latin America (OR: 0.3; 95% CI: 0.2-0.4), North Africa (OR: 0.4; 95% CI: 0.2-1.0), and especially Sub-Saharan Africa (OR: 0.02; 95% CI: 0.003-0.2) were inversely associated to belonging to TCs compared to native Spaniards. Our results show that TCs are important components of the HIV-1 epidemics in the two Spanish regions studied, where transmission between MSM is predominant. The majority of migrants were infected with viruses not belonging to TCs that expand in Spain. Molecular epidemiology is essential to identify local peculiarities of HIV-1 propagation. The early detection of TCs and prevention of their expansion, implementing effective control measures, could reduce HIV-1 infections.This work was funded through Acción Estratégica en Salud Intramural (AESI), Instituto de Salud Carlos III, Project “Estudios sobre vigilancia epidemiológica molecular del VIH-1 en España,” PI16CIII/00033 and Project “Epidemiología molecular del VIH-1 en España y su utilidad para investigaciones biológicas y en vacunas“PI19CIII/0042; Red de Investigación en SIDA (RIS), Instituto de Salud Carlos III, Subdirección General de Evaluación y Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Nacional ICDCI, project RD16ISCIII/0002/0004; and scientific agreements with Consellería de Sanidade, Government of Galicia (MVI 1004/16), and Osakidetza-Servicio Vasco de Salud, Government of Basque Country (MVI 1001/16).S

Evaluación de la importancia de diferentes fuentes de variabilidad en la supervivencia de microorganismos patótenos alimentarios: adaptación al estrés frente a la heterogeneidad genética

Microbial risk assessment is crucial for protecting public health and the food supply chain. Sources of variability in microorganisms, such as stress adaptation and genetic heterogeneities, can affect the survival, growth and virulence of microorganisms and their ability to cause disease or food spoilage. There are currently large knowledge gaps regarding the variability of the microbial response and understanding it is essential for accurately estimating potential risks and developing effective control measures. In light of this, this PhD thesis aims to compare and evaluate the importance of stress adaptation and genetic heterogeneities in microorganisms for the survival of bacteria under thermal treatments. Chapter I discusses the thermal inactivation of two Salmonella strains (Salmonella Enteritidis CECT4300 and Salmonella Senftenberg CECT4565) under both isothermal and dynamic conditions. For isothermal treatments, S. Senftenberg was found to be much more resistant than S. Enteritidis (by approximately a factor of 10). We also observed qualitative differences, with the inactivation models used to describe the response of S. Senftenberg were weibullian, while the Bigelow model was successful in describing the isothermal response of S. Enteritidis. Models based on isothermal experiments were able to describe dynamic inactivation of S. Senftenberg, while S. Enteritidis required a dynamic model that considered stress acclimation. The study highlights that, besides being quantitative, variability in microbial inactivation is also qualitative. This underlines the importance of considering different model hypotheses for both isothermal and dynamic conditions. Chapter II goes further in the thermal inactivation of Salmonella spp. focusing on the importance of phenotypic variability in microbial risk assessment, which refers to the physiological differences of cells of the same bacterial species due to prior exposure to different environments. The impact of sub-optimal pre-culture conditions or the application of an acid shock on the thermal resistance of the same two Salmonella strains was studied, proving that phenotypic variability is also strain-dependent. For the highly resistant strain (S. Senftenberg), the conditions tested resulted in a reduction of thermal resistance with respect to optimal incubation conditions. On the other hand, sub-optimal incubation conditions had the opposite effect on the reference strain (S. Enteritidis), increasing its thermal resistance through the induction of cross-resistance mechanisms. The study suggests that phenotypic variability should be a main focus in predictive microbiology and risk assessment, and illustrates a hypothetical example of how this could be achieved in practice by linking pre-incubation conditions to the origin of bacterial contamination. Chapter III uses a common model organism (Bacillus subtilis) to further study the differences between isothermal and dynamic bacterial inactivation. To link differences in the response to molecular mechanisms, experiments were made using both a wild type strain and a marker-free sigB null mutant. Survivor curves with an upward curvature were observed, which is often attributed to heterogeneity in thermal resistance (vitalistic hypothesis). However, a pretreatment resulted in log-linear survivor curves, indicating dynamic stress adaptation during the isothermal treatment as a possible explanation for the upward curvature. Based on this hypothesis, bounds were defined based on isothermal experiments to account for acclimation under dynamic conditions. The study provides an alternative interpretation for survivor curves, which can improve predictions of microbial response during pasteurization treatments.Η αποτίμηση του μικροβιακού κινδύνου είναι ζωτικής σημασίας για την προστασία της δημόσιας υγείας. Πηγές μεταβλητότητας στους μικροοργανισμούς, όπως η προσαρμογή στο στρες και οι γενετικές ετερογένειες, μπορούν να επηρεάσουν την επιβίωση, την ανάπτυξη και τη λοιμογόνο δράση των μικροοργανισμών και την ικανότητά τους να προκαλούν ασθένειες ή αλλοίωση των τροφίμων. Επί του παρόντος, υπάρχουν μεγάλα κενά γνώσης σχετικά με τη μεταβλητότητα της μικροβιακής απόκρισης και η κατανόηση της είναι απαραίτητη για την ακριβή εκτίμηση των πιθανών κινδύνων και την ανάπτυξη αποτελεσματικών μέτρων ελέγχου. Υπό το πρίσμα αυτό, η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει να συγκρίνει και να αξιολογήσει τη σημασία της προσαρμογής στο στρες και των γενετικών ετερογενειών σε μικροοργανισμούς για την επιβίωση των βακτηρίων κάτω από θερμικές επεξεργασίες. Στο Κεφάλαιο Ι συζητείται η θερμική αδρανοποίηση δύο στελεχών Salmonella (Salmonella Enteritidis CECT4300 και Salmonella Senftenberg CECT4565) τόσο σε ισοθερμικές όσο και σε δυναμικές συνθήκες. Για τις ισοθερμικές συνθήκες, ο S. Senftenberg βρέθηκε να είναι πολύ πιο ανθεκτικός από τον S. Enteritidis (περίπου κατά 10 φορές). Παρατηρήσαμε επίσης ποιοτικές διαφορές, με τα μοντέλα αδρανοποίησης που χρησιμοποιήθηκαν για την περιγραφή της απόκρισης του S. Senftenberg να είναι weibullian, ενώ το μοντέλο Bigelow ήταν επιτυχές στην περιγραφή της ισοθερμικής απόκρισης του S. Enteritidis. Μοντέλα βασισμένα σε ισοθερμικά πειράματα μπόρεσαν να περιγράψουν τη δυναμική αδρανοποίηση του S. Senftenberg, ενώ ο S. Enteritidis απαιτούσε ένα δυναμικό μοντέλο που λαμβάνει υπόψη τον εγκλιματισμό του στρες. Η μελέτη τονίζει ότι, εκτός από ποσοτική, η μεταβλητότητα στη μικροβιακή αδρανοποίηση είναι και ποιοτική. Αυτό υπογραμμίζει τη σημασία της εξέτασης διαφορετικών υποθέσεων μοντέλων τόσο για ισοθερμικές όσο και για δυναμικές συνθήκες. Το Κεφάλαιο II προχωρά περαιτέρω στη θερμική αδρανοποίηση του Salmonella spp. εστιάζοντας στη σημασία της φαινοτυπικής μεταβλητότητας στην εκτίμηση του μικροβιακού κινδύνου, η οποία αναφέρεται στις φυσιολογικές διαφορές των κυττάρων του ίδιου βακτηριακού είδους λόγω προηγούμενης έκθεσης σε διαφορετικά περιβάλλοντα. Μελετήθηκε η επίδραση των μη βέλτιστων συνθηκών προκαλλιέργειας ή της εφαρμογής όξινου σοκ στη θερμική αντίσταση των ίδιων δύο στελεχών Salmonella, αποδεικνύοντας ότι η φαινοτυπική μεταβλητότητα εξαρτάται επίσης από το στέλεχος. Για το εξαιρετικά ανθεκτικό στέλεχος (S. Senftenberg), οι συνθήκες που δοκιμάστηκαν κατέληξαν σε μείωση της θερμικής αντίστασης σε σχέση με τις βέλτιστες συνθήκες επώασης. Από την άλλη πλευρά, οι μη βέλτιστες συνθήκες επώασης είχαν το αντίθετο αποτέλεσμα στο στέλεχος αναφοράς (S. Enteritidis), αυξάνοντας τη θερμική του αντίσταση μέσω της επαγωγής μηχανισμών διασταυρούμενης αντίστασης. Η μελέτη προτείνει ότι η φαινοτυπική μεταβλητότητα θα πρέπει να είναι το κύριο επίκεντρο στην προγνωστική μικροβιολογία και την αξιολόγηση κινδύνου και απεικονίζει ένα υποθετικό παράδειγμα του πώς αυτό θα μπορούσε να επιτευχθεί στην πράξη, συνδέοντας τις συνθήκες πριν από την επώαση με την προέλευση της βακτηριακής μόλυνσης. Το Κεφάλαιο III χρησιμοποιεί ένα κοινό πρότυπο οργανισμό (Bacillus subtilis) για να μελετήσει περαιτέρω τις διαφορές μεταξύ ισοθερμικής και δυναμικής βακτηριακής αδρανοποίησης. Για να συνδεθούν οι διαφορές στην απόκριση σε μοριακούς μηχανισμούς, έγιναν πειράματα χρησιμοποιώντας τόσο ένα στέλεχος άγριου τύπου (wild microbial strain) όσο και ένα γεννετικά τροποποιημένο στελεχος χωρίς τους sigB δείκτες (marker-free sigB null mutant). Παρατηρήθηκαν καμπύλες επιβίωσης με ανοδική καμπυλότητα, η οποία συχνά αποδίδεται σε ετερογένεια στη θερμική αντίσταση (βιταλιστική υπόθεση). Ωστόσο, μια προεπεξεργασία οδήγησε σε λογαριθμικές γραμμικές καμπύλες επιζώντων, υποδεικνύοντας τη δυναμική προσαρμογή του στρες κατά τη διάρκεια της ισοθερμικής επεξεργασίας ως πιθανή εξήγηση για την ανοδική καμπυλότητα. Με βάση αυτή την υπόθεση, τα όρια ορίστηκαν με βάση ισόθερμα πειράματα για να ληφθεί υπόψη ο εγκλιματισμός υπό δυναμικές συνθήκες. Η μελέτη παρέχει μια εναλλακτική ερμηνεία για τις καμπύλες επιζώντων, οι οποίες μπορούν να βελτιώσουν τις προβλέψεις της μικροβιακής απόκρισης κατά τη διάρκεια των επεξεργασιών παστερίωσης.La evaluación de riesgos microbianos es crucial para proteger la salud pública, así como para que la cadena de suministro de alimentos sea eficiente. La evaluación debe considerar varias fuentes variabilidad en la respuesta microbiana, tales como la adaptación al estrés y las heterogeneidades genéticas, ya que éstas pueden afectar la supervivencia, el crecimiento y la virulencia de los patógenos alimentarios influyendo a su capacidad para causar enfermedades en humanos o alteraciones en los alimentarios. Actualmente existen grandes lagunas de conocimiento en cuanto a la variabilidad de la respuesta microbiana, por lo que su elucidación es esencial para una estimación precisa del riesgo, así como para el desarrollo de medidas de control eficaces. En base a esto, esta tesis de doctorado tiene como objetivo evaluar y comparar la importancia de la adaptación al estrés y las heterogeneidades genéticas en los microorganismos para la supervivencia de las bacterias a los tratamientos térmicos. En el Capítulo I se estudia la inactivación térmica de dos cepas de Salmonella (Salmonela Enteritidis CECT4300 y Senftenberg CECT4565) tanto en condiciones isotérmicas como dinámicas. Para los tratamientos isotérmicos, se encontró que S. Senftenberg era mucho más resistente que S. Enteritidis (por un factor de aproximadamente 10). También observamos diferencias cualitativas: las curvas de supervivencia isotermas de la cepa de S. Senftenberg fueron de tipo Weibull, mientras que el modelo Bigelow (lineal) fue capaz de describir la respuesta de S. Enteritidis. Así mismo, los modelos basados en experimentos isotérmicos fueron capaces de describir la inactivación dinámica de S. Senftenberg, mientras que S. Enteritidis necesitó de un modelo dinámico que consideraba la aclimatación del estrés. El estudio destaca que, además de la variabilidad cuantitativa, la inactividad microbiana también tiene una componente cualitativa. Esto enfatiza la importancia de considerar diferentes hipótesis de modelo para las condiciones isotérmicas y dinámicas. El Capítulo II va más allá en la inactivación térmica de Salmonella spp. centrándose en la importancia de la variabilidad fenotípica en la evaluación del riesgo microbiano. Esta fuente de variabilidad incluye las diferencias en el estado fisiológico de diferentes células de las mismas especies bacterianas debido a una exposición previa a diferentes entornos. Se estudió tanto el impacto de las condiciones de pre-cultivo subóptimas en la resistencia térmica de las mismas dos cepas de Salmonella como el efecto de un choque ácido. Los resultados muestran que la variabilidad fenotípica también es dependiente de la cepa. Para la cepa de Salmonella altamente resistente (S. Senftenberg), se observó una reducción de la resistencia térmica con respecto a las condiciones óptimas de incubación. Por otro lado, las condiciones de incubación subóptimas tuvieron el efecto opuesto en la cepa de referencia (S. Enteritidis), aumentando su resistencia térmica a través de la inducción de mecanismos de resistencia cruzada. En base a estos resultados, el estudio sugiere que la variabilidad fenotípica debería ser un aspecto central en la microbiología predictiva y la evaluación de riesgos, e ilustra un ejemplo hipotético de incorporación de esta fuente de variabilidad en el análisis de riesgos vinculando las condiciones pre-cultivo al origen de la contaminación bacteriana. El Capítulo III utiliza un organismo modelo (Bacillus subtilis) para profundizar en el estudio de las diferencias entre la inactivación bacteriana bajo condiciones isotermas y dinámicas. Con el objetivo de relacionar la respuesta microbiana observada a nivel poblacional con información a nivel molecular, se realizaron experimentos utilizando tanto una cepa silvestre como un mutante “sigB null”. Se observaron curvas de supervivencia con una curvatura hacia arriba, que a menudo se atribuye a la heterogeneidad en la resistencia térmica (hipótesis vitalística). Sin embargo, las curvas de inactivación tras la aplicación de un pretratamiento fueron log-lineales, indicando la adaptación dinámica al estrés durante el tratamiento isotérmico como una posible explicación de la curvatura observada. Esta interpretación de los resultados permite definir, en base a resultados isotermos, límites para la adaptación microbiana que se pueda desarrollar durante un tratamiento dinámico. Por lo tanto, este estudio proporciona una interpretación alternativa de las curvas de supervivencia bajo condiciones isotermas que podría llegar a mejorar nuestra capacidad de predecir la respuesta microbiana durante los tratamientos de pasteurización

Different model hypotheses are needed to account for qualitative variability in the response of two strains of Salmonella spp. under dynamic conditions

In this article, the thermal inactivation of two Salmonella strains (Salmonella Enteritidis CECT4300 and Salmonella Senftenberg CECT4565) was studied under both isothermal and dynamic conditions. We observed large differences between these two strains, with S. Senftenberg being much more resistant than S. Enteritidis. Under isothermal conditions, S. Senftenberg had non-linear survivor curves, whereas the response of S. Enteritidis was log-linear. Therefore, weibullian inactivation models were used to describe the response of S. Senftenberg, with the Mafart model being the more suitable one. For S. Enteritidis, the Bigelow (log-linear) inactivation model was successful at describing the isothermal response. Under dynamic conditions, a combination of the Peleg and Mafart models (secondary model of Mafart; t* of Peleg) fitted to the isothermal data could predict the response of S. Senftenberg to the dynamic treatments tested (heating rates between 0.5 and 10 °C/min). This was not the case for S. Enteritidis, where the model predictions based on isothermal data underestimated the microbial concentrations. Therefore, a dynamic model that considers stress acclimation to one of the dynamic profiles was fitted, using the remaining profiles as validation. In light of this, besides its quantitative impact, variability between strains of bacterial species can also cause qualitative differences in microbial inactivation. This is demonstrated by S. Enteritidis being able to develop stress acclimation where S. Senftenbenberg could not. This has important implications for the development of microbial inactivation models to support process design, as every industrial treatment is dynamic. Consequently, it is crucial to consider different model hypotheses, and how they affect the model predictions both under isothermal and dynamic conditions

Species composition, distribution, ecological preference and host association of ticks in Cyprus

International audienceTick population and species depend on the effect of biotic and abiotic factors, especially vegetation, climate and host density; Cyprus, due to the mild climate, favors the appearance and spread of tick-borne infections. Our objective was to identify the tick species present in the island, to investigate their geographical distribution and their epidemiological implications. During a three-year study (2004-2006) we collected ticks from domestic and wild animals over the island of Cyprus. Data on temperature, humidity, altitude and vegetation, were also recorded. Each tick was identified by species using existing taxonomic keys. The results were mapped on a county level. During the current study 3057 ticks belonging to 11 tick species and four genera were collected from 441 (24.6%) infested animals. Rhipicephalus sanguineus was the predominant species (38.5%), followed by R. turanicus (21.3%) and R. bursa (17.8%). Most infestations occurred in May (24.0%), followed by March (13.6%) and June (12.2%). Rhipicephalus sanguineus had a positive correlation with humidity and temperature, R. bursa and Ixodes gibbosus had a positive correlation with altitude and a negative correlation with temperature. Contrary, Hyalomma excavatum had a negative correlation with altitude. Climate and the availability of hosts are among the major factors influencing ticks

Severity of the clinical presentation of hepatitis A in five European countries from 1995 to 2014.

Objectives: We analysed Hepatitis A (HepA) notifications and hospitalisations in Italy, Netherlands, Norway, Spain and Sweden for available periods between 1995 and 2014 to investigate whether decreasing HepA incidence is associated with increasing age at infection and worsening HepA presentation, and to identify groups-at-risk of severe disease. Methods: We performed a retrospective cohort study including 36734 notified and 36849 hospitalised patients. We used negative binomial regressions to identify over time i) trends in hospitalisation and notification rates; ii) proportion of hospitalised and notified patients aged ≥40 years; iii) proportion of severe hospitalisations; and iv) risk factors for severe hospitalisation. Results: During the study period: both HepA notifications and hospitalisations decreased, with notification rates decreasing faster; patients aged ≥40 years increased; however, the proportion of severe HepA hospitalisations remained stable. Older patients and patients with co-morbidities, particularly liver diseases, were more likely to experience severe disease. Conclusions: We used digitalised health information to confirm decreasing trends in HepA hospitalisations and notifications, and an increasing age of HepA patients in Europe. We did not identify an increase in the severity of the clinical presentation of HepA patients. Older patients with liver diseases are at increased risk of severe disease and should be prioritised for vaccination