Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019Os astrócitos são um tipo de células nervosas essenciais para um bom funcionamento do Sistema Nervoso Central (SNC). Normalmente, são responsáveis pela regulação da corrente sanguínea, manutenção da barreira hematoencefálica, fornecimento de energia através dos metabólicos, participação na função e plasticidade sináptica e manutenção do equilíbrio de iões extracelulares, fluidos e transmissores.
Estas células são também os primeiros elementos a responderem após um insulto do SNC. Os astrócitos perante traumas apresentam uma variedade de mecanismos de defesa e um deles e a via do JAK/STAT3. A ativação desta via ocorre durante a astrogliose reativa, um processo pelo qual os astrócitos sofrem grandes alterações, principalmente na expressão dos seus genes, na morfologia e proliferação. Em casos mais graves, a ativação de STAT3 permite a formação da cicatrização glial, uma barreia física que protege as células saudáveis das danificadas e da própria inflamação.
STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) no geral participa em inúmeras funções biológicas em forma de homo-dímero e hetero-dímero (com STAT1, outro membro da família das proteínas STAT). Esta proteína é um fator de transcrição citoplasmático que tem como principal função a regulação da expressão de genes específicos envolvidos no crescimento, sobrevivência e diferenciação celular, assim como no desenvolvimento e na inflamação, entre outros processos biológicos. No entanto, tem sido demonstrado que a desregulação da ativação de STAT3 pode contribuir para o desenvolvimento de várias doenças. Por exemplo, STAT3 aberrante ou constitutivamente ativo está associado a uma grande variedade de cancros e
malignidades hematológicas.
A clássica via de sinalização de STAT3 e a JAK/STAT3. Esta começa quando citocinas ou fatores de crescimento se ligam a recetores permitindo que proteínas como JAK fosforilem o domínio citoplasmático do mesmo. Dímeros de STAT3 são recrutados para o recetor e fosforilados na tirosina na posição 705 também por JAK, ativando-os. Estes dímeros ativos entram para o núcleo e regulam a expressão de genes alvo. Inicialmente pensava-se que a formação de dímeros ocorria apenas depois da ativação de STAT3, ou seja, depois da fosforilação da tirosina 705. No entanto, nos últimos anos tem sido demonstrado que STAT3 encontra-se maioritariamente no citoplasma em forma de dímero não-fosforilado (U-STAT3) em células não estimuladas. Para além disso, dímeros de U-STAT3 conseguem entrar no núcleo e na mitocôndria para regular a atividade transcricional e aumentar a respiração celular, respetivamente. Esta descoberta levantou bastantes questões na comunidade científica pois STAT3 está a revelar ser uma proteína muito mais complexa do que se pensava.
STAT3 apresenta seis domínios, cada um com funções específicas, e é alvo de inúmeras alterações como mutações e modificações pós-traducionais em certos resíduos. Estas alterações são capazes de influenciar o comportamento de STAT3 e, por conseguinte, a sua função. Por esta razão, neste projeto foram estudados vários resíduos. Cinco deles estão relacionados com modificações pós-traducionais: K49, K140, K685, Y705 e S727. K49 pode ser acetilado ou dimetilado, podendo regular positivamente a transcrição de genes e a ligação do STAT3 ao ADN.
A dimetilação de K140 atenua a expressão de um regulador negativo de STAT3. Também ocorre acetilação do resíduo K685 que participa na dimerização e permite amplificar o efeito da fosforilação de Y705. A fosforilação de Y705 é, por sua vez, a modificação pós-traducional mais estudada, pois ela é responsável por ativar STAT3 para a sua função transcricional. Outra fosforilação acontece no resíduo S727 que tanto aumenta o efeito da fosforilação de Y705 ao ajudar na regulação da expressão de genes, como está envolvida na respiração mitocondrial. Para além destes resíduos, ainda foi estudado um resíduo relacionado com adenomas hepatocelulares inflamatórios quando está mutado (L78); outro relacionado com a estabilidade estrutural dos dímeros (R609); e o terminal carboxílico que inclui os dois últimos domínios de STAT3, SH2 e TAD. Para avaliar a contribuição relativa destes resíduos na dimerização e na distribuição intracelular, foram geradas combinações simétricas (com a mesma mutação nos dois monómeros) e assimétricas (com mutações diferentes em cada monómero). Ao longo do projeto foi usado o sistema de complementação bimolecular de fluorescência (BiFC) em células não estimuladas.
Venus foi a proteína fluorescente usada neste sistema. Ambas metades não fluorescentes desta proteína (Venus 1 e Venus 2) foram fundidas com o terminal amínico de STAT3 em dois plasmídeos independentes. Quando duas moléculas de STAT3 dimerizam, as metades de Venus são capazes de interagir diretamente uma com a outra tornando-se numa proteína funcional e emitir fluorescência. O sinal que é emitido é diretamente proporcional à quantidade de dímeros formados.
Na primeira parte deste projeto foi focada a dimerização. Através da técnica de citometria de fluxo, conseguiu-se perceber que esta não foi afetada pelos mutantes simples e duplos (Y705F e S727A) resistentes a fosforilação. No entanto, foi parcialmente diminuída pelo mutante que não apresentava os domínios SH2 e TAD, por um inibidor de STAT3 e pelas combinações assimétricas e simétrica do mutante L78R. Isto significa que a dimerização ocorre independentemente da fosforilação, e que o resíduo L78 e o domínio SH2 apresentam um papel crucial na formação e estabilização da mesma, respetivamente.
Na segunda parte, foi avaliada a distribuição intracelular de STAT3 através da técnica de microscopia de fluorescência. Os resultados obtidos revelaram que os resíduos estudados afetam de maneira diferente a distribuição intracelular de STAT3. K49, Y705 e S727 são os que mais afetam a localização de STAT3. Os mutantes K49R e S727A aumentam a translocação de STAT3 entre o núcleo e o citoplasma apenas quando são combinados assimetricamente. Em contraste, o mutante Y705F aumenta este movimento apenas quando está acoplado com ele próprio. Enquanto que o mutante L78R aumenta a localização nuclear e a formação de agregados com praticamente todas as combinações (simétrica e assimétricas), a combinação simétrica de R609Q aumenta apenas a localização mitocondrial. Por fim, os pares contendo as mutações K140R e K685R apresentam uma tendência de alterar a localização citoplasmática dos dímeros de STAT3 para o núcleo, mas só com um par é que foi significativo. No entanto, vendo noutra perspetiva, as combinações com duas mutações K-R foram as que mais alteraram a translocação entre citoplasma e núcleo. As combinações com apenas uma mutação K-R ou com um mutante resistente à fosforilação conseguiram aumentar a quantidade de STAT3 no núcleo.
Em suma, a ocorrência de diferentes modificações pós-traducionais nos dois monómeros do mesmo dímero influenciam a distribuição intracelular de STAT3, assim como o resíduo L78. Os resultados obtidos sugerem que as modificações pós-traducionais que ocorrem nas lisinas são as que mais regulam a circulação de STAT3 entre o citoplasma e o núcleo mesmo combinadas com outras modificações. O STAT3 que vai para a mitocôndria parece também ser regulado por estas mesmas modificações. Para além disso, estes resultados também indicam que é bastante importante que o resíduo L78 se mantenha intacto durante o funcionamento de STAT3. Esta mutação pode causar grandes alterações no comportamento de STAT3 tanto combinado com ele próprio como com outros mutantes. Estas combinações conseguiram diminuir a formação de dímeros e alterar a distribuição intracelular.
Concluindo, há a possibilidade de haver um novo nível da regulação da atividade de STAT3 e, consequentemente, novos alvos terapêuticos. Para além disso, estes resultados revelaram ser importantes para outros complexos de proteínas que também sejam regulados por modificações pós-traducionais. Sendo STAT3 uma proteína envolvida no desenvolvimento, imunidade e em várias doenças, o comportamento destes resíduos estudados e das modificações pós-traducionais podem ter implicações relevantes para o diagnóstico, tratamento e o estudo de uma grande variedade de patologias humanas.STAT3 is a transcription factor involved in many biological functions, such as cell proliferation, differentiation and survival, development and immunity, among others. STAT3 is functional when it dimerizes with itself or with STAT1. These dimers can be phosphorylated and become active, but inactive STAT3 dimers can influence its activity as well. Dysregulation of STAT3 activation initiates, contributes and sustains a variety of human diseases, including cancer. The aim of this project was to study specific residues/domains that had been described to influence STAT3 activity in the literature: K49, L78, K140, R609, K685, Y705, S727 and the SH2 domain.
A Venus-STAT3 BiFC system was used in order to study the dimerization and intracellular distribution of STAT3 dimers in unstimulated cells. Asymmetric post-translational modifications change the intracellular distribution of STAT3 homodimers more strikingly than symmetric ones.
The symmetric combinations carrying the L78R, R609Q and Y705F mutations were the only ones to affect intracellular distribution. Meanwhile, combinations carrying one or more K-R substitutions affected the nucleocytoplasmic shuttling. The L78 residue is also important for dimerization, mostly when combined with K49 and R609, as well as C-terminal of STAT3. This could mean a new level of regulation of STAT3 activity, and therefore a new possible therapeutic target. These results could be highly relevant for other protein complexes regulated by posttranslational modifications beyond STAT3. Given the essential roles of STAT3 in development, immunity, tissue stress and cancer, our findings could have important implications for the diagnosis, treatment and understanding of a wide spectrum of human pathologies
