Inestabilidad genética y cambios en la cromatina en mutantes del complejo THO en mitosis y meiosis de eucariotas modelo

Para el mantenimiento y el control de los procesos celulares, la integridad genética es un factor clave. Mutaciones o factores que alteren este control, conllevan a la inestabilidad del genoma, provocando defectos tanto a nivel celular como a nivel de organismo (Aguilera y Gómez-Gonzalez, 2008). Uno de los mecanismos clave para la integridad genética es la Transcripción, cuyos errores generan un incremento en las tasas de recombinación así como de mutación. THO es un complejo nuclear formado por 5 subunidades (Hpr1, Tho2, Mft1, Thp1, Tex1) que funcionan como una unidad estructural y funcional, juegando un papel clave en la biogénesis de las ribonucleopartículas, con una función principal llevada a cabo en la interfase entre la transcripción y el transporte del ARN mensajero (Strasser et al., 2002). El complejo THO se encuentra altamente conservado en eucariotas, aunque aún no había sido descrito en el nematodo C. elegans. En esta tesis hemos caracterizado una de las proteínas constituyentes del complejo THO en C.elegans, THOC-2, que posee un alto porcentaje de similaridad con Tho2 de levaduras y THOC-2 de humanos. Hemos observado que el complejo THO se encuentra conservado en el nematodo, siendo esencial para su desarrollo. Los mutantes THO son estériles, pero gracias a la contribución materna de ARNm mensajero en la descendencia, los nematodos mutantes THO llegan a desarrollarse hasta adultos, permitiendo estudiar la carencia de dicho complejo en tejidos adultos. Los mutantes THO, además de mostrar defectos en el desarrollo de la etapa adulta, muestra defectos en tejidos como la vulva o gónada. Estos tejidos son los únicos que continúan desarrollándose en el individuo adulto y requieren de una alta coordinación de la división celular, además de una alta tasa de división. Más concretamente, al estudiar el extremo distal de la línea germinal de C. elegans, donde los núcleos se dividen mitóticamente, hemos observado que la ausencia de un complejo THO funcional genera inestabilidad genética en mitosis y activa el checkpoint de replicación en dichos núcleos. Estos datos concuerdan con los resultados anteriormente publicados en levaduras (Gómez-Gónzalez et al., 2009)

Inestabilidad genética y cambios en la cromatina en mutantes del complejo Tho en mitosis y meiosis de eucariotas modelo

Trabajo realizado en el Departamento de Genética, Facultad de Biología, y en el Departamento de Biología Molecular, CABIMER, de la Universidad de Sevilla, para optar al grado de doctor en Biología por el licenciado Maikel Castellano Pozo.Para el mantenimiento y el control de los procesos celulares, la integridad genética es un factor clave. Mutaciones o factores que alteren este control, conllevan a la inestabilidad del genoma, provocando defectos tanto a nivel celular como a nivel de organismo (Aguilera y Gómez-Gonzalez, 2008). Uno de los mecanismos clave para la integridad genética es la Transcripción, cuyos errores generan un incremento en las tasas de recombinación así como de mutación. THO es un complejo nuclear formado por 5 subunidades (Hpr1, Tho2, Mft1, Thp1, Tex1) que funcionan como una unidad estructural y funcional, juegando un papel clave en la biogénesis de las ribonucleopartículas, con una función principal llevada a cabo en la interfase entre la transcripción y el transporte del ARN mensajero (Strasser et al., 2002). El complejo THO se encuentra altamente conservado en eucariotas, aunque aún no había sido descrito en el nematodo C. elegans. En esta tesis hemos caracterizado una de las proteínas constituyentes del complejo THO en C.elegans, THOC-2, que posee un alto porcentaje de similaridad con Tho2 de levaduras y THOC-2 de humanos. Hemos observado que el complejo THO se encuentra conservado en el nematodo, siendo esencial para su desarrollo. Los mutantes THO son estériles, pero gracias a la contribución materna de ARNm mensajero en la descendencia, los nematodos mutantes THO llegan a desarrollarse hasta adultos, permitiendo estudiar la carencia de dicho complejo en tejidos adultos. Los mutantes THO, además de mostrar defectos en el desarrollo de la etapa adulta, muestra defectos en tejidos como la vulva o gónada. Estos tejidos son los únicos que continúan desarrollándose en el individuo adulto y requieren de una alta coordinación de la división celular, además de una alta tasa de división. Más concretamente, al estudiar el extremo distal de la línea germinal de C. elegans, donde los núcleos se dividen mitóticamente, hemos observado que la ausencia de un complejo THO funcional genera inestabilidad genética en mitosis y activa el checkpoint de replicación en dichos núcleos. Estos datos concuerdan con los resultados anteriormente publicados en levaduras (Gómez-Gónzalez et al., 2009).La esterilidad de los mutantes THO en C.elegans, hizo que pensaramos en un posible papel de THO en el mantenimiento de la estabilidad genética durante meiosis. A través de la meiosis se generan los gametos o células sexuales, por lo que su correcto funcionamiento es vital para el mantenimiento del genoma a lo largo de generaciones. En la gónada del nematodo existe un punto de transición donde se produce la inducción de la meiosis. En los mutantes thoc-2, la meiosis no se llega a finalizar, lo cual explica el fenotipo de esterilidad. Para el correcto transcurso de la meiosis es necesario la producción de roturas de doble cadena del ADN (DSBs), dependientes de la endonucleasa SPO-11, necesarios para la formación de los quiasmas meióticos. En los mutantes thoc-2, hemos observado un incremento de DSBs independientes de SPO-11. Estos DSBs no llegan a ser reparados, dando como resultado un incremento de 4-5 veces de los niveles de cuerpos apoptóticos debido a la activación del control de ciclo celular. Para ver si estos fenotipos estaban conservados en otros organismos, extendimos nuestros análisis a la levadura S. cerevisiae, con los mutantes hpr1¿ de THO. Igualmente, se observaron marcadores de daño en el ADN, que dieron lugar a la activación del checkpoint mediado por Rad53, proteína que controla la respuesta a daños externos durante meiosis, que derivaba a un descenso en la viabilidad de las esporas. Específicamente se observó que la pre-replicación meiótica era defectuosa en ambos organismos, existiendo retrasos en el transcurso de dicha fase y afectando al resto del ciclo meiótico. Uno de los intermediarios descritos como responsables de la inestabilidad genética asociada a transcripción de los mutantes THO es la estructura denominada R-loop. Los R-loops se forman co-transcripcionalmente justo detrás del paso de la RNPII, entre el ARN mensajero naciente y la hebra molde de ADN, desplazando la hebra no molde de ADN como cadena sencilla (Aguilera y García-Muse, 2012). La mutación de cualquier subunidad del complejo THO impide que la ribonucleopartícula se ensamble correctamente, quedando el ARN mensajero naciente desnudo, lo cual permite que pueda aparear con la hebra de ADN transcrita y forme estructuras en R-loops. Varios estudios han demostrado el impacto que la formación de estructuras R-loops tienen en la inestabilidad genética durante mitosis (Huertas and Aguilera, 2003; Li and Manley, 2005).A través de la microinyección o sobreexpresión, en nematodos y levaduras respectivamente, de la enzima ARNasa H, que degrada específicamente el ARN de los híbridos ADN:ARN, observamos que la presencia de R-loops es parcialmente responsable de los defectos en la replicación meiótica, ya que se suprimieron parcialmente el retraso de la pre-replicación meiótica y activación del checkpoint celular en los mutantes THO. Durante la transcripción, la estructura de la cromatina supone un obstáculo para la RNPII. Existen modificaciones post-traduccionales de las histonas, constituyentes de los nucleosomas, que están asociadas con una transcripción activa, facilitando el paso de la RNPII. En mutantes del complejo THO, hemos visto que estas modificaciones no se encuentran alteradas. Por el contrario, existen modificaciones asociadas a genes o regiones inactivas, denominadas heterocromatina que dificultan la transcripción. Entre ellas, se encuentra la H3K9me2 o H3S10P. Las mutaciones de THO aumentan los niveles de cromatina inactiva y de condensación cromosómica. Especialmente llamativo fue el aumento de la fosforilación del residuo H3S10 durante mitosis y meiosis en levaduras, C. elegans o humanos. Esta fosforilación tambien tiene un papel en transcripción en interfase y sinergístico con las distintas acetilaciones que facilitan la transcripción. Su implicación en la condensación de la cromatina está relacionada con la segregación de los cromosomas (Hsu et al., 2000; Wei et al., 1999). Para estudiar si este fenómeno tiene algún efecto en la inestabilidad genética descrita para THO, hemos usado dos mutantes de la histona H3 donde la Serina10 ha sido sustituida por aspártico (H3S10D), mimético con el estado fosforilado de la serina y la sustitución por alanina (H3S10A), que no puede ser fosforilada, así como los dobles mutantes con hpr1¿. Dicha fosfrilación tiene un papel en el mantenimiento de la estabilidad genética, ya que la desregulación de la fosforilación de H3S10 genera inestabilidad genética, de manera independiente a su estado de fosforilación, al igual que es esencial en el mantenimiento de la estabilidad genética en un fondo mutante THO, suprimiéndose los fenotipos de hiper-recombinación de ambos mutantes H3S10 hpr1¿ respecto al mutante simple hpr1¿, así como la activación del checkpoint celular. Al analizar la distribución de la señal H3S10P a lo largo del genoma, se observó que ésta se encuentra asociada principalmente a centrómeros, regiones pericentroméricas y regiones transcritas. Además, el incremento de los niveles de H3S10P está ligado a la acumulación de R-loops en dichas zonas, ya que el mutante separador de función hpr1-101, que posee los defectos en elongación de la transcripción celular de hpr1¿ pero que no llega a formar estructuras R-loops, muestra un perfil silvestre de la fosforilación. Acorde con el papel en la condensación de la cromatina descrito para H3S10P, los mutantes THO muestran un incremento de los niveles de condensación del ADN. Por tanto, nuestro trabajo sugiere por primera vez un papel activo de los R-loops en la estructura de la cromatina que dan lugar a una condensación de la misma y una heterocromatinización, contribuyendo al silenciamiento transcripcional y a los defectos en la progresión de las horquillas de replicación como fuente de fragilidad cromosómica e inestabilidad genética previamente descritos.Peer Reviewe

PiwiRNA-651 as marker of treatment response and survival in classical Hodgkin lymphoma.

PiwiRNAs, small non-coding RNAs processed by Piwi proteins, are involved in maintaining genome stability in germline cells. Recently, piwiRNA expression has been identified in some tumors. We have examined the potential reactivation of the Piwi/piwiRNA pathway in classical Hodgkin lymphoma (cHL). We found that Piwi proteins and three selected piwiRNAs, including piR-651, were expressed in cHL patients and cell lines, indicating that the Piwi/piwiRNA pathway is active in cHL. Interestingly, low levels of piR-651 were associated with lack of complete response to first-line treatment, as well as shorter disease-free and overall survival in a cohort of 94 cHL patients. At diagnosis, piR-651 was underexpressed in cHL serum samples compared to healthy controls, while after complete remission, piR-651 levels increased to levels similar to healthy controls. This is the first evidence that piwiRNAs are active in tumor and serum samples and impact prognosis in cHL

Proline-specific aminopeptidase P prevents replication-associated genome instability

Genotoxic stress during DNA replication constitutes a serious threat to genome integrity and causes human diseases. Defects at different steps of DNA metabolism are known to induce replication stress, but the contribution of other aspects of cellular metabolism is less understood. We show that aminopeptidase P (APP1), a metalloprotease involved in the catabolism of peptides containing proline residues near their N-terminus, prevents replication-associated genome instability. Functional analysis of C. elegans mutants lacking APP-1 demonstrates that germ cells display replication defects including reduced proliferation, cell cycle arrest, and accumulation of mitotic DSBs. Despite these defects, app-1 mutants are competent in repairing DSBs induced by gamma irradiation, as well as SPO-11-dependent DSBs that initiate meiotic recombination. Moreover, in the absence of SPO-11, spontaneous DSBs arising in app-1 mutants are repaired as inter-homologue crossover events during meiosis, confirming that APP-1 is not required for homologous recombination. Thus, APP-1 prevents replication stress without having an apparent role in DSB repair. Depletion of APP1 (XPNPEP1) also causes DSB accumulation in mitotically-proliferating human cells, suggesting that APP1’s role in genome stability is evolutionarily conserved. Our findings uncover an unexpected role for APP1 in genome stability, suggesting functional connections between aminopeptidase-mediated protein catabolism and DNA replication

Early overnutrition sensitizes the growth hormone axis to the impact of diet-induced obesity via sex-divergent mechanisms

In addition to its essential role in the physiological control of longitudinal growth, growth-hormone (GH) is endowed with relevant metabolic functions, including anabolic actions in muscle, lipolysis in adipose-tissue and glycemic modulation. Adult obesity is known to negatively impact GH-axis, thereby promoting a vicious circle that may contribute to the exacerbation of the metabolic complications of overweight. Yet, to what extent early-overnutrition sensitizes the somatotropic-axis to the deleterious effects of obesity remains largely unexplored. Using a rat-model of sequential exposure to obesogenic insults, namely postnatal-overfeeding during lactation and high-fat diet (HFD) after weaning, we evaluated in both sexes the individual and combined impact of these nutritional challenges upon key elements of the somatotropic-axis. While feeding HFD per se had a modest impact on the adult GH-axis, early overnutrition had durable effects on key elements of the somatotropic-system, which were sexually different, with a significant inhibition of pituitary gene expression of GH-releasing hormone-receptor (GHRH-R) and somatostatin receptor-5 (SST5) in males, but an increase in pituitary GHRH-R, SST2, SST5, GH secretagogue-receptor (GHS-R) and ghrelin expression in females. Notably, early-overnutrition sensitized the GH-axis to the deleterious impact of HFD, with a significant suppression of pituitary GH expression in both sexes and lowering of circulating GH levels in females. Yet, despite their similar metabolic perturbations, males and females displayed rather distinct alterations of key somatotropic-regulators/ mediators. Our data document a synergistic effect of postnatal-overnutrition on the detrimental impact of HFD-induced obesity on key elements of the adult GH-axis, which is conducted via mechanisms that are sexually-divergent

Impact of hospitalization on nutritional status in persons aged 65 years and over (NUTRIFRAG Study): Protocol for a prospective observational study

[ES] Background Malnutrition is a recurring problem that has become more relevant in recent years. The aim of this study is to assess the risk of malnutrition and nutritional status on admission and its evolution until discharge in patients aged 65 and over admitted to medical and surgical hospitalization units in hospitals of the Spanish National Health System. Methods Prospective observational study to be carried out in the medical-surgical hospitalization units of 9 public hospitals between 01/09/2022 and 31/12/2024. Using consecutive sampling, a total of 4077 patients will be included (453 in each hospital). Variables included are related to the care process, functionality, cognition and comorbidity, risk profile, nutritional status and dysphagia; as well as frailty, dietary quality and contextual variables. The incidence of risk of malnutrition, undernutrition and dysphagia during the care process and at discharge will be calculated. The association with risk factors will be studied with logistic regression models and multivariate Cox regression models. In addition, an analysis of participants’ satisfaction with food services will be carried out. The study was approved by the Ethics and Research Committee on 30/09/2020, approved for funding on 02/12/2021 and with registration number RBR-5jnbyhk in the Brazilian clinical trials database (ReBEC) for observational studies. Discussion Some studies address nutritional status or dysphagia in older people in various care settings. However, there is a lack of large sample studies including both processes of the impact of hospitalization. The results of the project will provide information on the incidence and prevalence of both pathologies in the study subjects, their associated factors and their relationship with the average length of stay, mortality and early readmission. In addition, early detection of a problem such as malnutrition related to the disease and/or dysphagia during a hospital stay will favor the action of professionals to resolve both pathologies and improve the health status of patients.This study has been funded by Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) through the Project "PI21/00738" and co-funded by the European Union. The funders did not and will not have a role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript

Impact of hospitalization on nutritional status in persons aged 65 years and over (NUTRIFRAG Study): Protocol for a prospective observational study

Background: Malnutrition is a recurring problem that has become more relevant in recent years. The aim of this study is to assess the risk of malnutrition and nutritional status on admission and its evolution until discharge in patients aged 65 and over admitted to medical and surgical hospitalization units in hospitals of the Spanish National Health System. Methods: Prospective observational study to be carried out in the medical-surgical hospitalization units of 9 public hospitals between 01/09/2022 and 31/12/2024. Using consecutive sampling, a total of 4077 patients will be included (453 in each hospital). Variables included are related to the care process, functionality, cognition and comorbidity, risk profile, nutritional status and dysphagia; as well as frailty, dietary quality and contextual variables. The incidence of risk of malnutrition, undernutrition and dysphagia during the care process and at discharge will be calculated. The association with risk factors will be studied with logistic regression models and multivariate Cox regression models. In addition, an analysis of participants' satisfaction with food services will be carried out. The study was approved by the Ethics and Research Committee on 30/09/2020, approved for funding on 02/12/2021 and with registration number RBR-5jnbyhk in the Brazilian clinical trials database (ReBEC) for observational studies. Discussion: Some studies address nutritional status or dysphagia in older people in various care settings. However, there is a lack of large sample studies including both processes of the impact of hospitalization. The results of the project will provide information on the incidence and prevalence of both pathologies in the study subjects, their associated factors and their relationship with the average length of stay, mortality and early readmission. In addition, early detection of a problem such as malnutrition related to the disease and/or dysphagia during a hospital stay will favor the action of professionals to resolve both pathologies and improve the health status of patients.This study has been funded by Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) through the project "PI21/00738" and co-funded by the European Union. The funders did not and will not have a role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.S

Pobreza en la ocupación e instrumentos de reacción

Unión Europea,Ministerio de Economía y Competitividad y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional DER2015-63701-C3-1-