Acclimation of biochemical and diffusive components of photosynthesis in rice, wheat and maize to heat and water deficit:implications for modeling photosynthesis

The impact of the combined effects of heat stress, increased vapor pressure deficit (VPD) and water deficit on the physiology of major crops needs to be better understood to help identify the expected negative consequences of climate change and heat waves on global agricultural productivity. To address this issue, rice, wheat and maize plants were grown under control temperature (CT, 25°C, VPD 1.8 kPa), and a high temperature (HT, 38°C, VPD 3.5 kPa), both under well-watered (WW) and water deficit (WD) conditions. Gas-exchange measurements showed that, in general, WD conditions affected the leaf conductance to CO2, while growth at HT had a more marked effect on the biochemistry of photosynthesis. When combined, HT and WD had an additive effect in limiting photosynthesis. The negative impacts of the imposed treatments on the processes governing leaf gas-exchange were species-dependent. Wheat presented a higher sensitivity while rice and maize showed a higher acclimation potential to increased temperature. Rubisco and PEPC kinetic constants determined in vitro at 25°C and 38°C were used to estimated Vcmax, Jmax and Vpmax in the modeling of C3 and C4 photosynthesis. The results here obtained reiterate the need to use species-specific and temperature-specific values for Rubisco and PEPC kinetic constants for a precise parameterization of the photosynthetic response to changing environmental conditions in different crop species

Positively selected amino acid replacements within the RuBisCO enzyme of oak trees are associated with ecological adaptations

Phylogenetic analysis by maximum likelihood (PAML) has become the standard approach to study positive selection at the molecular level, but other methods may provide complementary ways to identify amino acid replacements associated with particular conditions. Here, we compare results of the decision tree (DT) model method with ones of PAML using the key photosynthetic enzyme RuBisCO as a model system to study molecular adaptation to particular ecological conditions in oaks (Quercus). We sequenced the chloroplast rbcL gene encoding RuBisCO large subunit in 158 Quercus species, covering about a third of the global genus diversity. It has been hypothesized that RuBisCO has evolved differentially depending on the environmental conditions and leaf traits governing internal gas diffusion patterns. Here, we show, using PAML, that amino acid replacements at the residue positions 95, 145, 251, 262 and 328 of the RuBisCO large subunit have been the subject of positive selection along particular Quercus lineages associated with the leaf traits and climate characteristics. In parallel, the DT model identified amino acid replacements at sites 95, 219, 262 and 328 being associated with the leaf traits and climate characteristics, exhibiting partial overlap with the results obtained using PAML

Análisis de la variabilidad genética de Solanum habrochaites en su lugar de origen, un recurso infrautilizado para la mejora del tomate

En este trabajo se ha realizado un amplio estudio de la variabilidad genética y la estructura poblacional de la especie silvestre Solanum habrochaites (anteriormente conocida como Lycopersicon hirsutum) en todo su rango de distribución natural.Hermida Carrera, C. (2009). Análisis de la variabilidad genética de Solanum habrochaites en su lugar de origen, un recurso infrautilizado para la mejora del tomate. http://hdl.handle.net/10251/11922Archivo delegad

Exploring Rubisco molecular evolution and kinetics temperature dependency

Rubisco, the enzyme that catalyzes the assimilation of atmospheric CO2 and sustains the vast majority of food chains in the Biosphere, presents functional inefficiencies limiting the photosynthetic process. Rubisco is a slow enzyme and can not fully discriminate between CO2 and O2. When oxygen catalysis takes place, CO2 is released and energy is dissipated in the process of photorespiration. The existence of interspecific species variability in the catalytic properties of Rubisco suggests that this enzyme has been adapting to the prevailing environmental conditions, in particular to changes in CO2 concentration at the catalytic site and different thermal conditions. These findings offer new alternatives on genetic manipulation of Rubisco in order to overcome their inefficiencies and improve crop yields. However, the great structural and biochemical complexity of Rubisco is actually limiting a successful improvement. This is precisely the aim of this thesis: to expand the molecular and biochemical knowledge on the evolution of Rubisco to further understand and manipulate the enzyme. In this sense, the objectives of this thesis were: i) to investigate the genetic variability of Rubisco large subunit (L-subunit) and its evolution in different groups of plants, and ii) to explore the temperature dependence of Rubisco kinetic constants. Four experiments were done to answer these objectives. Experiments 1 and 2 shared a common pattern that consisted in selecting phylogenetically related species (174 species of Fagales in experiment 1, and 60 species of bromeliads and orchids in experiment 2) to describe Rubisco L-subunit sequence variability and to investigate the existence of positively selected sites related to particular environments and leaf traits. Experiments 3 and 4 were focused on the study of Rubisco kinetic response to temperature. Thus, experiment 3 consisted in a bibliographic compilation to study the thermal sensitivity of Rubisco turnover rate for carboxylation (kcat c). In experiment 4, the kinetic parameters of Rubisco and their response to temperature in 20 economically important crops were measured. In both experiments we modeled the effect of the observed kinetic variability on the ability of Rubisco to assimilate CO2 under different scenarios of CO2 concentration. Experiments 1 and 2 showed, first, that there was a great variability in Rubisco L-subunit in closely related species. Specifically, the 174 Fagales species were distributed into 29 haplotypes (groups of species with the same sequence), the 158 Quercus species in 21 haplotypes, and 19 haplotypes in orchids and 23 haplotypes in bromeliads. In all studied groups, the analysis showed that large part of this variability was determined by natural selection, corroborating the hypothesis of processes of adaptive change in Rubisco. Furthermore, in experiment 1, evidences of positive selection were found in terms of leaf habit and climate, both traits influencing the CO2 concentration at the site of carboxylation. This finding is a clear evidence that species adjust their Rubisco depending on the prevailing environmental conditions. By contrast, in experiment 2, positive selection processes could not be related to CAM photosynthetic mechanism. In any case, in all studied groups appeared co-evolving pairs of amino acid sites, located in important Rubisco regions for the functionality and structure of the enzyme. The implementation of a mathematical model of decision trees (DT) for sequence analysis permitted to relate sites variability to environmental and leaf traits. DT results corroborated, in part, observations of positive selection tests, thus validating the use of alternative models in the search for variable sites. Furthermore, in bromeliads and orchids, DT revealed a relation between sites variability and variables indicative of the degree of expression of CAM (δ13C and leaf thickness). In bromeliads and orchids interspecific variability in the catalytic constants of Rubisco was observed, part of which explained by the existence of carbon concentration mechanism in CAM plants. However, this catalytic variability could not be directly related to sites under positive selection or resolved by DT. In experiment 3, distinct kcatc photosynthetic response to temperature appeared among the studied groups. Thus, the highest and lowest activation energy (ΔHa) values for kcatc were observed in Rhodophyta and Chlorophyta, respectively. In terrestrial plants, C3 species from warm habitats and C4 species showed a higher ΔHa for kcatc than C3 plants from cold habitats. These results suggest that Rubisco evolved by adjusting the sensitivity of their kinetic properties to temperature indicating thermal adaptation to local conditions. In experiment 4, Rubisco kinetic parameters (Michaelis-Menten constant for CO2, specificity factor and kcatc) from the 20 studied crops showed interspecies variability at three temperatures of measurement (15, 25 and 35 °C). Variability in ΔHa of kinetic parameters was significant among all crop species and photosynthetic mechanisms. This variability could not be related to their domestication region climate, possibly due to subsequent processes of artificial selection. The use of measured values in mathematical models of photosynthesis quantified the importance of improving Rubisco in different crops at changing temperature and CO2 availability conditions. This thesis presents, under an evolutionary background, relevant information to improve Rubisco by bioengineering processes. The combined analysis of positive selection and coevolution are useful to elucidate interactions between amino acids that should be taken into account when designing better Rubiscos. In addition, the application of DT helps in the construction of relationships between the amino acid variability and the environment in which species evolve. Moreover, this thesis represents the most convincing evidence that Rubiscos of different species differ not only in catalytic constants at 25 °C, but also exhibit different response to temperature. The data published here offer the possibility to increase the accuracy of leaf photosynthesis models and addressed the need for improvement of Rubisco in species of high agricultural interest.La Rubisco, enzima que cataliza la asimilación de CO2 atmosférico y sustenta la inmensa mayoría de cadenas tróficas de la Biosfera, presenta ineficiencias que limitan el proceso fotosintético. La Rubisco es lenta y puede “confundirse” de sustrato catalizando la fijación de O2 en el proceso de fotorrespiración, que termina liberando CO2 y disipando energía. La existencia de variabilidad interespecífica en las características catalíticas de la Rubisco sugiere que esta enzima se ha sido adaptando a las condiciones ambientales reinantes, en particular, a cambios en la concentración de CO2 en el sitio de catálisis y a las diferentes condiciones térmicas. Estos hallazgos han renovado la esperanza de manipulación genética de la Rubisco con el objetivo de superar sus ineficiencias y mejorar el rendimiento de los cultivos. Sin embargo, el desconocimiento aún presente en aspectos derivados de la gran complejidad estructural y bioquímica de la Rubisco limita, hoy en día, el éxito de mejora. Éste es, precisamente, el enfoque de la presente tesis: ampliar el conocimiento de la evolución molecular y bioquímica de la Rubisco para avanzar en la comprensión y manipulación de la enzima con mayores garantías de éxito. En este sentido, los objetivos de esta tesis fueron: i) investigar la variabilidad genética de la subunidad grande de la Rubisco y su evolución en diferentes grupos de plantas, y ii) explorar la dependencia térmica de las constantes cinéticas de la Rubisco. Para dar respuesta a estos objetivos, se llevaron a cabo 4 experimentos. Los experimentos 1 y 2 presentaron un patrón común consistente en seleccionar especies próximas filogenéticamente (174 especies de Fagales en el experimento 1, y 60 especies de bromelias y orquídeas en el experimento 2) para descifrar la variabilidad en la secuencia de la subunidad grande de la Rubisco e investigar la existencia de sitios aminoacídicos seleccionados positivamente en función del ambiente y caracteres morfológicos y fisiológicos foliares. Los experimentos 3 y 4 se centraron en el estudio de la respuesta de la cinética de la Rubisco a la temperatura. Así, en el experimento 3 se llevó a cabo una compilación bibliográfica para el estudio de la sensibilidad térmica del número de recambio catalítico para la reacción de carboxilación de la Rubisco, kcat c (el parámetro cinético más ampliamente estudiado en todos los grupos fotosintéticos). En el experimento 4 se midieron los parámetros cinéticos de la Rubisco y su respuesta a la temperatura en 20 cultivos económicamente importantes. En ambos experimentos se modelizó el impacto de la variabilidad observada sobre la capacidad asimiladora de la Rubisco bajo diferentes escenarios de disponibilidad de CO2. Los resultados de los experimentos 1 y 2 mostraron, por primera vez, la existencia de una gran variabilidad en la secuencia de la subunidad grande de la Rubisco en especies próximas taxonómicamente. En concreto, las 174 especies estudiadas de Fagales se distribuyeron en 29 haplotipos (grupos de especies con la misma secuencia), 21 haplotipos en las 158 especies de Quercus, 19 haplotipos en orquídeas y 23 haplotipos en bromelias. En todos los grupos estudiados, los análisis demostraron que una parte importante de esta variabilidad había sido fijada por la selección natural, corroborando la hipótesis de la existencia de procesos de cambio adaptativo en la Rubisco. Además, en el experimento 1, se encontraron evidencias de selección positiva en función del hábito foliar y del clima, ambos caracteres determinantes de la concentración de CO2 en el sitio de carboxilación. Este hallazgo supone la primera prueba inequívoca de que las especies ajustan su Rubisco en función de las condiciones ambientales prevalentes. Por el contrario, en el experimento 2, los procesos de selección positiva no se relacionaron aparentemente con el mecanismo fotosintético CAM. En cualquier caso, en todos los grupos estudiados aparecieron pares de sitios aminoacídicos con tendencia a coevolucionar, la mayoría ubicados en regiones importantes para la función y estructura de la Rubisco. Se implementó, de forma pionera, el modelo matemático de árboles de decisión (DT) para el análisis de secuencias y su relación con variables externas. Los resultados del DT corroboraron, en parte, las observaciones de los análisis de selección positiva, validando de esta forma la aplicación de modelos alternativos en la búsqueda de sitios variables. Además, en bromelias y orquídeas, los DT revelaron la existencia de cambios aminoacídicos específicos en función de variables indicadoras del grado de expresión de CAM (δ13C y espesor de hoja). En bromelias y orquídeas se observó variabilidad interespecífica en las constantes catalíticas de la Rubisco, parte de la cual se explicó por la existencia de mecanismos de concentración de carbono en plantas CAM. No obstante, esta variabilidad catalítica no se relacionó directamente con los cambios aminoacídicos detectados por los DT o bajo selección positiva. En el experimento 3, la respuesta de kcat c a la temperatura mostró diferencias entre los grupos fotosintéticos estudiados. Así, los valores más altos y más bajos para la energía de activación (ΔHa) de kcat c se observaron en Rhodophyta y Chlorophyta, respectivamente. En las plantas terrestres, las especies C3 de hábitats cálidos y las especies C4 presentaron una ΔHa de kcat c mayor que las plantas C3 de hábitats fríos. Estos resultados sugieren que la Rubisco ha evolucionado ajustando la sensibilidad de sus propiedades cinéticas a la temperatura e indican adaptación a las condiciones térmicas locales. En el experimento 4, los parámetros cinéticos de la Rubisco (constante de Michaelis-Menten para el CO2, factor específico y kcat c ) de los 20 cultivos estudiados mostraron variabilidad interespecífica a las tres temperaturas de ensayo (15, 25 y 35 °C). La variabilidad en la ΔHa de los parámetros cinéticos fue significativa entre todas las especies de cultivo y tipos fotosintéticos, si bien dicha variabilidad no se relacionó con el clima en la región de domesticación, posiblemente debido a procesos posteriores de selección artificial. La aplicación de datos específicos en los modelos matemáticos de fotosíntesis cuantificó la importancia de mejora de la Rubisco en los diferentes cultivos según condiciones cambiantes de temperatura y disponibilidad de CO2. Bajo un trasfondo evolutivo, esta tesis presenta información relevante para procesos de bioingeniería direccionados a la mejora de la Rubisco. Los análisis combinados de selección positiva y coevolución resultan útiles para resolver interacciones entre aminoácidos que deberían tenerse en cuenta a la hora de diseñar mejores Rubiscos. Además, la aplicación de los DT ayuda a generar relaciones entre la variabilidad aminoacídica y el ambiente en el que evolucionan las especies. Por otra parte, esta tesis supone la evidencia más convincente de que Rubiscos de diferentes especies no sólo presentan diferencias en las constantes catalíticas a 25 ºC, sino que también presentan diferente respuesta al rango fisiológico de temperaturas. Los datos aquí publicados ofrecen la posibilidad de aumentar la precisión de los modelos de fotosíntesis en hoja, y direccionan la mejora de Rubisco en especies de alto interés agrícola.La Rubisco, l’enzim que catalitza l’assimilació del CO2 atmosfèric i sustenta la immensa majoria de cadenes tròfiques de la Biosfera, presenta ineficiències que limiten el procés fotosintètic. La Rubisco és lenta i es pot “confondre” de substrat, catalitzant la fixació d’O2 en el procés de fotorespiració, que acaba alliberant CO2 i dissipant energia. L’existència de variabilitat interespecífica en les característiques catalítiques de la Rubisco suggereix que aquest enzim ha anat adaptant-se a les condicions ambientals predominants, en particular, a canvis a la concentració de CO2 al lloc de catàlisi i a les diferents condicions tèrmiques. Aquests descobriments han renovat l’esperança de manipulació genètica de la Rubisco amb l’objectiu de superar les seves ineficiències i millorar així el rendiment dels cultius. No obstant, el desconeixement encara present a alguns aspectes derivats de la gran complexitat estructural de la Rubisco limita, avui en dia, l’èxit de millora. Aquest és precisament l’enfocament de la present tesi: ampliar el coneixement de l’evolució molecular i bioquímica de la Rubisco per avançar en la comprensió i manipulació de l’enzim, i així obtenir majors garanties d’èxit. En aquest sentit, els objectius d’aquesta tesi foren: 1) investigar la variabilitat genètica de la subunitat gran de la Rubisco i la seva evolució dins diferents grups de plantes, 2) explorar la dependència tèrmica de les constants cinètiques de la Rubisco. Per a poder donar resposta a aquests objectius, es varen dur a terme quatre experiments. Els experiments 1 i 2 presentaren un patró basat en la selecció d’espècies pròximes filogenèticament (174 espècies de Fagals en el experiment 1 i 60 espècies d’orquídies i bromèlies en el experiment 2) per tal de desxifrar la variabilitat en la seqüència de la subunitat gran de la Rubisco i investigar l’existència de llocs aminoacídics seleccionats positivament en funció de l’ambient i dels caràcters morfològics i fisiològics foliars. Els experiments 3 i 4 es varen centrar en l’estudi de la resposta de la cinètica de la Rubisco a la temperatura. Així, en el experiment 3 es va dur a terme una compilació bibliogràfica per a l’estudi de la sensibilitat tèrmica del nombre de recanvi catalític per a la reacció de carboxilació de la Rubisco, kcat c (el paràmetre cinètic més àmpliament estudiat en tots els grups fotosintètics). En el experiment 4 es varen mesurar els paràmetres cinètics de la Rubisco i la seva resposta a la temperatura dins 20 cultius econòmicament importants. En ambdós experiments es va modelitzar l’impacte de la variabilitat observada sobre la capacitat assimiladora de la Rubisco sota diferents escenaris de disponibilitat de CO2. Els resultats dels experiments 1 i 2 varen mostrar, per primer cop, l’existència d’una gran variabilitat dins la seqüència de la subunitat gran de la Rubisco a espècies pròximes taxonòmicament. En concret, les 174 espècies estudiades de Fagals es varen distribuir en 29 haplotips (grups d’espècies amb la mateixa seqüència), 21 haplotips dins les 158 espècies de Quercus, 19 haplotips dins orquídies i 23 haplotips dins les bromèlies. Dins tots els grups estudiats, les anàlisis demostraren que una part important d’aquesta variabilitat havia estat fixada per la selecció natural, corroborant la hipòtesi de l’existència de canvis adaptatius a la Rubisco. A més, en el experiment 1 es varen trobar evidències de selecció positiva en funció de l’habitat foliar i del clima, ambdós caràcters determinants de la concentració de CO2 en el lloc de carboxilació. Aquest descobriment suposa la primera prova inequívoca de que les espècies ajusten la Rubisco en funció de les condicions ambientals que predominen. Per el contrari, en el experiment 2 els processos de selecció positiva no es varen relacionar aparentment amb el mecanisme fotosintètic CAM. En qualsevol cas, dins tots els grups estudiats varen aparèixer parells de llocs aminoacídics amb tendència a coevolucionar, la majoria ubicats a llocs importants per a la funció i estructura de la Rubisco. Es va implementar de forma pionera el model matemàtic d’arbres de decisió (DT) per a l’anàlisi de seqüències i la seva relació amb variables externes. Els resultats del DT varen corroborar en part les observacions de les anàlisis de selecció positiva, validant així l’aplicació de models alternatius per a la recerca de llocs variables. A més, dins bromèlies i orquídies, els DT varen revelar la existència de canvis aminoacídics específics, en funció de variables indicadores d’expressió de CAM (δ13C i gruixa de fulla). Dins bromèlies i orquídies es va observar variabilitat interespecífica en les constants catalítiques de la Rubisco, part de la qual es va explicar per l’existència de mecanismes de concentració de carboni dins plantes CAM. No obstant, aquesta variabilitat catalítica no es va relacionar directament amb els canvis aminoacídics detectats mitjançant els DT o sota selecció positiva. En el experiment 3, la resposta de kcat c a la temperatura va mostrar diferències entre els grups fotosintètics estudiats. Així, els valors més alts i més baixos per a l’energia d’activació (ΔHa) de kcat c es varen observar a Rhodophyta i Chlorophyta, respectivament. A les plantes terrestres, les espècies C3 d’hàbitats càlids i les espècies C4 presentaren una ΔHa de kcat c major que les plantes C3 d’hàbitats freds. Aquests resultats suggereixen que la Rubisco ha evolucionat ajustant la sensibilitat de les seves propietats cinètiques a la temperatura i indiquen una adaptació a les condicions tèrmiques locals. En el experiment 4, els paràmetres cinètics de la Rubisco (constant de Michaelis-Menten per al CO2, factor específic i kcat c ) dels 20 cultius estudiats varen mostrar variabilitat interespecífica a les tres temperatures d’assaig (15, 25 i 35 °C). La variabilitat dins la ΔHa dels paràmetres cinètics va ser significativa entre totes les espècies de cultius i tipus fotosintètics, si bé aquesta variabilitat no es va relacionar amb el clima de la regió de domesticació, possiblement degut a processos posteriors de selecció artificial. L’aplicació de dades específiques en els models matemàtics de fotosíntesi va quantificar la importància de millora de la Rubisco en els diferents cultius segons condicions canviants de temperatura i disponibilitat de CO2. Sota un rerefons evolutiu, aquesta tesi presenta informació rellevant per a processos de bioenginyeria enfocats a la millora de la Rubisco. Les anàlisis combinades de selecció positiva i coevolució resulten útils per a resoldre interaccions entre aminoàcids que haurien de tenir-se en compte a l’hora de dissenyar millors Rubiscos. A més, l’aplicació dels DT ajuda a generar relacions entre la variabilitat aminoacídica i l’ambient en que evolucionen les espècies. Per altra banda, aquesta tesi suposa l’evidència més convincent de que Rubiscos de diferents espècies no només presenten diferències en les constants catalítiques a 25 °C, sinó que també presenten diferents respostes al rang fisiològic de temperatures. Les dades aquí publicades ofereixen la possibilitat d’augmentar la precisió dels models de fotosíntesi a nivell de fulla i marquen el camí per a la millora de la Rubisco dins les espècies d’alt interès agrícola

Exploring Rubisco molecular evolution and kinetics temperature dependency

[eng] - Introduction: Rubisco, the enzyme that catalyzes the assimilation of atmospheric CO2 and sustains the vast majority of food chains in the Biosphere, presents functional inefficiencies limiting the photosynthetic process. Rubisco is a slow enzyme and can not fully discriminate between CO2 and O2. When oxygen catalysis takes place, CO2 is released and energy is dissipated in the process of photorespiration. The existence of interspecific species variability in the catalytic properties of Rubisco suggests that this enzyme has been adapting to the prevailing environmental conditions, in particular to changes in CO2 concentration at the catalytic site and different thermal conditions. These findings offer new alternatives on genetic manipulation of Rubisco in order to overcome their inefficiencies and improve crop yields. However, the great structural and biochemical complexity of Rubisco is actually limiting a successful improvement. This is precisely the aim of this thesis: to expand the molecular and biochemical knowledge on the evolution of Rubisco to further understand and manipulate the enzyme. In this sense, the objectives of this thesis were: i) to investigate the genetic variability of Rubisco large subunit (L-subunit) and its evolution in different groups of plants, and ii) to explore the temperature dependence of Rubisco kinetic constants. - Contents: Four experiments were done to answer these objectives. Experiments 1 and 2 shared a common pattern that consisted in selecting phylogenetically related species (174 species of Fagales in experiment 1, and 60 species of bromeliads and orchids in experiment 2) to describe Rubisco L-subunit sequence variability and to investigate the existence of positively selected sites related to particular environments and leaf traits. Experiments 3 and 4 were focused on the study of Rubisco kinetic response to temperature. Thus, experiment 3 consisted in a bibliographic compilation to study the thermal sensitivity of Rubisco turnover rate for carboxylation (kcat c). In experiment 4, the kinetic parameters of Rubisco and their response to temperature in 20 economically important crops were measured. In both experiments we modeled the effect of the observed kinetic variability on the ability of Rubisco to assimilate CO2 under different scenarios of CO2 concentration. Experiments 1 and 2 showed, first, that there was a great variability in Rubisco L-subunit in closely related species. Specifically, the 174 Fagales species were distributed into 29 haplotypes (groups of species with the same sequence), the 158 Quercus species in 21 haplotypes, and 19 haplotypes in orchids and 23 haplotypes in bromeliads. In all studied groups, the analysis showed that large part of this variability was determined by natural selection, corroborating the hypothesis of processes of adaptive change in Rubisco. Furthermore, in experiment 1, evidences of positive selection were found in terms of leaf habit and climate, both traits influencing the CO2 concentration at the site of carboxylation. This finding is a clear evidence that species adjust their Rubisco depending on the prevailing environmental conditions. By contrast, in experiment 2, positive selection processes could not be related to CAM photosynthetic mechanism. In any case, in all studied groups appeared co-evolving pairs of amino acid sites, located in important Rubisco regions for the functionality and structure of the enzyme. The implementation of a mathematical model of decision trees (DT) for sequence analysis permitted to relate sites variability to environmental and leaf traits. DT results corroborated, in part, observations of positive selection tests, thus validating the use of alternative models in the search for variable sites. Furthermore, in bromeliads and orchids, DT revealed a relation between sites variability and variables indicative of the degree of expression of CAM (δ13C and leaf thickness). In bromeliads and orchids interspecific variability in the catalytic constants of Rubisco was observed, part of which explained by the existence of carbon concentration mechanism in CAM plants. However, this catalytic variability could not be directly related to sites under positive selection or resolved by DT. In experiment 3, distinct kcat c photosynthetic response to temperature appeared among the studied groups. Thus, the highest and lowest activation energy (ΔHa) values for kcat c were observed in Rhodophyta and Chlorophyta, respectively. In terrestrial plants, C3 species from warm habitats and C4 species showed a higher ΔHa for kcat c than C3 plants from cold habitats. These results suggest that Rubisco evolved by adjusting the sensitivity of their kinetic properties to temperature indicating thermal adaptation to local conditions. In experiment 4, Rubisco kinetic parameters (Michaelis-Menten constant for CO2, specificity factor and kcat c) from the 20 studied crops showed interspecies variability at three temperatures of measurement (15, 25 and 35 °C). Variability in ΔHa of kinetic parameters was significant among all crop species and photosynthetic mechanisms. This variability could not be related to their domestication region climate, possibly due to subsequent processes of artificial selection. The use of measured values in mathematical models of photosynthesis quantified the importance of improving Rubisco in different crops at changing temperature and CO2 availability conditions. - Conclusions: This thesis presents, under an evolutionary background, relevant information to improve Rubisco by bioengineering processes. The combined analysis of positive selection and coevolution are useful to elucidate interactions between amino acids that should be taken into account when designing better Rubiscos. In addition, the application of DT helps in the construction of relationships between the amino acid variability and the environment in which species evolve. Moreover, this thesis represents the most convincing evidence that Rubiscos of different species differ not only in catalytic constants at 25 °C, but also exhibit different response to temperature. The data published here offer the possibility to increase the accuracy of leaf photosynthesis models and addressed the need for improvement of Rubisco in species of high agricultural interest.[spa] - Introducción: La Rubisco, enzima que cataliza la asimilación de CO2 atmosférico y sustenta la inmensa mayoría de cadenas tróficas de la Biosfera, presenta ineficiencias que limitan el proceso fotosintético. La Rubisco es lenta y puede “confundirse” de sustrato catalizando la fijación de O2 en el proceso de fotorrespiración, que termina liberando CO2 y disipando energía. La existencia de variabilidad interespecífica en las características catalíticas de la Rubisco sugiere que esta enzima se ha sido adaptando a las condiciones ambientales reinantes, en particular, a cambios en la concentración de CO2 en el sitio de catálisis y a las diferentes condiciones térmicas. Estos hallazgos han renovado la esperanza de manipulación genética de la Rubisco con el objetivo de superar sus ineficiencias y mejorar el rendimiento de los cultivos. Sin embargo, el desconocimiento aún presente en aspectos derivados de la gran complejidad estructural y bioquímica de la Rubisco limita, hoy en día, el éxito de mejora. Éste es, precisamente, el enfoque de la presente tesis: ampliar el conocimiento de la evolución molecular y bioquímica de la Rubisco para avanzar en la comprensión y manipulación de la enzima con mayores garantías de éxito. En este sentido, los objetivos de esta tesis fueron: i) investigar la variabilidad genética de la subunidad grande de la Rubisco y su evolución en diferentes grupos de plantas, y ii) explorar la dependencia térmica de las constantes cinéticas de la Rubisco. -Contenido: Para dar respuesta a estos objetivos, se llevaron a cabo 4 experimentos. Los experimentos 1 y 2 presentaron un patrón común consistente en seleccionar especies próximas filogenéticamente (174 especies de Fagales en el experimento 1, y 60 especies de bromelias y orquídeas en el experimento 2) para descifrar la variabilidad en la secuencia de la subunidad grande de la Rubisco e investigar la existencia de sitios aminoacídicos seleccionados positivamente en función del ambiente y caracteres morfológicos y fisiológicos foliares. Los experimentos 3 y 4 se centraron en el estudio de la respuesta de la cinética de la Rubisco a la temperatura. Así, en el experimento 3 se llevó a cabo una compilación bibliográfica para el estudio de la sensibilidad térmica del número de recambio catalítico para la reacción de carboxilación de la Rubisco, kcat c (el parámetro cinético más ampliamente estudiado en todos los grupos fotosintéticos). En el experimento 4 se midieron los parámetros cinéticos de la Rubisco y su respuesta a la temperatura en 20 cultivos económicamente importantes. En ambos experimentos se modelizó el impacto de la variabilidad observada sobre la capacidad asimiladora de la Rubisco bajo diferentes escenarios de disponibilidad de CO2. Los resultados de los experimentos 1 y 2 mostraron, por primera vez, la existencia de una gran variabilidad en la secuencia de la subunidad grande de la Rubisco en especies próximas taxonómicamente. En concreto, las 174 especies estudiadas de Fagales se distribuyeron en 29 haplotipos (grupos de especies con la misma secuencia), 21 haplotipos en las 158 especies de Quercus, 19 haplotipos en orquídeas y 23 haplotipos en bromelias. En todos los grupos estudiados, los análisis demostraron que una parte importante de esta variabilidad había sido fijada por la selección natural, corroborando la hipótesis de la existencia de procesos de cambio adaptativo en la Rubisco. Además, en el experimento 1, se encontraron evidencias de selección positiva en función del hábito foliar y del clima, ambos caracteres determinantes de la concentración de CO2 en el sitio de carboxilación. Este hallazgo supone la primera prueba inequívoca de que las especies ajustan su Rubisco en función de las condiciones ambientales prevalentes. Por el contrario, en el experimento 2, los procesos de selección positiva no se relacionaron aparentemente con el mecanismo fotosintético CAM. En cualquier caso, en todos los grupos estudiados aparecieron pares de sitios aminoacídicos con tendencia a coevolucionar, la mayoría ubicados en regiones importantes para la función y estructura de la Rubisco. Se implementó, de forma pionera, el modelo matemático de árboles de decisión (DT) para el análisis de secuencias y su relación con variables externas. Los resultados del DT corroboraron, en parte, las observaciones de los análisis de selección positiva, validando de esta forma la aplicación de modelos alternativos en la búsqueda de sitios variables. Además, en bromelias y orquídeas, los DT revelaron la existencia de cambios aminoacídicos específicos en función de variables indicadoras del grado de expresión de CAM (δ13C y espesor de hoja). En bromelias y orquídeas se observó variabilidad interespecífica en las constantes catalíticas de la Rubisco, parte de la cual se explicó por la existencia de mecanismos de concentración de carbono en plantas CAM. No obstante, esta variabilidad catalítica no se relacionó directamente con los cambios aminoacídicos detectados por los DT o bajo selección positiva. En el experimento 3, la respuesta de kcat c a la temperatura mostró diferencias entre los grupos fotosintéticos estudiados. Así, los valores más altos y más bajos para la energía de activación (ΔHa) de kcat c se observaron en Rhodophyta y Chlorophyta, respectivamente. En las plantas terrestres, las especies C3 de hábitats cálidos y las especies C4 presentaron una ΔHa de kcat c mayor que las plantas C3 de hábitats fríos. Estos resultados sugieren que la Rubisco ha evolucionado ajustando la sensibilidad de sus propiedades cinéticas a la temperatura e indican adaptación a las condiciones térmicas locales. En el experimento 4, los parámetros cinéticos de la Rubisco (constante de Michaelis-Menten para el CO2, factor específico y kcat c) de los 20 cultivos estudiados mostraron variabilidad interespecífica a las tres temperaturas de ensayo (15, 25 y 35 °C). La variabilidad en la ΔHa de los parámetros cinéticos fue significativa entre todas las especies de cultivo y tipos fotosintéticos, si bien dicha variabilidad no se relacionó con el clima en la región de domesticación, posiblemente debido a procesos posteriores de selección artificial. La aplicación de datos específicos en los modelos matemáticos de fotosíntesis cuantificó la importancia de mejora de la Rubisco en los diferentes cultivos según condiciones cambiantes de temperatura y disponibilidad de CO2. -Conclusiones: Bajo un trasfondo evolutivo, esta tesis presenta información relevante para procesos de bioingeniería direccionados a la mejora de la Rubisco. Los análisis combinados de selección positiva y coevolución resultan útiles para resolver interacciones entre aminoácidos que deberían tenerse en cuenta a la hora de diseñar mejores Rubiscos. Además, la aplicación de los DT ayuda a generar relaciones entre la variabilidad aminoacídica y el ambiente en el que evolucionan las especies. Por otra parte, esta tesis supone la evidencia más convincente de que Rubiscos de diferentes especies no sólo presentan diferencias en las constantes catalíticas a 25 ºC, sino que también presentan diferente respuesta al rango fisiológico de temperaturas. Los datos aquí publicados ofrecen la posibilidad de aumentar la precisión de los modelos de fotosíntesis en hoja, y direccionan la mejora de Rubisco en especies de alto interés agrícola.[cat] - Introducció: La Rubisco, l’enzim que catalitza l’assimilació del CO2 atmosfèric i sustenta la immensa majoria de cadenes tròfiques de la Biosfera, presenta ineficiències que limiten el procés fotosintètic. La Rubisco és lenta i es pot “confondre” de substrat, catalitzant la fixació d’O2 en el procés de fotorespiració, que acaba alliberant CO2 i dissipant energia. L’existència de variabilitat interespecífica en les característiques catalítiques de la Rubisco suggereix que aquest enzim ha anat adaptant-se a les condicions ambientals predominants, en particular, a canvis a la concentració de CO2 al lloc de catàlisi i a les diferents condicions tèrmiques. Aquests descobriments han renovat l’esperança de manipulació genètica de la Rubisco amb l’objectiu de superar les seves ineficiències i millorar així el rendiment dels cultius. No obstant, el desconeixement encara present a alguns aspectes derivats de la gran complexitat estructural de la Rubisco limita, avui en dia, l’èxit de millora. Aquest és precisament l’enfocament de la present tesi: ampliar el coneixement de l’evolució molecular i bioquímica de la Rubisco per avançar en la comprensió i manipulació de l’enzim, i així obtenir majors garanties d’èxit. En aquest sentit, els objectius d’aquesta tesi foren: 1) investigar la variabilitat genètica de la subunitat gran de la Rubisco i la seva evolució dins diferents grups de plantes, 2) explorar la dependència tèrmica de les constants cinètiques de la Rubisco. - Contingut de la investigació: Per a poder donar resposta a aquests objectius, es varen dur a terme quatre experiments. Els experiments 1 i 2 presentaren un patró basat en la selecció d’espècies pròximes filogenèticament (174 espècies de Fagals en el experiment 1 i 60 espècies d’orquídies i bromèlies en el experiment 2) per tal de desxifrar la variabilitat en la seqüència de la subunitat gran de la Rubisco i investigar l’existència de llocs aminoacídics seleccionats positivament en funció de l’ambient i dels caràcters morfològics i fisiològics foliars. Els experiments 3 i 4 es varen centrar en l’estudi de la resposta de la cinètica de la Rubisco a la temperatura. Així, en el experiment 3 es va dur a terme una compilació bibliogràfica per a l’estudi de la sensibilitat tèrmica del nombre de recanvi catalític per a la reacció de carboxilació de la Rubisco, kcat c (el paràmetre cinètic més àmpliament estudiat en tots els grups fotosintètics). En el experiment 4 es varen mesurar els paràmetres cinètics de la Rubisco i la seva resposta a la temperatura dins 20 cultius econòmicament importants. En ambdós experiments es va modelitzar l’impacte de la variabilitat observada sobre la capacitat assimiladora de la Rubisco sota diferents escenaris de disponibilitat de CO2. Els resultats dels experiments 1 i 2 varen mostrar, per primer cop, l’existència d’una gran variabilitat dins la seqüència de la subunitat gran de la Rubisco a espècies pròximes taxonòmicament. En concret, les 174 espècies estudiades de Fagals es varen distribuir en 29 haplotips (grups d’espècies amb la mateixa seqüència), 21 haplotips dins les 158 espècies de Quercus, 19 haplotips dins orquídies i 23 haplotips dins les bromèlies. Dins tots els grups estudiats, les anàlisis demostraren que una part important d’aquesta variabilitat havia estat fixada per la selecció natural, corroborant la hipòtesi de l’existència de canvis adaptatius a la Rubisco. A més, en el experiment 1 es varen trobar evidències de selecció positiva en funció de l’habitat foliar i del clima, ambdós caràcters determinants de la concentració de CO2 en el lloc de carboxilació. Aquest descobriment suposa la primera prova inequívoca de que les espècies ajusten la Rubisco en funció de les condicions ambientals que predominen. Per el contrari, en el experiment 2 els processos de selecció positiva no es varen relacionar aparentment amb el mecanisme fotosintètic CAM. En qualsevol cas, dins tots els grups estudiats varen aparèixer parells de llocs aminoacídics amb tendència a coevolucionar, la majoria ubicats a llocs importants per a la funció i estructura de la Rubisco. Es va implementar de forma pionera el model matemàtic d’arbres de decisió (DT) per a l’anàlisi de seqüències i la seva relació amb variables externes. Els resultats del DT varen corroborar en part les observacions de les anàlisis de selecció positiva, validant així l’aplicació de models alternatius per a la recerca de llocs variables. A més, dins bromèlies i orquídies, els DT varen revelar la existència de canvis aminoacídics específics, en funció de variables indicadores d’expressió de CAM (δ13C i gruixa de fulla). Dins bromèlies i orquídies es va observar variabilitat interespecífica en les constants catalítiques de la Rubisco, part de la qual es va explicar per l’existència de mecanismes de concentració de carboni dins plantes CAM. No obstant, aquesta variabilitat catalítica no es va relacionar directament amb els canvis aminoacídics detectats mitjançant els DT o sota selecció positiva. En el experiment 3, la resposta de kcat c a la temperatura va mostrar diferències entre els grups fotosintètics estudiats. Així, els valors més alts i més baixos per a l’energia d’activació (ΔHa) de kcat c es varen observar a Rhodophyta i Chlorophyta, respectivament. A les plantes terrestres, les espècies C3 d’hàbitats càlids i les espècies C4 presentaren una ΔHa de kcat c major que les plantes C3 d’hàbitats freds. Aquests resultats suggereixen que la Rubisco ha evolucionat ajustant la sensibilitat de les seves propietats cinètiques a la temperatura i indiquen una adaptació a les condicions tèrmiques locals. En el experiment 4, els paràmetres cinètics de la Rubisco (constant de Michaelis- Menten per al CO2, factor específic i kcat c) dels 20 cultius estudiats varen mostrar variabilitat interespecífica a les tres temperatures d’assaig (15, 25 i 35 °C). La variabilitat dins la ΔHa dels paràmetres cinètics va ser significativa entre totes les espècies de cultius i tipus fotosintètics, si bé aquesta variabilitat no es va relacionar amb el clima de la regió de domesticació, possiblement degut a processos posteriors de selecció artificial. L’aplicació de dades específiques en els models matemàtics de fotosíntesi va quantificar la importància de millora de la Rubisco en els diferents cultius segons condicions canviants de temperatura i disponibilitat de CO2. - Conclusió: Sota un rerefons evolutiu, aquesta tesi presenta informació rellevant per a processos de bioenginyeria enfocats a la millora de la Rubisco. Les anàlisis combinades de selecció positiva i coevolució resulten útils per a resoldre interaccions entre aminoàcids que haurien de tenir-se en compte a l’hora de dissenyar millors Rubiscos. A més, l’aplicació dels DT ajuda a generar relacions entre la variabilitat aminoacídica i l’ambient en que evolucionen les espècies. Per altra banda, aquesta tesi suposa l’evidència més convincent de que Rubiscos de diferents espècies no només presenten diferències en les constants catalítiques a 25 °C, sinó que també presenten diferents respostes al rang fisiològic de temperatures. Les dades aquí publicades ofereixen la possibilitat d’augmentar la precisió dels models de fotosíntesi a nivell de fulla i marquen el camí per a la millora de la Rubisco dins les espècies d’alt interès agrícola

Exploring molecular evolution of Rubisco in C3 and CAM Orchidaceae and Bromeliaceae

Background The CO2-concentrating mechanism associated to Crassulacean acid metabolism (CAM) alters the catalytic context for Rubisco by increasing CO2 availability and provides an advantage in particular ecological conditions. We hypothesized about the existence of molecular changes linked to these particular adaptations in CAM Rubisco. We investigated molecular evolution of the Rubisco large (L-) subunit in 78 orchids and 144 bromeliads with C3 and CAM photosynthetic pathways. The sequence analyses were complemented with measurements of Rubisco kinetics in some species with contrasting photosynthetic mechanism and differing in the L-subunit sequence. Results We identified potential positively selected sites and residues with signatures of co-adaptation. The implementation of a decision tree model related Rubisco specific variable sites to the leaf carbon isotopic composition of the species. Differences in the Rubisco catalytic traits found among C3 orchids and between strong CAM and C3 bromeliads suggested Rubisco had evolved in response to differing CO2 concentration. Conclusions The results revealed that the variability in the Rubisco L-subunit sequence in orchids and bromeliads is composed of coevolving sites under potential positive adaptive signal. The sequence variability was related to δ13C in orchids and bromeliads, however it could not be linked to the variability found in the kinetic properties of the studied species

A compendium of temperature responses of Rubisco kinetic traits: variability among and within photosynthetic groups and impact on photosynthesis modelling

[eng] The present study provides a synthesis of the in vitro and in vivo temperature responses of Rubisco Michaelis-Menten constants for CO2 (Kc) and O2 (Ko), specificity factor (Sc,o) and maximum carboxylase turnover rate ( kcat c ) for 49 species from all the main photosynthetic kingdoms of life. Novel correction routines were developed for in vitro data to remove the effects of study-to-study differences in Rubisco assays. The compilation revealed differences in the energy of activation (ΔHa) of Rubisco kinetics between higher plants and other photosynthetic groups, although photosynthetic bacteria and algae were under-represented and very few species have been investigated so far. Within plants, the variation in Rubisco temperature responses was related to species' climate and photosynthetic mechanism, with differences in ΔHa for kcat c among C3 plants from cool and warm environments, and in ΔHa for kcat c and Kc among C3 and C4 plants. A negative correlation was observed among ΔHa for Sc/o and species' growth temperature for all data pooled, supporting the convergent adjustment of the temperature sensitivity of Rubisco kinetics to species' thermal history. Simulations of the influence of varying temperature dependences of Rubisco kinetics on Rubisco-limited photosynthesis suggested improved photosynthetic performance of C3 plants from cool habitats at lower temperatures, and C3 plants from warm habitats at higher temperatures, especially at higher CO2 concentration. Thus, variation in Rubisco kinetics for different groups of photosynthetic organisms might need consideration to improve prediction of photosynthesis in future climates. Comparisons between in vitro and in vivo data revealed common trends, but also highlighted a large variability among both types of Rubisco kinetics currently used to simulate photosynthesis, emphasizing the need for more experimenta

Temperature responses of the Rubisco maximum carboxylase activity across domains of life: phylogenetic signals, trade-offs, and importance for carbon gain

[eng] Temperature response of ribulose-1,5-bisphos- phate carboxylase/oxygenase (Rubisco) catalytic properties directly determines the CO2 assimilation capacity of photosynthetic organisms as well as their survival in environments with different thermal conditions. Despite unquestionable importance of Rubisco, the comprehensive analysis summarizing temperature responses of Rubisco traits across lineages of carbon-fixing organisms is lacking. Here, we present a review of the temperature responses of Rubisco carboxylase specific activity (kc ) within and cat across domains of life. In particular, we consider the var- iability of temperature responses, and their ecological, physiological, and evolutionary controls. We observed over two-fold differences in the energy of activation (DHa) among different groups of photosynthetic organisms, and found significant differences between C3 plants from cool habitats, C3 plants from warm habitats and C4 plants. According to phylogenetically independent contrast ana- lysis, DHa was not related to the species optimum growth temperature (Tgrowth), but was positively correlated with Rubisco specificity factor (Sc/o) across all organisms. However, when only land plants were analyzed, DHa was positively correlated with both Tgrowth and Sc/o, indicating different trends for these traits in plants versus unicellular aquatic organisms, such as algae and bacteria. The opti- mum temperature (T ) for kc correlated with S for land opt cat c/o plants and for all organisms pooled, but the effect of Tgrowth on Topt was driven by species phylogeny. The overall phylogenetic signal was significant for all analyzed parameters, stressing the importance of considering the evolutionary framework and accounting for shared ancestry when deciphering relationships between Rubisco kinetic parameters. We argue that these findings have important implications for improving global photosynthesis models

CDK8 of the mediator kinase module connects leaf development to the establishment of correct stomata patterning by regulating the levels of the transcription factor SPEECHLESS (SPCH)

The components of the mediator kinase module are highly conserved across all eukaryotic lineages, and cyclin-dependent kinase 8 (CDK8) is essential for correct cell proliferation and differentiation in diverse eukaryotic systems. We show that CDK8 couples leaf development with the establishment of correct stomata patterning for prevailing CO2 conditions. In Arabidopsis, the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor SPEECHLESS (SPCH) controls cellular entry into the stomatal cell lineage, and CDK8 interacts with and phosphorylates SPCH, controlling SPCH protein levels and thereby also expression of the SPCH target genes encoding key regulators of cell fate and asymmetric cell divisions. The lack of the CDK8-mediated control of SPCH results in an increased number of meristemoid and guard mother cells, and increased stomata index in the cdk8 mutants. Increasing atmospheric CO2 concentrations trigger a developmental programme controlling cell entry into stomatal lineage by limiting the asymmetric divisions. In cdk8, the number of meristemoids and guard mother cells remains the same under ambient and high CO2 concentrations, as the accumulated levels of SPCH caused by the lack of CDK8 appear to override the negative regulation of increased CO2. Thus, our work provides novel mechanistic understanding of how plants alter critical leaf properties in response to increasing atmospheric CO2

Two dominant boreal conifers use contrasting mechanisms to reactivate photosynthesis in the spring

Boreal forests are dominated by evergreen conifers that show strongly regulated seasonal photosynthetic activity. Understanding the mechanisms behind seasonal modulation of photosynthesis is crucial for predicting how these forests will respond to changes in seasonal patterns and how this will affect their role in the terrestrial carbon cycle. We demonstrate that the two co-occurring dominant boreal conifers, Scots pine (Pinus sylvestris L.) and Norway spruce (Picea abies), use contrasting mechanisms to reactivate photosynthesis in the spring. Scots pine downregulates its capacity for CO2 assimilation during winter and activates alternative electron sinks through accumulation of PGR5 and PGRL1 during early spring until the capacity for CO2 assimilation is recovered. In contrast, Norway spruce lacks this ability to actively switch between different electron sinks over the year and as a consequence suffers severe photooxidative damage during the critical spring period