Toxicological effects of TiO2 nanoparticles in two freshwater species: carassius auratus and corbicula fluminea

Titanium dioxide (TiO2) nanoparticles (NPs) have a widespread use, from industrial applications to consumer products. The increasing use of nanomaterials can lead to significant releases of NPs into environment and the aquatic system is commonly the ultimate recipient for NPs. However, the impact and potential detrimental effects of NPs to aquatic biota remains unclear. In this context, the aim of the present work is to evaluate the toxicity of the TiO2 NPs exposure in two freshwater species (Carassius auratus and Corbicula fluminae). Organisms were exposed to suspensions of TiO2 NPs (±21 nm) within a range of concentrations from 0.01 to 800 mg TiO2/L and sampled for enzymatic and histological analysis after periods of 7, 14 and 21 days. Lipid peroxidation, superoxide dismutase, catalase and glutathione-s-transferase activity were determined in order to evaluate the response to oxidative stress. Tissues from target organs were analyzed by optical and electron microscopy and x-ray elemental analyses allowed detecting the presence of TiO2. The exposure to TiO2 NPs in aquatic suspensions was not lethal for C. auratus, but significant mortality rates were found for C. fluminea. Results show that TiO2 NPs causes toxicity involving oxidative stress, increasing lipid peroxidation and inducing significant variations of the antioxidant activity in the exposed organisms compared to controls and over exposure time. Histological pathologies were observed in C. auratus gills, liver and intestine and in C. fluminea digestive gland. NPs in suspension are ingested by organisms, resulting in the accumulation of TiO2 NPs agglomerates inside C. auratus intestinal lumen. Cellular internalization of TiO2 NPs was confirmed in cells from fish gills. The results suggest that, a potential risk to the aquatic biota exist related to the TiO2 NPs release to the aquatic environment. The environmental impact of the NPs is a matter of concern and despite an increase of studies of nanosized-TiO2 effects, the precise mechanisms of toxicity of this and other metal NPs remain unclear.As nanopartículas (NPs) de dióxido de titânio (TiO2) têm uma vasta utilização, desde aplicações industriais a produtos para os consumidores. O uso crescente de nanomateriais pode levar à entrada de quantidades significativas de NPs no meio ambiente, sendo o meio aquático muitas vezes o seu destino final. Porém, o impacto e possíveis efeitos nocivos das NPs para o biota aquático ainda não estão totalmente clarificados. Neste contexto, este trabalho pretende avaliar a toxicidade de NPs de TiO2 em duas espécies de organismos de água doce (Carassius auratus e Corbicula fluminae). Os organismos foram expostos a suspensões de NPs de TiO2 (±21 nm) com concentrações desde 0.01 a 800 mg TiO2/L e processados para a realização de análises enzimáticas e histológicas após períodos de 7, 14 e 21 dias. Foi determinada a actividade enzimática da superóxido dismutase, catalase e glutationa-s-tranferase e o grau de peroxidação lipídica, a fim de avaliar a resposta ao stress oxidativo. Os tecidos de órgãos alvo previamente seleccionados de acordo com a sua importância fisiológica foram observados através de microscopia óptica e electrónica e a presença de TiO2 foi determinada através de análise elementar de raio x. A exposição dos organismos a suspensões de NPs de TiO2 não foi letal para os peixes da espécie C. auratus, mas níveis de mortalidade significativos ocorreram nos bivalves da espécie C. fluminae. Os resultados demonstram que as NPs de TiO2 podem causar toxicidade sub-letal envolvendo stress oxidativo, aumentando a peroxidação lipídica e induzindo variações significativas da actividade antioxidante comparativamente aos controlos e ao longo dos períodos de exposição. Foram observadas alterações histológicas nas branquias, fígado e intestino dos peixes e na glândula digestiva dos bivalves. Verificou-se que as NPs presentes em suspensão foram ingeridas pelos organismos, o que resulta na acumulação de aglomerados de NPs dentro do lúmen intestinal dos peixes. Confirmou-se ainda a ocorrência de internalização celular de NPs de TiO2, especificamente nas células do tecido branquial dos peixes. Os resultados obtidos sugerem que existe um potencial risco para o biota aquático, relacionado com a entrada das NPs de TiO2 no ambiente aquático. O impacto ambiental das NPs é uma questão de enorme relevância e apesar de se observar um aumento dos estudos sobre os efeitos das NPs de TiO2, os mecanismos de toxicidade destas e de outras NPs metálicas permanecem por esclarecer

Burden of disease of four foodborne pathogens : a harmonized approach in Denmark

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaConsumption of contaminated food products and exposure to a variety of health hazards can lead to a wide spectrum of foodborne diseases (FBD). The true impact of these diseases is still unknown worldwide. Burden of illness (BoI) and burden of disease (BoD) studies can be developed in order to help decision makers implement intervention and control measures to improve food safety systems. This thesis describes an integrated model to estimate the public health impact of four zoonotic foodborne pathogens in Denmark in 2016 – Campylobacter spp., Salmonella spp., Yersinia enterocolitica and verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC). The applied model consisted of two general components: a BoI study, which was applied to estimate total incidence of these pathogens in the Danish population, accounting for underdiagnosis and under-reporting; and a BoD study, which built on the first and estimated disease burden in terms of the disability adjusted life year metric (DALYs). It also describes the model developed to estimate the BoD of yersiniosis – the first developed in Denmark and in Europe. Total incidence estimates point to 66,202 cases of illness, with Campylobacter contributing the most (51,225 cases), and Yersinia the least (1,860 cases). The total BoD is 2,290 DALYs. Ranking in first place with the highest burden is campylobacteriosis, followed by salmonellosis, yersiniosis and VTEC infections, with 30, 8, 1 and 0.8 DALYs per 100,000 inhabitants, respectively. Gastroenteritis was the sequela which born the highest burden, when compared to long-term sequelea. Total incidence estimates for all four pathogens show that children under five years old have the highest incidence when compared to other age groups, while BoD estimates regarding Campylobacter and Salmonella show the highest burden on elderly people, which can be explained by the high number of fatal cases estimated for that age group. Still, those two diseases have a considerable high burden on young children, as does yersiniosis and VTEC infections. Differences in methodological approach used to estimate total incidence and the BoD makes comparison among countries difficult. The burden of these preventable diseases is still considerable, even in developed countries like Denmark. Understanding the contribution of each cause to the burden of FBD and incorporating estimates into policy development worldwide will enable efficient and effective interventions and improvements throughout all the food chain.RESUMO - Impacto na saúde pública de quatro agentes patogénicos de origem alimentar: uma abordagem harmonizada na Dinamarca - O consumo de alimentos contaminados e a exposição a fatores de risco pode causar um alargado espectro de doenças de origem alimentar. O verdadeiro impacto destas doenças é ainda desconhecido. Estudos de burden of illness (BoI) e burden of disease (BoD) podem ser desenvolvidos, facilitando a implementação de medidas de intervenção e controlo por parte das autoridades, com o intuito de melhorar os sistemas de segurança dos alimentos. Esta tese descreve um modelo integrado para estimar o impacto na saúde pública de quatro agentes zoonóticos transmitidos por alimentos – Campylobacter spp., Salmonella spp., Yersinia enterocolitica e Escherichia coli verocitotoxinogénica (VTEC). O modelo aplicado é composto por duas componentes: um estudo de BoI para estimar a incidência total destes agentes patogénicos na população dinamarquesa, tendo em conta o grau de sub-diagnóstico e sub-notificação; e um estudo de BoD que contabiliza o impacto destas doenças utilizando uma medida universal designada: disability adjusted life year (DALYs). Também está descrito o modelo concebido para estimar o impacto da yersiniose – o primeiro a ser desenvolvido quer na Dinamarca, quer na Europa. A incidência total estimada aponta para 66,202 casos de doença; com Campylobacter dando um maior contributo (51,225 casos) e Yersinia o menor (1,860 casos). A totalidade do impacto destas quatro doenças foi de 2,290 DALYs. O maior impacto na saúde pública é causado por campilobacteriose, seguida de salmonelose, yersiniose e infeções por VTEC, com 30, 8, 1 e 0.8 DALYs por 100,000 habitantes, respetivamente. A gastroenterite foi a sequela com maior impacto, quando comparada com sequelas de longa duração. As estimativas de incidência total para os quatro agentes patogénicos mostram que crianças com menos de cinco anos têm uma maior incidência, comparando com outras faixas etárias, enquanto as estimativas de BoD para Campylobacter e Salmonella mostram um maior impacto em idosos. Ainda assim, essas duas doenças têm um considerável impacto em crianças, como o têm a yersiniose e as infeções VTEC. As diferenças na abordagem metodológica utilizada para estimar a incidência total e o BoD dificultam a comparação entre países. O impacto dessas doenças evitáveis é ainda considerável, mesmo em países desenvolvidos como a Dinamarca. Compreender a contribuição de cada causa para o peso das doenças transmitidas por alimentos e incorporar estimativas no desenvolvimento de políticas em todo o mundo permitirá intervenções e melhorias eficientes e efetivas em toda a cadeia alimentar.N/

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CEM

Fenilcetonúria e suas variantes: revisão bibliográfica

A fenilcetonúria representa o erro do metabolismo dos aminoácidos mais comum na população caucasiana, atingindo 1/10.000 nascimentos. Esta doença, de transmissão autossómica recessiva, resulta da deficiência em fenilalanina hidroxilase ou de erros no metabolismo da tetrahidrobiopterina. O diagnóstico precoce é extremamente importante, pois dele depende o tratamento que consiste na restrição alimentar de fenilalanina e proteínas naturais. Quando não tratada pode resultar em complicações neurológicas irreversíveis. Phenylketonuria represents the most common defect of aminoacid metabolism in Caucasian population, with a prevalence of 1/10.000 births. This disease, with autossomic recessive transmission, results from phenylalanine hydroxylase deficiency or defects on tetrahydrobiopterin metabolism. The early diagnosis is extremely important, since it will influence treatment, which consists of phenylalanine and natural proteins intake restriction. If not treated, it may lead to irreversible neurological complications

Haptoglobina e TNF-α, dois biomarcadores genéticos e circulantes associados às respostas de fase aguda na psoríase

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013A psoríase é uma doença que afecta cerca de 2% da população. É uma patologia imunitária e inflamatória que se manifesta através de placas eritmatosas. Nestas placas podemos encontrar infiltrados inflamatórios de células de diferentes tipos, como células dendríticas, macrófagos e células T. Pensa-se que o desencadear da psoríase possa estar relacionado com o TNF-α (Tumor Necrosis Factor α) e a haptoglobina, dois factores polimórficos envolvidos no processo de inflamação. O TNF-α é uma citocina proeminente nas reacções inflamatórias e a haptoglobina uma proteina de fase aguda tem um papel regulador nas mesmas. Assim sendo, este estudo visa a determinação dos polimorfismos destes dois genes, bem como a concentração extracelular da proteína do TNF-α entre duas populações, em uma população de doentes psoriásicos e em uma população de controlo. Através da análise dos resultados obtidos verificou-se que o genótipo GG para a posição -308 do promotor para o gene do TNF-α tem uma maior prevalência em doentes psoriásicos que em controlos. Para o polimorfismo da haptoglobina verificou-se também uma maior prevalência do genótipo Hp2-1 em doentes psoriásicos relativamente a indivíduos controlo. Ainda relativamente ao TNF-α verificou-se que a concentração sérica desta citocina é mais elevada para os doentes que para os controlos. Foi também verificado que uma maior concentração desta proteína está associada ao genótipo GG, comparativamente aos controlos. Resultado idêntico foi obtido para o genótipo Hp2-1 da haptoglobina. O PASI (Psoriasis Area Severity Index) foi também um dos parâmetros analisados, sendo que não se encontrou qualquer associação com os polimorfismos em estudo. No entanto foi possível verificar uma correlação inversa da concentração sérica de TNF-α com o valor do PASI. No futuro, seria proveitoso aumentar o número de indivíduos de ambas as populações e obter os dados clínicos dos pacientes.Psoriasis is a disease that affects 2% of the population. It is an immune and inflammatory pathology that manifests itself through erythematous plaques. In these plaques we can find inflammatory infiltrates of different cell types, like dendritic cells, macrophages and T cells. The aim of this work is to study TNF-α and haptoglobin, two important molecules in the inflammatory process, and that could be related with the onset or maintenance of the disease. TNF-α is a prominent cytokine and haptoglobin has a regulatory role in inflammatory reactions. TNF-α was analysed both at the gene and protein concentration level, whereas haptoglobin was only analysed at the gene level. The result analysis demonstrates that genotype GG for the -308 position in the promoter of the TNF-α (Tumor Necrosis Factor α) gene has a higher prevalence in psoriatic patients than controls, the same being found for the Hp2-1 haptoglobin genotype. The TNF-α concentration was observed to be increased in psoriatic patients, and also in the genotypes GG (TNF-α) and Hp2-1 (haptoglobin). Finally, it was found that the severity of the disease was not related to a specific genotype neither for TNF-α or haptoglobin genes. Although it was found that a relation exists between PASI (Psoriasis Area Severity Index) and the TNF-α concentration, a decrease in the TNF-α concentration appears to be associated with an increased severity of the disease. In the future, it would be better to increase the sample size for both control and patient groups and also to obtain the patient’s clinical data

Barras transpalatinas: indicações e comparação

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Medicina DentáriaAs barras transpalatinas são dispositivos ortodônticos com grande utilidade na prática clinica, atravessam o palato presas ao 1º Molar superior e têm aplicações diversas podendo impedir ou efetuar movimento dentário. O presente trabalho teve como objetivos analisar as diversas indicações das barras transpalatinas e comparar a barra de Goshgarian com a barra de Zachrisson. Neste contexto foram considerados na revisão da literatura artigos que comparassem ambas as barras. Dentro das limitações impostas pelo tipo de revisão realizada podemos concluir que a barra transpalatina com melhores resultados a nível de momentos e forças aplicadas é a barra de Zachrisson, porém deve ser analisado o efeito pretendido e a melhor opção terapêutica deve ser escolhida.The transpalatal bars are orthodontic devices with great utility in Clinical Practice, they cross the palate and are clutch to the 1st upper Molar. The applications are very different, with them we can stop dental movement or enforce it. The present work proposes itself to analyze the indications of transpalatal bars comparing the types that are most used - Goshgarian bar and Zachrisson - through existing studies and literature. With this work the conclusion was that the Zachrisson bar shows the best results of applied forces and moments, however it must be always considered the desired effect and the best option therapy must be chosen

New insights on black rot of crucifers : disclosing novel virulence genes by in vivo host/pathogen transcriptomics and functional genetics

Tese de doutoramento, Biologia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018Xanthomonas campestris belongs to the gamma subdivision of Proteobacteria and is the type species of a genus comprising 28 species of plant pathogenic bacteria, affecting 124 species of monocotyledonous and 268 species of dicotyledonous plants. Identified for the first time in 1895 in the United States of America, this species has undergone several taxonomic reclassifications, and currently comprises pathovars X. campestris pv. campestris (Xcc), X. campestris pv. raphani (Xcr) and X. campestris pv. incanae (Xci), causing distinct diseases in vegetables, ornamentals and spontaneous plants belonging to Brassicaceae family, as well as some vegetable crops belonging to the Solanaceae family. Black rot disease, caused by Xcc, is the most important bacterial disease of Brassicaceae, affecting crops and weeds worldwide. After penetration through hydathodes on leaf margins, bacterial multiplication causes typical V-shaped lesions on leaf margins, followed by darkening of the veins that evolve to necrosis of the affected tissue, ultimately leading to plant death. Short-distance dispersal through plant-to-plant contact, human manipulation, wind, insects, aerosols and irrigation water or rain, associated with long distance dispersal through infected seeds and plantlets following commercial routes across the globe are responsible for the worldwide distribution of this disease. Studies on the interaction of Xcc with B. oleracea have identified several virulence genes, however no resistance genes have been successfully cloned in Brassicaceae crops and there is still a lack of effective black rot disease control measures, which continues to cause severe economic losses worldwide. Despite the growing body of work on this subject, molecular mechanisms of host-pathogen interaction have been mostly inferred using in vitro approaches, resulting in a knowledge gap concerning the in vivo behavior of this pathogen during its interaction with plant hosts. In Portugal, an important centre of Brassicaceae domestication, Xcc has long been identified and Portuguese Xcc strains have already been described as a unique sub-population of this pathogen. In this context, with the goal of bringing new insights on the molecular mechanisms of host/pathogen interaction, a set of 33 X. campestris strains collected in the country was characterized, in terms of pathogenicity, virulence, population structure and phylogenetic diversity. Furthermore, the in planta transcriptomes of the Xcc strains representing the extremes of the virulence spectrum during the infection process on two selected hosts were profiled, in a total of four pathosystems. A high level of phenotypic diversity, supported by phylogenetic data, was found among X. campestris isolates, allowing the identification of Xcc closely related pathovars Xcr and Xci for the first time in Portugal. Moreover, among Xcc isolates, presence of races 4, 6 and 7 was recorded, and two novel races of this pathovar, race 10 and race 11, were also described. Contrastingly, the partial virulence profiles determined by the presence of known virulence genes were highly conserved among the set of X. campestris strains. The integration of Portuguese strains in a global dataset comprising a total of 75 X. campestris strains provided a snapshot of the worldwide X. campestris phylogenetic diversity and population structure, correlating the existing pathovars with three distinct genetic lineages. The identification of an intermediate link between Xcc and Xcr, suggests that these pathovars are more closely related to each other than to Xci. This gradient of genetic relatedness seems to be associated to the host range of each pathovar. While Xci appears only to be pathogenic on ornamental Brassicaceae, Xcc and Xcr have a partially overlapping host range: Xcc affects mostly Brassicaceous hosts, whereas Xcr, while affecting the same hosts, is also pathogenic on Solanaceous hosts. These findings suggest that instead of causing a host shift, the genetic divergence between Xcc and Xcr conferred the latter strains the ability to explore additional hosts, resulting in a broader host range. Although population displayed a major clonal structure, the presence of recombinational events that may have driven the ecological specialization of X. campestris and distinct host ranges was highlighted. Portuguese X. campestris strains provided a significant input of genetic diversity, confirming this region as an important diversification reservoir, most likely taking place through host-pathogen co-evolution. Virulence assessment of Portuguese Xcc strains, based on the percentage on infected leaf area after inoculation, highlighted that virulence was not homogeneous within races and that higher pathogenicity was not necessarily correlated higher virulence. It was then possible to select the extremes of the virulence spectrum – CPBF213, the lowest virulence strain (L-vir), and CPBF278, the highest virulence strain (H-vir). The in vivo transcriptome profiling of those contrastingly virulent strains infecting two cultivars of B. oleracea, using RNA-Seq, allowed establishing that Xcc undergoes transcriptional reprogramming in a host-independent manner, suggesting that virulence is an intrinsic feature of the pathogen. A total of 154 differentially expressed genes (DEGs) were identified between the two strains. The most represented functional category of DEGs was, as expected, ‘pathogenicity and adaptation’, representing 16% of the DEGs, although the complex adaptation of pathogen cells to the host environment was highlighted by the presence of DEGs from various functional categories. Among DEGs, Type III effector coding genes xopE2 and xopD were induced in L-vir strain, while xopAC, xopX and xopR were induced in H-vir strain. In addition to Type III effectors, genes encoding proteins involved in signal transduction systems, transport, detoxification mechanisms and other virulenceassociated processes were found differentially expressed between both strains, highlighting their role in virulence regulation. Overall, low virulence appears to be the combined result of impaired sensory mechanisms, reduced detoxification of reactive oxygen species, decreased motility and higher production of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), accompanied by an overexpression of avirulence proteins and a repression of virulence proteins targeting the hosts’ PAMP-triggered immune responses. Contrastingly, the highly virulent strain showed to be better equipped to escape initial plant defenses, whether avoiding detection, or by the ability to counteract those responses. On the other hand, upon detection, highly virulent pathogens will show a decreased expression of avirulence proteins, making them less recognizable by the hosts Effector-Triggered Immunity mechanisms, and thus able to continue multiplying and cause more severe disease symptoms. Through the study of differential infections in planta, the highly innovative strategy used in this work contributed to disclosure of novel virulence related genes in X. campestris pv. campestris - B. oleracea pathosystem, that will be crucial to further detail the virulence regulation network, and develop new tools for the control of black rot disease

Asymmetric post-translational modifications regulate the intracellular distribution of unstimulated STAT3 dimers

Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019Os astrócitos são um tipo de células nervosas essenciais para um bom funcionamento do Sistema Nervoso Central (SNC). Normalmente, são responsáveis pela regulação da corrente sanguínea, manutenção da barreira hematoencefálica, fornecimento de energia através dos metabólicos, participação na função e plasticidade sináptica e manutenção do equilíbrio de iões extracelulares, fluidos e transmissores. Estas células são também os primeiros elementos a responderem após um insulto do SNC. Os astrócitos perante traumas apresentam uma variedade de mecanismos de defesa e um deles e a via do JAK/STAT3. A ativação desta via ocorre durante a astrogliose reativa, um processo pelo qual os astrócitos sofrem grandes alterações, principalmente na expressão dos seus genes, na morfologia e proliferação. Em casos mais graves, a ativação de STAT3 permite a formação da cicatrização glial, uma barreia física que protege as células saudáveis das danificadas e da própria inflamação. STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) no geral participa em inúmeras funções biológicas em forma de homo-dímero e hetero-dímero (com STAT1, outro membro da família das proteínas STAT). Esta proteína é um fator de transcrição citoplasmático que tem como principal função a regulação da expressão de genes específicos envolvidos no crescimento, sobrevivência e diferenciação celular, assim como no desenvolvimento e na inflamação, entre outros processos biológicos. No entanto, tem sido demonstrado que a desregulação da ativação de STAT3 pode contribuir para o desenvolvimento de várias doenças. Por exemplo, STAT3 aberrante ou constitutivamente ativo está associado a uma grande variedade de cancros e malignidades hematológicas. A clássica via de sinalização de STAT3 e a JAK/STAT3. Esta começa quando citocinas ou fatores de crescimento se ligam a recetores permitindo que proteínas como JAK fosforilem o domínio citoplasmático do mesmo. Dímeros de STAT3 são recrutados para o recetor e fosforilados na tirosina na posição 705 também por JAK, ativando-os. Estes dímeros ativos entram para o núcleo e regulam a expressão de genes alvo. Inicialmente pensava-se que a formação de dímeros ocorria apenas depois da ativação de STAT3, ou seja, depois da fosforilação da tirosina 705. No entanto, nos últimos anos tem sido demonstrado que STAT3 encontra-se maioritariamente no citoplasma em forma de dímero não-fosforilado (U-STAT3) em células não estimuladas. Para além disso, dímeros de U-STAT3 conseguem entrar no núcleo e na mitocôndria para regular a atividade transcricional e aumentar a respiração celular, respetivamente. Esta descoberta levantou bastantes questões na comunidade científica pois STAT3 está a revelar ser uma proteína muito mais complexa do que se pensava. STAT3 apresenta seis domínios, cada um com funções específicas, e é alvo de inúmeras alterações como mutações e modificações pós-traducionais em certos resíduos. Estas alterações são capazes de influenciar o comportamento de STAT3 e, por conseguinte, a sua função. Por esta razão, neste projeto foram estudados vários resíduos. Cinco deles estão relacionados com modificações pós-traducionais: K49, K140, K685, Y705 e S727. K49 pode ser acetilado ou dimetilado, podendo regular positivamente a transcrição de genes e a ligação do STAT3 ao ADN. A dimetilação de K140 atenua a expressão de um regulador negativo de STAT3. Também ocorre acetilação do resíduo K685 que participa na dimerização e permite amplificar o efeito da fosforilação de Y705. A fosforilação de Y705 é, por sua vez, a modificação pós-traducional mais estudada, pois ela é responsável por ativar STAT3 para a sua função transcricional. Outra fosforilação acontece no resíduo S727 que tanto aumenta o efeito da fosforilação de Y705 ao ajudar na regulação da expressão de genes, como está envolvida na respiração mitocondrial. Para além destes resíduos, ainda foi estudado um resíduo relacionado com adenomas hepatocelulares inflamatórios quando está mutado (L78); outro relacionado com a estabilidade estrutural dos dímeros (R609); e o terminal carboxílico que inclui os dois últimos domínios de STAT3, SH2 e TAD. Para avaliar a contribuição relativa destes resíduos na dimerização e na distribuição intracelular, foram geradas combinações simétricas (com a mesma mutação nos dois monómeros) e assimétricas (com mutações diferentes em cada monómero). Ao longo do projeto foi usado o sistema de complementação bimolecular de fluorescência (BiFC) em células não estimuladas. Venus foi a proteína fluorescente usada neste sistema. Ambas metades não fluorescentes desta proteína (Venus 1 e Venus 2) foram fundidas com o terminal amínico de STAT3 em dois plasmídeos independentes. Quando duas moléculas de STAT3 dimerizam, as metades de Venus são capazes de interagir diretamente uma com a outra tornando-se numa proteína funcional e emitir fluorescência. O sinal que é emitido é diretamente proporcional à quantidade de dímeros formados. Na primeira parte deste projeto foi focada a dimerização. Através da técnica de citometria de fluxo, conseguiu-se perceber que esta não foi afetada pelos mutantes simples e duplos (Y705F e S727A) resistentes a fosforilação. No entanto, foi parcialmente diminuída pelo mutante que não apresentava os domínios SH2 e TAD, por um inibidor de STAT3 e pelas combinações assimétricas e simétrica do mutante L78R. Isto significa que a dimerização ocorre independentemente da fosforilação, e que o resíduo L78 e o domínio SH2 apresentam um papel crucial na formação e estabilização da mesma, respetivamente. Na segunda parte, foi avaliada a distribuição intracelular de STAT3 através da técnica de microscopia de fluorescência. Os resultados obtidos revelaram que os resíduos estudados afetam de maneira diferente a distribuição intracelular de STAT3. K49, Y705 e S727 são os que mais afetam a localização de STAT3. Os mutantes K49R e S727A aumentam a translocação de STAT3 entre o núcleo e o citoplasma apenas quando são combinados assimetricamente. Em contraste, o mutante Y705F aumenta este movimento apenas quando está acoplado com ele próprio. Enquanto que o mutante L78R aumenta a localização nuclear e a formação de agregados com praticamente todas as combinações (simétrica e assimétricas), a combinação simétrica de R609Q aumenta apenas a localização mitocondrial. Por fim, os pares contendo as mutações K140R e K685R apresentam uma tendência de alterar a localização citoplasmática dos dímeros de STAT3 para o núcleo, mas só com um par é que foi significativo. No entanto, vendo noutra perspetiva, as combinações com duas mutações K-R foram as que mais alteraram a translocação entre citoplasma e núcleo. As combinações com apenas uma mutação K-R ou com um mutante resistente à fosforilação conseguiram aumentar a quantidade de STAT3 no núcleo. Em suma, a ocorrência de diferentes modificações pós-traducionais nos dois monómeros do mesmo dímero influenciam a distribuição intracelular de STAT3, assim como o resíduo L78. Os resultados obtidos sugerem que as modificações pós-traducionais que ocorrem nas lisinas são as que mais regulam a circulação de STAT3 entre o citoplasma e o núcleo mesmo combinadas com outras modificações. O STAT3 que vai para a mitocôndria parece também ser regulado por estas mesmas modificações. Para além disso, estes resultados também indicam que é bastante importante que o resíduo L78 se mantenha intacto durante o funcionamento de STAT3. Esta mutação pode causar grandes alterações no comportamento de STAT3 tanto combinado com ele próprio como com outros mutantes. Estas combinações conseguiram diminuir a formação de dímeros e alterar a distribuição intracelular. Concluindo, há a possibilidade de haver um novo nível da regulação da atividade de STAT3 e, consequentemente, novos alvos terapêuticos. Para além disso, estes resultados revelaram ser importantes para outros complexos de proteínas que também sejam regulados por modificações pós-traducionais. Sendo STAT3 uma proteína envolvida no desenvolvimento, imunidade e em várias doenças, o comportamento destes resíduos estudados e das modificações pós-traducionais podem ter implicações relevantes para o diagnóstico, tratamento e o estudo de uma grande variedade de patologias humanas.STAT3 is a transcription factor involved in many biological functions, such as cell proliferation, differentiation and survival, development and immunity, among others. STAT3 is functional when it dimerizes with itself or with STAT1. These dimers can be phosphorylated and become active, but inactive STAT3 dimers can influence its activity as well. Dysregulation of STAT3 activation initiates, contributes and sustains a variety of human diseases, including cancer. The aim of this project was to study specific residues/domains that had been described to influence STAT3 activity in the literature: K49, L78, K140, R609, K685, Y705, S727 and the SH2 domain. A Venus-STAT3 BiFC system was used in order to study the dimerization and intracellular distribution of STAT3 dimers in unstimulated cells. Asymmetric post-translational modifications change the intracellular distribution of STAT3 homodimers more strikingly than symmetric ones. The symmetric combinations carrying the L78R, R609Q and Y705F mutations were the only ones to affect intracellular distribution. Meanwhile, combinations carrying one or more K-R substitutions affected the nucleocytoplasmic shuttling. The L78 residue is also important for dimerization, mostly when combined with K49 and R609, as well as C-terminal of STAT3. This could mean a new level of regulation of STAT3 activity, and therefore a new possible therapeutic target. These results could be highly relevant for other protein complexes regulated by posttranslational modifications beyond STAT3. Given the essential roles of STAT3 in development, immunity, tissue stress and cancer, our findings could have important implications for the diagnosis, treatment and understanding of a wide spectrum of human pathologies