Propiedades de las mitocondrias de cerebro de rata durante la maduración postnatal : Efecto del hipotiroidismo

En el presente trabajo se estudiaron las características bioquímicas de las mitocondrias de cerebro de rata durante la maduración postnatal y el efecto de la tiroideotomía neonatal sobre las mismas. Para ello primero se debió obtener una preparación de mitocondrias de cerebro de rata en satisfactorio estado de pureza, lo que se logró utilizando el método de Løvtrup y Zelander para su obtención. Las mitocondrias así obtenidas se encontraban en la conformación condensada y presentaban valores satisfactorios de P/O y C.R. con diversos sustratos oxidables. Maduración Se estudió el período de maduración comprendido entre los 5 y 30 días de vida postnatal. El contenido proteico de las mitocondrias purificadas, en base al peso de tejido fresco original, aumentó aproximadamente 4 veces entre los 5 y 30 días de edad. La actividad de SDH, expresada en base al peso de tejido fresco original, presentó un aumento de aproximadamente 5 veces entre los 5 y 30 días; mientras que la actividad específica de la misma se duplicó durante este período. Se estudió la fosforilación oxidativa utilizando piruvato+L—malato y succinato como sustratos oxidables. Con piruvato+L—malato se observó un aumento de 3 veces, tanto en el consumo de oxígeno como en el de fosfato inorgánico, entre los 5 y 30 días de edad; con succi­nato el aumento observado en ambos parámetros fué de 2 veces. Tanto los valores de P/O como los de C.R. obtenidos con ambos sustratos fueron satisfactorios desde los 5 días y permanecieron constantes durante todo el período estudiado. Esto sugiere que tanto los sistemas involucrados en el transporte de electrones como en la síntesis de ATP aumentan paralelamente y se mantienen en un óptimo grado de acoplamiento durante el período de maduración postnatal. La concentración de ubiquinona/mg de proteína mitocondrial aumentó aproximadamente 2 veces entre los 5 y 30 días de edad, produciéndose el aumento más importante entre el 10mo y 20mo día. Los niveles de los citocromos/mg de proteína mitocondrial aumentaron aproximadamente 2 veces entre los 5 y 30 días de vida postnatal. Los citocromos c+c1 y a presentaron los aumentos más importantes entre los 1O y 20 días; mientras que el citocromo b aumentó significativamente entre los 15 y 20 días de edad. El aumento de la concentración de los componentes de la cadena respiratoria permite postular un aumento de la superficie de la membrana interna de la mitocondria cerebral durante la maduración postnatal. Los resultados obtenidos, que indican que los diferentes parámetros estudiados no aumentan paralelamente, sugieren que la composición de la membrana interna de la mitocondria cerebral varía durante la maduración. Por lo tanto, el aumento observado en el metabolismo oxidativo de las mitocondrias cerebrales durante la maduración se debería a los cambios que ocurren en la composición de estos organoides, los que alcanzarían las características del animal adulto a los 20 días de vida postnatal. Hipotiroidismo Se estudió la fosforilación oxidativa en mitocondrias de cerebro de ratas normales y radiotiroidectomizadas en el momento del nacimiento, a los 30 días de edad. Cuando se utilizó piruvato+L-malato como sustrato se observó una disminución del 17 % aproximadamente, tanto en el consumo de oxígeno como en el de fosfato inorgánico, en las preparaciones provenientes de las ratas cretinas. Utilizando succinato como sustrato se obtuvieron los mismos valores de consumo de oxígeno y de fosfato inorgánico en las ratas normales y en las hipotiroideas. Con los dos sustratos utilizados no se observaron alteraciones ni en el P/O ni en el C.R. La actividad específica de SDH no fué modificada por efecto de la tiroidectomía neonatal. Según estos resultados no se producirían alteraciones fundamentales en la composición de las mitocondrias cerebrales por efecto de la tiroidectomía neonatal. Se discute, en relación con diversos resultados, la hipótesis según la cual la falta de hormona tiroidea desde el nacimiento produciría una disminución en la síntesis de proteínas, que se reflejaría en una disminuída síntesis de las diferentes membranas. Por lo tanto, esto traería como consecuencia, una disminución en el número de las mitocondrias cerebrales, sin que se produzcan alteraciones fundamentales en la composición de las mismas.Fil: Chepelinsky, Ana Berta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Aquaporins: important but elusive drug targets.

The aquaporins (AQPs) are a family of small, integral membrane proteins that facilitate water transport across the plasma membranes of cells in response to osmotic gradients. Data from knockout mice support the involvement of AQPs in epithelial fluid secretion, cell migration, brain oedema and adipocyte metabolism, which suggests that modulation of AQP function or expression could have therapeutic potential in oedema, cancer, obesity, brain injury, glaucoma and several other conditions. Moreover, loss-of-function mutations in human AQPs cause congenital cataracts (AQP0) and nephrogenic diabetes insipidus (AQP2), and autoantibodies against AQP4 cause the autoimmune demyelinating disease neuromyelitis optica. Although some potential AQP modulators have been identified, challenges associated with the development of better modulators include the druggability of the target and the suitability of the assay methods used to identify modulators

Activation of STAT signaling pathways and induction of suppressors of cytokine signaling (SOCS) proteins in mammalian lens by growth factors

PURPOSE. This study was conducted to examine whether the effects of growth factors are mediated in the lens by Janus kinase/signal transducers and activators of transcription (JAK/ STAT) pathways and whether they induce expression of suppressors of cytokine signaling (SOCS), a novel family of feedback regulators of cytokine and growth factor activities. METHODS. STAT activation and SOCS expression were analyzed in transgenic or wild-type mouse lens and lens epithelial cells stimulated with growth factors by immunohistochemistry, RT-PCR, Northern, Western, proliferation, or transient reporter assays. RESULTS. STATs were constitutively expressed at low levels and activated by insulin-like growth factor (IGF)-1, platelet-derived growth factor (PDGF)-aa, and FGF-1 or -2 in the lens. The Intensity of STAT signaling increased at high FGF-2 concentration and FGFs act in synergy with IGF-1 or PDGFaa to enhance STAT signaling and SOCS expression. Growth factor-induced proliferation of lens cells is inhibited by AG-490, a specific inhibitor of JAK2/STAT3. CONCLUSIONS. This is the first report that FGFs activate STAT pathways in the lens and that SOCS proteins are constitutively expressed and upregulated by growth factors in this tissue. Physiological relevance of STAT pathways in the lens is underscored by inhibition of lens cell proliferation by inhibitors of JAK/STAT pathways and by the aberrant proliferation of lens epithelium in the posterior pole of transgenic mice with constitutively activated STAT1 in the lens. Common activation of STAT pathways by FGF-1, FGF-2, IGF-1, or PDGFaa and their synergistic activation of STATs and SOCS in lens cells suggest that activities and crosstalk between these factors are sensitive to the steady state levels of activated STATs in the lens and may be under feedback regulation by SOCS family proteins. (Invest Ophthalmol Vis Sci

Tumor Growth Suppressive Effect of IL-4 Through p21-Mediated Activation of STAT6 in IL-4Rα Overexpressed Melanoma Models

To evaluate the significance of interleukin 4 (IL-4) in tumor development, we compared B16F10 melanoma growth in IL-4-overespressing transgenic mice (IL-4 mice) and non-transgenic mice. In IL-4 mice, reduced tumor volume and weight were observed when compared with those of non-transgenic mice. Significant activation of DNA binding activity of STAT6, phosphorylation of STAT6 as well as IL-4, IL-4Rα and p21 expression were found in the tumor tissues of IL-4 mice compared to non-transgenic mice. Higher expression of IL-4, STAT6 and p21 in human melanoma tissue compared to normal human skin tissue was also found. Higher expression of apoptotic protein such as cleaved caspase-3, cleaved caspase-8, cleaved caspase-9, Bax, p53 and p21, but lower expression levels of survival protein such as Bcl-2 were found in the tumor of IL-4 mice. In vitro study, we found that overexpression of IL-4 significantly inhibited SK-MEL-28 human melanoma cell and B16F10 murine melanoma cell growth via p21-mediated activation of STAT6 pathway as well as increased expression of apoptotic cell death proteins. Moreover, p21 knockdown with siRNA abolished IL-4 induced activation of STAT6 and expression of p53 and p21 accompanied with reduced IL-4 expression as well as melanoma cell growth inhibition. Therefore, these results showed that IL-4 overexpression suppressed tumor development through p21-mediated activation of STAT6 pathways in melanoma models

The Arg233Lys AQP0 Mutation Disturbs Aquaporin0-Calmodulin Interaction Causing Polymorphic Congenital Cataract

Calmodulin (CaM) directly interacts with the aquaporin 0 (AQP0) C-terminus in a calcium dependent manner to regulate the water permeability of AQP0. We previously identified a missense mutation (p.R233K) in the putative CaM binding domain of AQP0 C-terminus in a congenital cataract family. This study was aimed at exploring the potential pathogenesis of this mutation causative of cataract and mainly identifying how it influenced the binding of AQP0 to CaM. Wild type and R233K mutant AQP0 with EGFP-tag were transfected separately into Hela cells to determine the expression and subcellular localizations. The co-immunoprecipitation (CoIP) assay was used to detect the interaction between AQP0 and CaM. AQP0 C-terminus peptides were synthesized with and without R233K, and the binding abilities of these peptides to CaM were assessed using a fluorescence binding assay. Localizations of wild type and R233K mutant AQP0 were determined from EGFP fluorescence, and the chimeric proteins were both localized abundantly in the plasma membrane. Protein expression levels of the culture cells showed no significant difference between them. The results from CoIP assay implied that R233K mutant presented more weakly in association with CaM than wild type AQP0. The AQP0 C-terminal mutant peptide was found to have 2.5-fold lower binding affinity to CaM than wild type peptide. These results suggested that R233K mutation did not affect the expression, location and trafficking of the protein but did influence the interaction between AQP0 and CaM. The binding affinity of AQP0 C-terminus to CaM was significantly reduced. Due to lack of the modulation of the Ca2+-calmodulin complex, the water permeability of AQP0 was subsequently augmented, which might lead to the development of this cataract

MIP/Aquaporin 0 Represents a Direct Transcriptional Target of PITX3 in the Developing Lens

The PITX3 bicoid-type homeodomain transcription factor plays an important role in lens development in vertebrates. PITX3 deficiency results in a spectrum of phenotypes from isolated cataracts to microphthalmia in humans, and lens degeneration in mice and zebrafish. While identification of downstream targets of PITX3 is vital for understanding the mechanisms of normal ocular development and human disease, these targets remain largely unknown. To isolate genes that are directly regulated by PITX3, we performed a search for genomic sequences that contain evolutionarily conserved bicoid/PITX3 binding sites and are located in the proximity of known genes. Two bicoid sites that are conserved from zebrafish to human were identified within the human promoter of the major intrinsic protein of lens fiber, MIP/AQP0. MIP/AQP0 deficiency was previously shown to be associated with lens defects in humans and mice. We demonstrate by both chromatin immunoprecipitation and electrophoretic mobility shift assay that PITX3 binds to MIP/AQP0 promoter region in vivo and is able to interact with both bicoid sites in vitro. In addition, we show that wild-type PITX3 is able to activate the MIP/AQP0 promoter via interaction with the proximal bicoid site in cotransfection experiments and that the introduction of mutations disrupting binding to this site abolishes this activation. Furthermore, mutant forms of PITX3 fail to produce the same levels of transactivation as wild-type when cotransfected with the MIP/AQP0 reporter. Finally, knockdown of pitx3 in zebrafish affects formation of a DNA-protein complex associated with mip1 promoter sequences; and examination of expression in pitx3 morphant and control zebrafish revealed a delay in and reduction of mip1 expression in pitx3-deficient embryos. Therefore, our data suggest that PITX3 is involved in direct regulation of MIP/AQP0 expression and that the alteration of MIP/AQP0 expression is likely to contribute to the lens phenotype in cataract patients with PITX3 mutations

Propiedades de las mitocondrias de cerebro de rata durante la maduración postnatal : Efecto del hipotiroidismo

En el presente trabajo se estudiaron las características bioquímicas de las mitocondrias de cerebro de rata durante la maduración postnatal y el efecto de la tiroideotomía neonatal sobre las mismas. Para ello primero se debió obtener una preparación de mitocondrias de cerebro de rata en satisfactorio estado de pureza, lo que se logró utilizando el método de Løvtrup y Zelander para su obtención. Las mitocondrias así obtenidas se encontraban en la conformación condensada y presentaban valores satisfactorios de P/O y C.R. con diversos sustratos oxidables. Maduración Se estudió el período de maduración comprendido entre los 5 y 30 días de vida postnatal. El contenido proteico de las mitocondrias purificadas, en base al peso de tejido fresco original, aumentó aproximadamente 4 veces entre los 5 y 30 días de edad. La actividad de SDH, expresada en base al peso de tejido fresco original, presentó un aumento de aproximadamente 5 veces entre los 5 y 30 días; mientras que la actividad específica de la misma se duplicó durante este período. Se estudió la fosforilación oxidativa utilizando piruvato+L—malato y succinato como sustratos oxidables. Con piruvato+L—malato se observó un aumento de 3 veces, tanto en el consumo de oxígeno como en el de fosfato inorgánico, entre los 5 y 30 días de edad; con succi­nato el aumento observado en ambos parámetros fué de 2 veces. Tanto los valores de P/O como los de C.R. obtenidos con ambos sustratos fueron satisfactorios desde los 5 días y permanecieron constantes durante todo el período estudiado. Esto sugiere que tanto los sistemas involucrados en el transporte de electrones como en la síntesis de ATP aumentan paralelamente y se mantienen en un óptimo grado de acoplamiento durante el período de maduración postnatal. La concentración de ubiquinona/mg de proteína mitocondrial aumentó aproximadamente 2 veces entre los 5 y 30 días de edad, produciéndose el aumento más importante entre el 10mo y 20mo día. Los niveles de los citocromos/mg de proteína mitocondrial aumentaron aproximadamente 2 veces entre los 5 y 30 días de vida postnatal. Los citocromos c+c1 y a presentaron los aumentos más importantes entre los 1O y 20 días; mientras que el citocromo b aumentó significativamente entre los 15 y 20 días de edad. El aumento de la concentración de los componentes de la cadena respiratoria permite postular un aumento de la superficie de la membrana interna de la mitocondria cerebral durante la maduración postnatal. Los resultados obtenidos, que indican que los diferentes parámetros estudiados no aumentan paralelamente, sugieren que la composición de la membrana interna de la mitocondria cerebral varía durante la maduración. Por lo tanto, el aumento observado en el metabolismo oxidativo de las mitocondrias cerebrales durante la maduración se debería a los cambios que ocurren en la composición de estos organoides, los que alcanzarían las características del animal adulto a los 20 días de vida postnatal. Hipotiroidismo Se estudió la fosforilación oxidativa en mitocondrias de cerebro de ratas normales y radiotiroidectomizadas en el momento del nacimiento, a los 30 días de edad. Cuando se utilizó piruvato+L-malato como sustrato se observó una disminución del 17 % aproximadamente, tanto en el consumo de oxígeno como en el de fosfato inorgánico, en las preparaciones provenientes de las ratas cretinas. Utilizando succinato como sustrato se obtuvieron los mismos valores de consumo de oxígeno y de fosfato inorgánico en las ratas normales y en las hipotiroideas. Con los dos sustratos utilizados no se observaron alteraciones ni en el P/O ni en el C.R. La actividad específica de SDH no fué modificada por efecto de la tiroidectomía neonatal. Según estos resultados no se producirían alteraciones fundamentales en la composición de las mitocondrias cerebrales por efecto de la tiroidectomía neonatal. Se discute, en relación con diversos resultados, la hipótesis según la cual la falta de hormona tiroidea desde el nacimiento produciría una disminución en la síntesis de proteínas, que se reflejaría en una disminuída síntesis de las diferentes membranas. Por lo tanto, esto traería como consecuencia, una disminución en el número de las mitocondrias cerebrales, sin que se produzcan alteraciones fundamentales en la composición de las mismas.Fil: Chepelinsky, Ana Berta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina