Cell spreading on quartz crystal microbalance elicits positive frequency shifts indicative of viscosity changes

Cell attachment and spreading on solid surfaces was investigated with a home-made quartz crystal microbalance (QCM), which measures the frequency, the transient decay time constant and the maximal oscillation amplitude. Initial interactions of the adsorbing cells with the QCM mainly induced a decrease of the frequency, coincident with mass adsorption. After about 80min, the frequency increased continuously and after several hours exceeded the initial frequency measured before cell adsorption. Phase contrast and fluorescence microscopy indicated that the cells were firmly attached to the quartz surface during the frequency increase. The measurements of the maximal oscillation amplitude and the transient decay time constant revealed changes of viscoelastic properties at the QCM surface. An important fraction of these changes was likely due to alterations of cytosolic viscosity, as suggested by treatments of the attached cells with agents affecting the actin and microtubule cytoskeleton. Our results show that viscosity variations of cells can affect the resonance frequency of QCM in the absence of apparent cell desorption. The simultaneous measurements of the maximal oscillation amplitude, the transient decay time constant and the resonance frequency allow an analysis of cell adsorption to solid substratum in real time and complement cell biological method

Proteine and cell adsorption: topographical dependency and adlayer viscoelastic properties determined with oscillation amplitude of quartz resonator

La biocompatibilité des matériaux utilisés dans les domaines des implants et des biosenseurs dépend fortement des premières interactions ayant lieu entre une surface donnée et l’environnement biologique. Il est bien connu que lorsqu’un corps vivant est mis en contact avec une surface, une adsorption de protéines est induite (rétention de protéines sur une surface), formant une interface sur laquelle d’autres protéines ou cellules vont adsorber. Les interactions peuvent être influencées en modifiant les propriétés de la surface, qui sont la chimie, la charge et la topographie. Il a été démontré que les cellules sont sensibles à la topographie, se développant le long de rainures de largeurs définies et de profondeurs à l’échelle du micromètre. La question fondamentale abordée dans la première partie de cette thèse est de savoir si les protéines peuvent aussi ”sentir” la topographie à l’échelle du nanomètre, en analogie avec le comportement des cellules. Ces investigations sont particulièrement importantes, puisque des protéines sont toujours présentes entre la surface et les cellules. Les modifications topographiques doivent être effectuées à l’échelle du nanomètre, ce qui correspond à la grandeur des protéines. Avec un Microscope à Force Atomique (AFM) et en appliquant l’Oxidation Anodique Locale (LAO) à air ambiant, il est possible de créer des nanostructures d’une hauteur de 1 - 4nm et d’une largeur de 10nm. La caractérisation de la surface par Spectroscopie Photoélectronique à Rayons-X (XPS) révèle que la LAO assure une modification de la topographie de la surface sans aucun changement de sa composition chimique. Les surfaces structurées par LAO représentent ainsi des systèmes idéaux pour étudier l’adsorption des protéines en fonction de la topographie. Nous pouvons visualiser les nanostructures crées par l’AFM et successivement adsorber les protéines in-situ, rincer et imager la nouvelle surface. La comparaison des densités des protéines adsorbées sur les nanostructures et sur la surface vierge montre que l’arrangement des protéines dépend des nanostructures sous-jacentes. Une remarquable spécificité de l’adsorption de filaments d’actine (F-actine) est notée en fonction de la hauteur des nanostructures. Sur le titane (Ti), la F-actine adsorbe peu sur les lignes de 4nm de haut, et les protéines sont orientées aléatoirement. Au contraire, une grande adsorption de protéines est observée sur les structures ayant des hauteurs comprises entre 1 et 2nm. De plus, les filaments s’adsorbent de préférence parallèlement aux nanostructures. Sur le silicium, la F-actine adsorbe également de préférence le long des lignes de 1nm de haut, cependant la densité des protéines adsorbées est plus grande sur la surface non-structurée. Nous avons ainsi pu démontrer que les protéines sont sensibles à la nanotopographie des surfaces. Les expériences réalisées avec l’AFM ne permettent que des mesures statiques, et ne donnent aucune information quant à la cinétique d’adsorption des protéines. La seconde partie de cette thèse est consacrée à la construction d’une Microbalance à Crystal de Quartz (QCM) qui nous permet tout d’abord de suivre la cinétique d’adsorption, et deuxièmement d’acquérir des informations sur les propriétés viscoélastiques de la couche adsorbée. La QCM est une technique relativement nouvelle mais ultrasensible. Dans les liquides, la QCM peut détecter 9ng/cm2, et cette sensibilité atteint 0.135ng/cm2 dans le vide. Néanmoins, la quantification de la masse adsorbée est difficile à déterminer dans les milieux liquides, car différents phénomènes influencent les paramètres mesurés. Premièrement, les molécules d’eau retenues entre les particules adsorbées apportent leur contribution à la masse mesurée, et deuxièmement, une modification des propriétés du liquide ou de la masse, telles que la densité ou la viscosité, peuvent générer des artefacts. Au contraire des instruments commerciaux, la QCM que nous avons construite permet de mesurer l’amplitude maximale d’oscillation du crystal de quartz. Ce paramètre nous permet de distinguer la contribution due à la masse adsorbée de celle due aux changements de propriétés du liquide et de la masse. L’interprétation des mesures QCM est ainsi améliorée. Dans ce travail de thèse, des expériences ont été réalisées dans les liquides avec différents systèmes, comme des protéines et des cellules, ainsi que sur différentes surfaces. Une plus grande quantité de protéines s’adsorbent sur l’or que sur le Ti. Néanmoins lorsque la concentration des protéines est élevée, l’activité biologique des protéines est plus grande sur le titane. L’adsorption des cellules est régie par des phénomènes complexes qui ne sont pas encore entièrement compris. Nous démontrons que, durant les 80 premières minutes d’adsorption, l’expansion des cellules influence principalement les paramètres mesurés. Ensuite le cytosquelette est développé, induisant une rigidification de la cellule, ce qui augmente la viscosité totale de la cellule. Ce phénomène induit des variations de la fréquence, de l’amplitude et de la constante d’amortissement malgré qu’aucune modification réelle de la quantité de cellules adsorbées n’ait lieu. En utilisant des drogues, il a été possible de modifier l’état de polymérisation du cytosquelette, ce qui induit des changements des propriétés viscoélastiques des cellules adsorbées. Les changements de fréquence, d’amplitude et de constante d’amortissement mesurés durant l’expansion cellulaire ont ainsi pu être reproduits. En résumé, la topographie est un paramètre important qui doit être pris en considération dans le domaine général des biomatériaux, car la structure de la surface à l’échelle du nanomètre peut influencer la réponse d’un environnement biologique. Afin de mieux analyser l’adsorption de protéines et la réponse cellulaire envers des surfaces, la QCM est une technique très prometteuse, permettant non seulement de mesurer la masse adsorbée, mais aussi le développement des cellules. Il est cependant essentiel de mesurer plusieurs paramètres.The biocompatibility of materials in implant or biosensor fields strongly depends on first interactions occurring between a given surface and a biological environment. It is well-known that a living body brought into contact with a surface will induce protein adsorption, which creates the interface, on which proteins or cells will adsorb. The interactions can be influenced by modifying the surface properties, which are the chemistry, the surface charge and the topography of the surface. It has been shown that cells can “sense” the topography, growing along grooves of defined depth and width at the micrometer scale. In the first part of this thesis, the fundamental addressed question is whether proteins can ”sense” the topography, in analogy to what has been observed for cells on microstructures, because proteins are always present between the surface and the cells. Topographical modification have to be performed at the nanometer scale, corresponding to the size of proteins. Using an Atomic Force Microscope (AFM) and applying Local Anodic Oxidation (LAO) in ambient air, it is possible to create nanostructures of a height of 1 - 4nm and a width of 10nm. The characterization of the surface by X-Ray Photoelectron Spectroscopy (XPS) reveals that this method assures a modification of the topography of the surface without change of its chemical composition. Surfaces structured by LAO therefore represent ideal systems to study the dependence of protein adsorption on topography. We are able to visualize the created nanostructures by AFMand successively adsorb proteins in situ, rinse and image the new surface. The densities of adsorbed proteins on the nanostructured and neat surfaces are compared and we find that the protein arrangement depends on the underlying nanostructures. A remarkable specificity of the actin filament (F-actin) adsorption on the nanostructure height is noticed. On Ti, F-actin is observed to have a low adsorption on created lines of a height of 4nm and the adsorbed proteins appear to be randomly oriented. In contrast, high protein adsorption is observed for structure height between 1 and 2nm, moreover the filaments adsorb preferentially parallel to the nanostructured pattern. On Si, F-actin also adsorb preferentially along 1nm high lines, but the density of adsorbed proteins is higher on neat surface. We have therefore demonstrated that proteins “sense” the topography of surfaces at the nanometer scale. Experiments performed with AFM only permit static measurements giving no information on the kinetics of protein adsorption. The second part of this thesis is devoted to the building of a Quartz Crystal Microbalance (QCM), which allows us firstly to follow the adsorption kinetics, and secondly to get information about the viscoelastic properties of the adlayer. The QCM is a rather new but ultrasensitive technique. In liquid the QCM sensitivity is 9ng/cm2 and under vacuum it reaches 0.135ng/cm2. Nevertheless quantification of the amount of adsorbed mass is still difficult to determine under liquid loading, since different phenomena influence the measured parameters. Water molecules entrapped between adsorbed mass can firstly bring an added measured mass, and secondly modification of the liquid and mass properties such as density and viscosity can bring artefacts. In contrary to commercial instruments, our home-made QCM allows us to measure the maximal oscillation amplitude of the quartz crystal. This parameter allows us to distinguish the contribution due to adsorbed mass from the one due to changes of liquid and mass properties. The interpretation of the QCM measurements is therefore enhanced. During this thesis work experiments have been performed under liquid with different systems, such as proteins and cells, and on different surfaces. On Au more proteins adsorb on the surface, in comparison to Ti. Nevertheless the biological activity is larger on Ti at high protein concentration. Adsorption of cells involves complex phenomena, which are not yet fully determined. We demonstrate that during the first 80mn of adsorption, the spreading of the cell influences mostly the measured parameters. Thereafter the cytoskeleton of the cell is rearranged, inducing cell stiffening and an increase of the total cell viscosity. This phenomenon induces variations of the frequency, the amplitude and the decay time constant, although no real modification of the amount of adsorbed cell occurs. Using drugs, it has been possible to modify the polymerisation state of the cytoskeleton, inducing changes of the viscoelastic properties of the adsorbed cells. Changes of the measured frequency, amplitude and decay time constant during cell spreading could therefore be reproduced. In summary the topography is an important parameter, which has to be taken into account in the general biomaterial field, because the structure of the surface at a nanometer scale can influence the response of biological environments. In order to better analyze the protein adsorption and the cell response against surfaces, the QCM is a very promising technique, but it is essential to measure several parameters

Cell spreading on quartz crystal microbalance elicits positive frequency shifts indicative of viscosity changes.

Cell attachment and spreading on solid surfaces was investigated with a home-made quartz crystal microbalance (QCM), which measures the frequency, the transient decay time constant and the maximal oscillation amplitude. Initial interactions of the adsorbing cells with the QCM mainly induced a decrease of the frequency, coincident with mass adsorption. After about 80 min, the frequency increased continuously and after several hours exceeded the initial frequency measured before cell adsorption. Phase contrast and fluorescence microscopy indicated that the cells were firmly attached to the quartz surface during the frequency increase. The measurements of the maximal oscillation amplitude and the transient decay time constant revealed changes of viscoelastic properties at the QCM surface. An important fraction of these changes was likely due to alterations of cytosolic viscosity, as suggested by treatments of the attached cells with agents affecting the actin and microtubule cytoskeleton. Our results show that viscosity variations of cells can affect the resonance frequency of QCM in the absence of apparent cell desorption. The simultaneous measurements of the maximal oscillation amplitude, the transient decay time constant and the resonance frequency allow an analysis of cell adsorption to solid substratum in real time and complement cell biological methods

Simultaneous measurement of the maximum oscillation amplitude and the transient decay time constant of the QCM reveals stiffness changes of the adlayer.

Interpretation of adsorption kinetics measured with a quartz crystal microbalance (QCM) can be difficult for adlayers undergoing modification of their mechanical properties. We have studied the behavior of the oscillation amplitude, A(0), and the decay time constant, tau, of quartz during adsorption of proteins and cells, by use of a home-made QCM. We are able to measure simultaneously the frequency, f, the dissipation factor, D, the maximum amplitude, A(0), and the transient decay time constant, tau, every 300 ms in liquid, gaseous, or vacuum environments. This analysis enables adsorption and modification of liquid/mass properties to be distinguished. Moreover the surface coverage and the stiffness of the adlayer can be estimated. These improvements promise to increase the appeal of QCM methodology for any applications measuring intimate contact of a dynamic material with a solid surface