Tese de doutoramento Programa Doutoral em Engenharia Química e BiológicaFood- and waterborne illnesses are a serious public health concern worldwide and have stimulated
research aiming at a rapid and accurate detection of pathogens by applying biosensing
technologies. Salmonella, Campylobacter and E. coli are some examples of pathogens that
have an enormous impact on public health. Many publications have mentioned different type
of biosensors for a broad range of bacteria. These methods may circumvent the limitations
that conventional microbiological techniques have. Pathogens of interest need culture enrichment
steps to reach the detection limit, a process that requires time, as well as laboratory
technicians with expertise skills. Detection of pathogens at a very early stage is not as easy as
it seems, due to the necessity to unite a set of characteristics that enable the development of
an inexpensive and robust biosensor. The ideal biosensing system should be rapid and accurate
and should combine specificity and sensitivity, leading to a marginal amount of false
positive or negative results. As the biosensor is composed of two parts, a biological and a
sensor element, the biorecognition element of choice plays a crucial role when creating the
perfect biosensor. Bacteriophages (or simply phages) are viruses that specifically recognize
bacteria and this characteristic can be used as a potential "key" to solve problems related with
bacterial detection. Moreover, the easy and low cost production of these viruses combined with their stability in harsh environmental conditions make them excellent competitors with
other biological elements (e.g. antibodies, enzymes). The use of phages as a therapeutic agent
and as an interface in detection systems has gained special interest of the research community.
In many laboratories, phage-based platforms have been developed; however only a few
have broken the barrier and went to the market as a clinical diagnostic tool. Nowadays, the
food sector still uses conventional methods to detect Salmonella in food stuff that, as mentioned
before, take times and requires expert skills. Notwithstanding the great improvements
in the detection area, biosensing systems still lack sensitivity and give erroneous results. Furthermore,
problems related to the detection of bacteria in a viable but nonculturable (VBNC)
state is one of the concerns that can give false negatives. VBNC bacteria are not able to grow on standard bacteriological media, but are metabolically active, albeit very low, maintaining
the capacity to cause diseases and therefore remain a potential risk in several health facilities
and the food industry. The use of standard microbiological methods to detect if the bacterium
is dead or alive is no practicable, since the presence of VBNC state is not detectable. Therefore,
novel technologies that can overcome this barrier are imperative. The prevalence of this
problem and the necessity of finding a detection technology that can fulfill the Salmonella
detection needs, led to the proposal of the present work that explores phages as an interface in
a magnetoresistive and magnetoelastic biosensor. The work presented herein describes the
characterization of a broad host range lytic phage. PVP-SE1, is able to discriminate between
cell viability states, including the VBNC condition. This phage was combined with highly
sensitive magnetoresistive sensors originating a powerful detection system with highstandard
performance at the accuracy, specificity but also sensitivity level, detecting bacteria
concentrations in the order of 100 cells/μL (3-4 cells/sensor). Another strategy followed, aiming
at circumventing the limitations of using whole phages in a biosensing interface, was the utilization of recognition peptides of phage origin, responsible for the identification of the
hosts. The proof-of-concept was demonstrated with a model phage selected from landscape
library as a streptavidin binder. The results showed that the streptavidin binding peptides extracted
from the phage bind to streptavidin with the same or better affinity than the native
phage. The same was demonstrated with the tail fibre proteins of phage PVP-SE1,
heterologously expressed, which showed equal binding affinities compared to their parental
phage. This work demonstrates how phages can be explored in the development of a biosensor,
opening the possibility of using an accurate, sensitive, specific and cheaper device that
can be applied to an emergent concern: foodborne pathogens.As doenças transmitidas através de alimentos e água contaminada são uma preocupação
mundial e têm estimulado o desenvolvimento de métodos rápidos e precisos na área dos biossensores
para a deteção de agentes patogénicos. Salmonela, Campylobacter e a E. coli são
exemplos de espécies bacterianas patogénicos que tem um enorme impacto na saúde pública.
Atualmente já existem diferentes tipos de biossensores desenvolvidos para uma ampla variedade
de bactérias, que contornam as limitações das técnicas convencionais, tais como tempo
de medida, devido à amplificação do microrganismo de interesse no seu adequado meio de
cultura, e pela necessidade de técnicos com competências específicas. No entanto, a deteção
de agentes patogénicos não é assim tão fácil como parece devido à necessidade de combinar
um conjunto de características que permita o desenvolvimento de um biossensor robusto e
pouco dispendioso. Um sistema de deteção ideal deve ser rápido, preciso e combinar características
como especificidade e sensibilidade, de forma a conduzir a resultados livres de falsos
positivos/negativos. Como o biossensor é composto por duas partes, i.e. um elemento biológico
e um sensor, o elemento biológico escolhido tem um papel crucial no momento da criação
de um biossensor perfeito. Bacteriófagos (ou simplesmente fagos) são vírus que infetam
especificamente bactérias podendo essa característica ser utilizada como uma “chave” para
solucionar problemas relacionados com a deteção de bactérias. Para além disso, a produção simples e económica destes vírus juntamente com a sua estabilidade em condições ambientais
adversas, torna-os excelentes ferramentas de deteção, podendo competir com outros elementos
biológicos (e.g. anticorpos, enzimas). A sua utilização como agentes terapêuticos e como
interface em sistemas de deteção tem recebido uma atenção especial por parte da comunidade
científica. Muitos laboratórios têm desenvolvido plataformas de deteção à base de fagos, no
entanto, somente algumas conseguiram quebrar a barreira e entrar no mercado para serem
usadas como ferramenta deteção para uso clinico. Hoje em dia, indústrias alimentares ainda
usam métodos convencionais para detetar Salmonela na alimentação que, tal como previamente
referido, são morosas e exigem mão de obra especializada. Mesmo utilizando diversas estratégias de deteção com diferentes plataformas e bio recetores, problemas com resultados
falsos positivos e negativos permanecem difíceis de resolver. Bactérias viáveis, mas não cultiváveis
são uma preocupação, porque estão relacionadas com resultados falsos negativos.
Bactérias viáveis, mas não cultiváveis, não têm capacidade de crescer em meios de cultura
convencional, mas encontram-se metabolicamente ativas, conservando a sua capacidade de
causar doenças e de serem um potencial perigo em várias setores da saúde e na industria alimentar.
Assim, a utilização de métodos de cultura padronizados para detetar se a bactéria está
viva ou morta torna-se inviável, já que a presença de bactérias num estado viável, mas não
cultivável não é detetada. Portanto, novas tecnologias que possam ultrapassar essa barreira
são fundamentais. A prevalência deste problema e a necessidade de encontrar uma tecnologia
de deteção que possa satisfazer as necessidades de deteção da Salmonela conduziu à proposta
deste trabalho que explora os fagos como uma possível interface a usar em biossensores
magneto-resistivos e magneto-elásticos. O trabalho presentado aqui descreve a caracterização
de um fago lítico com um amplo espectro lítico, PVP-SE1. Este fago provou capacidade em
discriminar os estados de viabilidade celular incluindo o estado viável, mas não cultivável. O fago foi combinado com sensores magneto-resistivos, que têm mostrado uma elevada sensibilidade.
Esta combinação originou um poderoso sistema de deteção com um padrão de desempenho
elevado, quer em termos de precisão e especificidade, quer em termos de sensibilidade,
detetando concentrações de bactérias na ordem de 100 células/μL (3-4 células/sensor). Uma
outra estratégia adotada, tendo por objetivo contornar as limitações da utilização dos fagos
inteiros numa interface de um biossensor, passou pela utilização dos recetores dos fagos responsáveis
pela identificação dos hospedeiros. Como prova de conceito um fago com especificidade
de ligação à streptavidin foi selecionado a partir de uma biblioteca de fagos e usado
como modelo. Os resultados demonstraram que os recetores do fago ligam-se à streptavidin
com a mesma ou melhor afinidade do que o fago inteiro (original). O mesmo foi demonstrado
com os recetores do fago PVP-SE1, demonstrando igualmente afinidades de ligação, comparativamente,
com o seu fago parental. Este trabalho demonstrou como os fagos podem ser
explorados no desenvolvimento de um biossensor abrindo a possibilidade de desenvolver um
dispositivo preciso, sensível, específico e económico que possa ser aplicado a uma preocupação
emergente: os patogénicos de origem alimentar