Development of a phage-based biosensor to detect Salmonella in food stuff

Tese de doutoramento Programa Doutoral em Engenharia Química e BiológicaFood- and waterborne illnesses are a serious public health concern worldwide and have stimulated research aiming at a rapid and accurate detection of pathogens by applying biosensing technologies. Salmonella, Campylobacter and E. coli are some examples of pathogens that have an enormous impact on public health. Many publications have mentioned different type of biosensors for a broad range of bacteria. These methods may circumvent the limitations that conventional microbiological techniques have. Pathogens of interest need culture enrichment steps to reach the detection limit, a process that requires time, as well as laboratory technicians with expertise skills. Detection of pathogens at a very early stage is not as easy as it seems, due to the necessity to unite a set of characteristics that enable the development of an inexpensive and robust biosensor. The ideal biosensing system should be rapid and accurate and should combine specificity and sensitivity, leading to a marginal amount of false positive or negative results. As the biosensor is composed of two parts, a biological and a sensor element, the biorecognition element of choice plays a crucial role when creating the perfect biosensor. Bacteriophages (or simply phages) are viruses that specifically recognize bacteria and this characteristic can be used as a potential "key" to solve problems related with bacterial detection. Moreover, the easy and low cost production of these viruses combined with their stability in harsh environmental conditions make them excellent competitors with other biological elements (e.g. antibodies, enzymes). The use of phages as a therapeutic agent and as an interface in detection systems has gained special interest of the research community. In many laboratories, phage-based platforms have been developed; however only a few have broken the barrier and went to the market as a clinical diagnostic tool. Nowadays, the food sector still uses conventional methods to detect Salmonella in food stuff that, as mentioned before, take times and requires expert skills. Notwithstanding the great improvements in the detection area, biosensing systems still lack sensitivity and give erroneous results. Furthermore, problems related to the detection of bacteria in a viable but nonculturable (VBNC) state is one of the concerns that can give false negatives. VBNC bacteria are not able to grow on standard bacteriological media, but are metabolically active, albeit very low, maintaining the capacity to cause diseases and therefore remain a potential risk in several health facilities and the food industry. The use of standard microbiological methods to detect if the bacterium is dead or alive is no practicable, since the presence of VBNC state is not detectable. Therefore, novel technologies that can overcome this barrier are imperative. The prevalence of this problem and the necessity of finding a detection technology that can fulfill the Salmonella detection needs, led to the proposal of the present work that explores phages as an interface in a magnetoresistive and magnetoelastic biosensor. The work presented herein describes the characterization of a broad host range lytic phage. PVP-SE1, is able to discriminate between cell viability states, including the VBNC condition. This phage was combined with highly sensitive magnetoresistive sensors originating a powerful detection system with highstandard performance at the accuracy, specificity but also sensitivity level, detecting bacteria concentrations in the order of 100 cells/μL (3-4 cells/sensor). Another strategy followed, aiming at circumventing the limitations of using whole phages in a biosensing interface, was the utilization of recognition peptides of phage origin, responsible for the identification of the hosts. The proof-of-concept was demonstrated with a model phage selected from landscape library as a streptavidin binder. The results showed that the streptavidin binding peptides extracted from the phage bind to streptavidin with the same or better affinity than the native phage. The same was demonstrated with the tail fibre proteins of phage PVP-SE1, heterologously expressed, which showed equal binding affinities compared to their parental phage. This work demonstrates how phages can be explored in the development of a biosensor, opening the possibility of using an accurate, sensitive, specific and cheaper device that can be applied to an emergent concern: foodborne pathogens.As doenças transmitidas através de alimentos e água contaminada são uma preocupação mundial e têm estimulado o desenvolvimento de métodos rápidos e precisos na área dos biossensores para a deteção de agentes patogénicos. Salmonela, Campylobacter e a E. coli são exemplos de espécies bacterianas patogénicos que tem um enorme impacto na saúde pública. Atualmente já existem diferentes tipos de biossensores desenvolvidos para uma ampla variedade de bactérias, que contornam as limitações das técnicas convencionais, tais como tempo de medida, devido à amplificação do microrganismo de interesse no seu adequado meio de cultura, e pela necessidade de técnicos com competências específicas. No entanto, a deteção de agentes patogénicos não é assim tão fácil como parece devido à necessidade de combinar um conjunto de características que permita o desenvolvimento de um biossensor robusto e pouco dispendioso. Um sistema de deteção ideal deve ser rápido, preciso e combinar características como especificidade e sensibilidade, de forma a conduzir a resultados livres de falsos positivos/negativos. Como o biossensor é composto por duas partes, i.e. um elemento biológico e um sensor, o elemento biológico escolhido tem um papel crucial no momento da criação de um biossensor perfeito. Bacteriófagos (ou simplesmente fagos) são vírus que infetam especificamente bactérias podendo essa característica ser utilizada como uma “chave” para solucionar problemas relacionados com a deteção de bactérias. Para além disso, a produção simples e económica destes vírus juntamente com a sua estabilidade em condições ambientais adversas, torna-os excelentes ferramentas de deteção, podendo competir com outros elementos biológicos (e.g. anticorpos, enzimas). A sua utilização como agentes terapêuticos e como interface em sistemas de deteção tem recebido uma atenção especial por parte da comunidade científica. Muitos laboratórios têm desenvolvido plataformas de deteção à base de fagos, no entanto, somente algumas conseguiram quebrar a barreira e entrar no mercado para serem usadas como ferramenta deteção para uso clinico. Hoje em dia, indústrias alimentares ainda usam métodos convencionais para detetar Salmonela na alimentação que, tal como previamente referido, são morosas e exigem mão de obra especializada. Mesmo utilizando diversas estratégias de deteção com diferentes plataformas e bio recetores, problemas com resultados falsos positivos e negativos permanecem difíceis de resolver. Bactérias viáveis, mas não cultiváveis são uma preocupação, porque estão relacionadas com resultados falsos negativos. Bactérias viáveis, mas não cultiváveis, não têm capacidade de crescer em meios de cultura convencional, mas encontram-se metabolicamente ativas, conservando a sua capacidade de causar doenças e de serem um potencial perigo em várias setores da saúde e na industria alimentar. Assim, a utilização de métodos de cultura padronizados para detetar se a bactéria está viva ou morta torna-se inviável, já que a presença de bactérias num estado viável, mas não cultivável não é detetada. Portanto, novas tecnologias que possam ultrapassar essa barreira são fundamentais. A prevalência deste problema e a necessidade de encontrar uma tecnologia de deteção que possa satisfazer as necessidades de deteção da Salmonela conduziu à proposta deste trabalho que explora os fagos como uma possível interface a usar em biossensores magneto-resistivos e magneto-elásticos. O trabalho presentado aqui descreve a caracterização de um fago lítico com um amplo espectro lítico, PVP-SE1. Este fago provou capacidade em discriminar os estados de viabilidade celular incluindo o estado viável, mas não cultivável. O fago foi combinado com sensores magneto-resistivos, que têm mostrado uma elevada sensibilidade. Esta combinação originou um poderoso sistema de deteção com um padrão de desempenho elevado, quer em termos de precisão e especificidade, quer em termos de sensibilidade, detetando concentrações de bactérias na ordem de 100 células/μL (3-4 células/sensor). Uma outra estratégia adotada, tendo por objetivo contornar as limitações da utilização dos fagos inteiros numa interface de um biossensor, passou pela utilização dos recetores dos fagos responsáveis pela identificação dos hospedeiros. Como prova de conceito um fago com especificidade de ligação à streptavidin foi selecionado a partir de uma biblioteca de fagos e usado como modelo. Os resultados demonstraram que os recetores do fago ligam-se à streptavidin com a mesma ou melhor afinidade do que o fago inteiro (original). O mesmo foi demonstrado com os recetores do fago PVP-SE1, demonstrando igualmente afinidades de ligação, comparativamente, com o seu fago parental. Este trabalho demonstrou como os fagos podem ser explorados no desenvolvimento de um biossensor abrindo a possibilidade de desenvolver um dispositivo preciso, sensível, específico e económico que possa ser aplicado a uma preocupação emergente: os patogénicos de origem alimentar

Comportamentos perturbados de vinculação em crianças em acolhimento institucional : contribuição das características da criança e dos cuidados

Dissertação de mestrado integrado em Psicologia (área de especialização em Psicologia Clínica)Os estudos têm revelado, com frequência, a manifestação de comportamentos perturbados de vinculação por crianças institucionalizadas. Ao mesmo tempo, têm apontado diversos riscos associados a estas crianças que justificam a procura sistemática de entendimento deste fenómeno. Neste âmbito, há variáveis que carecem de estudo e outras que despoletam controvérsia no que concerne ao seu papel na explicação das formas atípicas de vinculação. Assim, definiu-se como objetivo principal desta investigação a procura de fatores etiológicos dos comportamentos perturbados de vinculação, com destaque para a contribuição das caraterísticas da crianças e dos cuidados. Para tal, recorreu-se a uma amostra de 60 crianças portuguesas, em idade pré-escolar, que vivem em meio institucional e respetivas cuidadoras. Para classificação da qualidade do vínculo entre ambas, os técnicos institucionais responderam ao Questionário de Identificação do Cuidador, sendo esta informação averiguada e validada, de seguida, pelos investigadores com base em observações naturalísticas. Utilizou-se, também, a Disturbances of Attachment Interview (Smyke & Zeanah, 1999) para a exploração da presença de sinais de comportamentos perturbados de vinculação na criança. As cuidadoras, para além de responderem a esta entrevista, preenchiam o Children’s Behavior Questionnaire (Rothbart, 2000) para avaliação do temperamento da criança e o Questionário ao Prestador de Cuidados que permitiu conhecer caraterísticas relativas aos cuidados e crenças das cuidadoras. Uma tarefa semi-estruturada (Soares et al., 2010) permitiu averiguar a qualidade da interação da cuidadora com a criança. Os resultados revelaram que as crianças que têm cuidador preferido apresentam menos comportamentos inibidos. Estes comportamentos também se associaram negativa e marginalmente à sensibilidade da cuidadora e à dimensão do temperamento controlo por esforço. Os comportamentos desinibidos encontraram-se negativamente associados à sensibilidade e negativa e marginalmente correlacionados com o número de dias de trabalho por semana da cuidadora. Ademais, menor afetividade negativa e maior extroversão associaram-se a menos comportamentos do tipo desinibido. Verificou-se, ainda, que as crianças do sexo masculino manifestavam mais distorções de base segura do que as do sexo feminino. Estas formas atípicas de vinculação encontraram-se marginalmente correlacionadas com a idade das crianças na avaliação, e significativamente relacionadas com o rácio e negativamente associadas à sensibilidade da cuidadora. A sensibilidade da cuidadora mostrou-se correlacionada com algumas das suas crenças, mas não com o temperamento da criança. Os resultados sugerem que os comportamentos perturbados de vinculação têm diferentes fatores etiológicos que envolvem caraterísticas dos cuidados e da criança.Studies frequently reveal the manifestation of attachment disordered behaviors by institutionalized children. At the same time, they have been described many risks associated with these children that justify the systematic search for the understanding of this phenomenon. In this context, there are variables that require study and others that, concerning its role on explaining the atypical forms of attachment, are controversial. So, the main purpose of this investigation was to search the etiologic factors of attachment disordered behaviors, highlighting the characteristics of children and care’s contribution. To achieve it, we used a sample of 60 Portuguese children in preschool age, who live in institutions and respective caregivers. To classify the quality of the bond between them, the institutional technicians responded to the Identification Caregiver Questionnaire, and then, this information was investigated and validated by researchers based on naturalistic observations. We also used the Disturbances of Attachment Interview (Smyke & Zeanah, 1999) to explore the signs of attachment disordered behaviors in the child. The caregivers, in addition of responding to this interview, also answered the Children's Behavior Questionnaire (Rothbart, 2000) to assess the child's temperament and the Caregiver Questionnaire, providing knowledge concerning the characteristics of the care and caregivers’ beliefs. An interactive task (Soares et al., 2010) allowed the access to the quality of close care. The results revealed that children who have preferred a certain caregiver presented less inhibited behaviors. These behaviors were also negative and marginally associated to the caregiver’s sensitivity and the dimension of behavior effortful control. Disinhibited behaviors were negatively associated with the sensitivity, and negative and marginally correlated with the number of working days per week of the caregiver. Furthermore, smaller negative affectivity and higher extraversion were associated with less disinhibited behavior type. It was also found that male children manifested more secure base distortions than the female. These atypical forms of attachment were found positive and marginally correlated in the evaluation with the age of children, positively and significantly related to the ratio and negatively associated with caregiver’s sensitivity. The sensitivity of the caregiver was significantly correlated with some of their beliefs, but not with the child's temperament. The results suggest that attachment disordered behaviors have different etiological factors related to characteristics of the child and of the institutional care.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Bolsa de Investigação PTDC/PSIPCL/ 101506/2008; P.I.: Isabel Soare

Transition of young people with special needs to post-school life, in Finland

Este trabalho foi financiado por fundos da Agência Portuguesa Erasmus+ Educação e Formação, no âmbito do Projeto “Investir hoje na escola do amanhã” (contrato 2015-1-PT01-KA101-012661), do Programa ERASMUS+Esta comunicação tem por base uma experiência de Job Shadowing, que ocorreu no âmbito da Ação-Chave 1 – Mobilidade Individual para fins de aprendizagem, do Programa Erasmus+, da Comissão Europeia. Observámos as práticas relativas à Transição para a Vida Pós-Escolar de alunos com necessidades educativas especiais, que beneficiam de um Currículo Específico, na Finlândia. Recolhemos dados através de visitas a escolas públicas de uma região do sul da Finlândia, entrevistas a diretores (liderança de topo) e professores (liderança intermédia), e observação de alunos em contexto de experiência em local de trabalho. Os dados são analisados considerando aspetos como: a busca de respostas diversificadas para o encaminhamento profissional destes jovens na comunidade e mercado de trabalho, a atitude colaborativa dos professores face à inclusão, as parcerias entre a escola, o município e a comunidade, e a empregabilidade. Espera-se que esta esta experiência educativa contribua para a discussão sobre a adequada gestão das situações de aprendizagem conducentes à efetivação de uma escola para todosThis communication is based on Job Shadowing experience, which took place under the European Commission’s Key Action 1 – Individual Mobility for Learning, ERASMUS+ Programme. We have observed the practices of transition to post-school life for special needs students, who benefit of a specific curriculum, in Finland. We have collected data through visits to public schools in a region of southern Finland, interviews with headmasters (top leadership) and teachers (intermediate leadership), and observation of students in the context of workplace experience sessions. The data are analysed, considering aspects such as: the search for diversified answers for the professional integration of these young people in community and labour market, the collaborative attitude of the teachers in school life regarding inclusion, the partnerships between school, municipality and community, and employability. It is expected that this educational experience will contribute to the discussion about the adequate management of learning situations in order to get a school for al

Towards Cooperative Organometallic and Enzymatic Catalysis to Develop New Value Chains from Organic Wastes

"The procurement of sustainable technologies is the major driving force for current industrial development. The 12 principles of Green Chemistry are important guidelines for their development and the first one directs towards waste reduction instead of remediation. (...)

Children’s right to participate in early childhood education: From rights to empirical evidence

Children’s right to participate has gained recognition in society in general, and in various areas of scientific research in particular. Children’s right to participate refers to children’s right to be heard, and to have their perspectives considered, influencing decisions affecting them. The promotion of children’s participation is recommended from an early age, namely in early childhood education (ECE) settings, and it is considered an important criterion for assessing the quality of these settings. Nonetheless, little empirical evidence exists on children’s right to participate in ECE. Therefore, our goal was to provide new insights on this topic. For this purpose, we first conducted a systematic review of the literature on children’s right to participate in ECE, mapping research conducted in this field. Further, we developed measures to assess children’s ideas, and ECE teachers’ ideas and practices towards the promotion of participation. Finally, we documented children’s and teachers’ ideas about children’s participation in ECE, and investigated associations between teachers’ ideas and practices, and children’s perceptions of their participation. Our findings highlight the associations between teachers’ ideas and practices, and children’s perceived participation, suggesting the importance of both objective and subjective properties of ECE settings in promoting children’s participation. We provide an integrative discussion of the theoretical, practical, and policy implications of our findings.O direito de participação das crianças ganhou reconhecimento na sociedade, em diversas áreas do conhecimento e na investigação. A participação das crianças refere-se ao direito de serem ouvidas e terem as suas perspectivas consideradas, influenciando as decisões que lhes dizem respeito. A participação é recomendada desde cedo, nomeadamente em contextos de educação de infância, sendo descrita como um importante critério para a avaliação da qualidade destes contextos. No entanto, existe pouca evidência sobre o direito de participação das crianças em contextos de educação de infância. Com base em quatro estudos, procurou-se investigar e expandir o conhecimento sobre este tema. Realizou-se uma revisão sistemática de literatura sobre o direito de participação das crianças em contextos de educação de infância, mapeando a investigação existente. Desenvolveram-se medidas para avaliar as ideias das crianças bem como as ideias e práticas dos/as educadores/as de infância sobre o direito de participação. Foram documentadas as ideias de crianças e de educadores/as de infância sobre a participação, e investigadas as associações entre as ideias e práticas dos/as educadores/as e as percepções das crianças sobre a sua participação. Os resultados salientam o papel crucial das ideias e das práticas dos/as educadores/as para a participação das crianças, realçando a importância das propriedades objetivas e subjetivas dos contextos. Os resultados são discutidos atendendo às suas implicações teóricas, práticas e políticas

Towards an orientation enhanced astar algorithm for robotic navigation

This paper presents an algorithm capable of generating smooth, feasible paths for an any-shape non-holonomic mobile robot, taking into account orientation restrictions, with the aim of navigating close to obstacles. Our contribution consists in an extension of the A∗ algorithm in a cell decomposition, where besides its position, the orientation of the platform is also considered when searching for a path. This is achieved by constructing 16 layers of orientations and only visiting neighbor layers when searching for the lowest cost. To simplify collision checking, the robot's footprint is used to inflate obstacles, yet, to allow the robot to find paths close to obstacles, the actual footprint of the robot must used. By discretizing the orientation space into layers and computing an oriented footprint for each layer, the actual footprint of the robot is used, increasing the configuration space without becoming computationally expensive. The path planning algorithm was developed under the EU-funded project CARLoS 1 and was implemented in a stud welding robot simulated within a naval industry environment, validating our approach.The authors would like to thank everyone involved in the CARLoS Project. This project has received funding from the European Commission Seventh Framework Programme for Research and Technological Development under the grant agreement number 606363 and from the national project ”NORTE-07-0124-FEDER-000060”.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Musculoskeletal chronic complications in women survivors of breast cancer

As mulheres com cancro da mama obtiveram, nos últimos anos, um aumento significativo da esperança média de vida; contudo, muitas destas mulheres vivem com as complicações crónicas resultantes do tratamento. O objetivo deste estudo é caracterizar as complicações músculo-esqueléticas (CME) nas sobreviventes de cancro da mama e enfatizar a necessidade de desenvolver terapêuticas preventivas para estas complicações. Métodos – Noventa e quatro mulheres sobreviventes de cancro da mama responderam a um questionário sobre potenciais CME. Resultados – Foi detetada associação significativa entre idade e linfedema (p=0,004), dor no braço (DB) (p=0,000), dor no ombro (DO) (p=0,004), dificuldade em elevar o braço (DEB) (p=0,022) e cervicalgia (p=0,000), verificando-se uma maior incidência nas mulheres com mais de 50 anos. Uma associação significativa foi detetada entre linfadenectomia e linfedema (p=0,000), DB (p=0,000), DO (p=0,008), verificando-se que as mulheres sujeitas a linfadenectomia apresentam maior incidência de linfedema, de DB e de DO. Quanto à sobrevivência constatou-se que as mulheres com mais de 10 anos de sobrevivência têm mais CME. Relativamente à mastectomia foi detetada associação significativa com o linfedema (p=0,012), DB (p=0,020), DO (p=0,003), DEB (p=0,037) e cervicalgia (p=0,020). Verificou-se que as mulheres mastectomizadas têm maior tendência para apresentar linfedema, DB, DO, DEB e cervicalgia. Conclusão – No nosso estudo, as mulheres acima dos 50 anos, as que realizaram a linfadenectomia, as com mais de 10 anos de sobrevivência e as mastectomizadas apresentaram maior incidência de CME.ABSTRACT: Women diagnosed with breast cancer, have seen a significant increase in life expectancy in recent years. However, many of these women are living with chronic complications resulting from treatment. The aim of this study is to characterize musculoskeletal complications (MC) in breast cancer survivors, and emphasize the need to develop preventive therapies for these complications. Methods – Ninety four women survivors of breast cancer answered a questionnaire about potential MC. Results – The association between age and lymphedema (p=0.004), arm pain (AP) (p=0.000), shoulder pain (SP) (p=0.004), difficulty in raising the arm (DRA) (p=0.022) and neck pain (NP) (p=0.000) showed a higher incidence in women over 50 years. Women whith lymphadenectomy showed higher incidence of lymphedema (p=0.000), AP (p=0.000), SP (p=0.008). Regarding survival, it was found that women over 10 years of survival have more MC. Mastectomized women are more likely to have lymphedema (p=0.012), AP (p=0.020), SP (p=0.003), DRA (p=0.037) and NP. Conclusion – In our study women over 50 years, women with lymphadenectomy and with over 10 years of survival after treatment of breast cancer and mastectomized had a higher incidence of MC