A novel adenovirus vector for easy cloning in the E3 region downstream of the CMV promoter

The construction of expression vectors derived from the human adenovirus type 5 (Ad5), usually based on homologous recombination, is time consuming as a shuttle plasmid has to be selected before recombination with the viral genome. Here, we describe a method allowing direct cloning of a transgene in the E3 region of the Ad5 genome already containing the immediate early CMV promoter upstream of three unique restriction sites. This allowed the construction of recombinant adenoviral genomes in just one step, reducing considerably the time of selection and, of course, production of the corresponding vectors. Using this vector, we produced recombinant adenoviruses, each giving high-level expression of the transgene in the transduced cells

Cervical cancer,E6 oncoprotein of human papillomavirus 16 and adenovirus targeting

Deuxième cause de mortalité par cancer chez la femme, les carcinomes du col utérin sont associés dans 99 % des cas à une infection par un virus à ADN : le virus du papillome humain (HPV de type 16 et 18 essentiellement). L'effet oncogène des HPV est principalement provoqué par l'intégration des gènes codant deux oncoprotéines virales, E6 et E7, dans le génome de la cellule infectée. Trois axes de recherche principaux ont été explorés lors de mon doctorat. Leur but était : (i) déterminer l'activité biologique de mutants de l'oncoprotéine E6 d'HPV de type 16 (16E6) afin d'établir les relations entre structure et fonctions au niveau cellulaire, (ii) développer des ligands biologiques (scFvs) capables d'inhiber 16E6 dans un contexte cellulaire (iii) générer des vecteurs recombinants ciblant de manière préférentielle les cellules cancéreuses transformées par HPV. Au cours de ce travail nous avons, par des études fonctionnelles, montré que l'auto-association du domaine N-terminal de 16E6 n est pas nécessaire à la dégradation de p53 in vitro et dans les cellules C33A. De plus, cette dégradation peut se faire de manière indépendante de l'ubiquitine ligase E6AP. Nous avons également montré que des fragments d'anticorps (scFvs) interagissant avec l'extrémité N-terminale de 16E6 bloquent la dégradation de p53 in vitro et induisent une mort cellulaire spécifique des cellules HPV positives. Parallèlement à ce projet, nous avons produit des vecteurs adénoviraux pseudotypés ciblant de manière préférentielle les cellules HPV positives. Le développement de mutants de 16E6 inhibant les activités de l'oncoprotéine ainsi que de scFvs anti-16E6 pourrait conduire à l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de détruire de manière ciblée les cellules tumorales du col de l'utérus.Second cause of mortality per cancer for woman worldwide, cervical cancer is mostly caused by infection with high-risk group of HPV (HPV 16 and 18). The major mechanisms through which HPV contributes to neoplastic initiation and progression include the activity of 2 viral oncoproteins, E6 and E7, which interfere with critical cell cycle tumor suppressive proteins, p53 and retinoblastoma (Rb) protein. Three main research axles were explored in the course of my PhD. There goal are : (i) to identified the biological activities of E6 mutants in order to establish structural- function relation in cellular (ii) to design a strategy for neutralizing 16E6 based the intracellular expression of single-chain Fv antibodies specific to 16E6 (iii) to develop adenovirus targeting vectors specific of HPV transformed cell lines. In this work we demonstrated that the self association of 16E6 isn t necessary for the degradation of p53 in vitro and can occur without the liaison to the E6AP protein. We have also demonstrated that the expression of the scFvs provokes two effets notably apoptosis. At the same time, we have developed specific targeting adenoviruses. These modified adenoviruses were shown to preferentially transduce HPV transformed cell lines

英国二次資料展の開催

Deuxième cause de mortalité par cancer chez la femme, les carcinomes du col utérin sont associés dans 99 % des cas à une infection par un virus à ADN : le virus du papillome humain (HPV de type 16 et 18 essentiellement). L’effet oncogène des HPV est principalement provoqué par l’intégration des gènes codant deux oncoprotéines virales, E6 et E7, dans le génome de la cellule infectée. Trois axes de recherche principaux ont été explorés lors de mon doctorat. Leur but était : (i) déterminer l’activité biologique de mutants de l’oncoprotéine E6 d’HPV de type 16 (16E6) afin d’établir les relations entre structure et fonctions au niveau cellulaire, (ii) développer des ligands biologiques (scFvs) capables d’inhiber 16E6 dans un contexte cellulaire (iii) générer des vecteurs recombinants ciblant de manière préférentielle les cellules cancéreuses transformées par HPV. Au cours de ce travail nous avons, par des études fonctionnelles, montré que l’auto-association du domaine N-terminal de 16E6 n’est pas nécessaire à la dégradation de p53 in vitro et dans les cellules C33A. De plus, cette dégradation peut se faire de manière indépendante de l’ubiquitine ligase E6AP. Nous avons également montré que des fragments d’anticorps (scFvs) interagissant avec l’extrémité N-terminale de 16E6 bloquent la dégradation de p53 in vitro et induisent une mort cellulaire spécifique des cellules HPV positives. Parallèlement à ce projet, nous avons produit des vecteurs adénoviraux pseudotypés ciblant de manière préférentielle les cellules HPV positives. Le développement de mutants de 16E6 inhibant les activités de l’oncoprotéine ainsi que de scFvs anti-16E6 pourrait conduire à l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de détruire de manière ciblée les cellules tumorales du col de l’utérus.Second cause of mortality per cancer for woman worldwide, cervical cancer is mostly caused by infection with high-risk group of HPV (HPV 16 and 18). The major mechanisms through which HPV contributes to neoplastic initiation and progression include the activity of 2 viral oncoproteins, E6 and E7, which interfere with critical cell cycle tumor suppressive proteins, p53 and retinoblastoma (Rb) protein. Three main research axles were explored in the course of my PhD. There goal are : (i) to identified the biological activities of E6 mutants in order to establish structural- function relation in cellular (ii) to design a strategy for neutralizing 16E6 based the intracellular expression of single-chain Fv antibodies specific to 16E6 (iii) to develop adenovirus targeting vectors specific of HPV transformed cell lines. In this work we demonstrated that the self association of 16E6 isn’t necessary for the degradation of p53 in vitro and can occur without the liaison to the E6AP protein. We have also demonstrated that the expression of the scFvs provokes two effets notably apoptosis. At the same time, we have developed specific targeting adenoviruses. These modified adenoviruses were shown to preferentially transduce HPV transformed cell lines

Competition between hydrogen and deuterium abstraction by methyl radicals in isotopomerically mixed methanol glasses

Rate parameters are reported for hydrogen and deuterium abstraction of methyl radicals embedded in glassy mixtures of CH3OH and CD 3OD. The mole fraction of CH3OH in these isotopomeric mixtures is 0, 0.05, 0.075, 0.10, 0.15, or 1. The nonexponential time dependence of the radical concentration is analyzed in terms of distributions of first-order rate constants. For the isotopomerically pure matrices, lognormal distributions describe the decay satisfactorily. The large difference between characteristic H and D transfer rate constants indicates tunneling. In the mixtures, there is competition between H and D abstraction processes which depends on the local structure about a radical, so that the corresponding rate parameters contain information about this structure. On the basis of earlier work [J. Chem. Phys. 86, 6622 (1987)], the analysis begins with the assumption that the structure about a radical resembles one of the crystalline phases of methanol. The entire set of decay curves is described by a (disordered) \u3b2-phase structure in which the radical replaces a methanol molecule and is located near the position associated with a methyl group. However, this static picture is inadequate because the radical can diffuse through the glass on the time scale of the kinetic measurements. Diffusion allows the radical to encounter more CH3OH molecules than would be expected for the static structure on a statistical basis - the effective mole fraction of CH 3OH in the mixtures is higher than the analytical concentration. For the xH=0.05 mixture, we estimate that on the average the radical encounters approximately 26 methanol molecules before abstraction occurs. This corresponds to diffusion over roughly 1100 pm through the lattice. \ua9 1993 American Institute of Physics.Peer reviewed: YesNRC publication: Ye