The Eph/ephrin gene family in the european Amphioxus: an Evo-Devo approach

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010A Evolução e o Desenvolvimento (Evo-Devo) é uma area da biologia que tem por objectivo o estudo e a interpretação de conhecimentos de ambas as areas de evolução e da biologia do desenvolvimento. Tenta assim, explicar e testar as teorias evolutivas ao nivel morfologico. (David 2001) A transição de invertebados para vertebrados é um marco importante na historia evolutiva das especies. A relação filogenética no Filo Chordata é importante para compreender esta transição. O Filo é constituido de tres subfilos Vertebrata, Cephalocordata e Urochordata. As caracteristicas que os une neste Filo é a presença de uma notocorda, um tubo nervoso dorsal, tubo nervoso dorsal, fendas branquiais, um endostélio e uma cauda pós-anal, em pelo menos uma fase de sua vida. Contudo, a relação filogenética dentro do Filo Chordata foi controversa. No século XIX os urocordados foram colocados na base da filogenia do Filo, estando deste modo, os cefalocordados mais proximos dos vertebrados (Fig.1). No entanto, dados moleculares recentes levaram a reversao destas posições estipulando que os cefalocordados se separam antes, localizando-se basalmente ao grupo Urochordata-Vertebrata (Fig.1) (Delsuc 2006). O Filo Cephalochordata compreende dois generos (Branchiostoma and Epigonichtys). O anfioxo (Branchiostoma floridae - especie americana - Branchiostoma lanceolatum -especie europeia) possede uma faringe com fendas branquiais, uma cauda pos anal, um sistema circulatorio ausente de coração e um sistema excretor rudimentar (Fig.2). Contudo carecem de algumas caracteristicas de vertebrado como as células migratorias da crista neural, um endoesqueleto, um cérebro regionalizado e orgãos sensorias pares. Por apresentar um genoma não duplicado, uma copia unica para a maioria das familias multigenicas dos vertebrados, pelas suas caracteristicas morfologicas e do desenvolvimento transitorias aos vertebrados, pela disponibilidade de ferramentas de manipulação génica e vantagens de manutenção em laboratorio e do genoma de Branchiostoma floridae estar completamente sequenciado, o anfioxo é considerado como sendo um bom organismo modelo para estudar a transição de invertebrado a vertebrado. Em 1987, o primeiro receptor de efrina foi clonado. Os receptors (Eph) e ligandos (efn) de efrinas formam a maior das 14 subfamilias de receptores do tipo tirosina kinase. Estas possuem um dominio extracellular N-terminal que permite a interacção com o ligando; um dominio intracelular com funçao de kinase; um dominio SAM; e um dominio PDZ (Fig.4). Os ligandos estão subdivididos em dois grupos, as efnA que se encontram ancoradas à membrana via GPI (glycosylphosphatidylinositol) e as efn B que estão ancoradas por um dominio transmembranar (Fig.4). Os receptores EphA interagem preferencialemente com as efnA e as EphB com as efnB. Esta interacção ligando-receptor tem um papel crucial em processos celulares como a adesão, comunicação, rearranjos de citoesqueleto, divisão, migração, a activação de vias de sinalização citoplasmaticas que promovem a expressão génica. Deste modo, estão implicados em processos de desenvolvimento como a 5 migração das células da crista neural, segmentação e somitogénese, formação de sinapses e proriedades promotoras de tumores. Os receptores e ligandos de efrinas estão presents em todos os Metazoa (de esponjas a vertebrados) em numero (tab. 1), padrões de expressão e funções distintas. Varias das funções desempenhadas pelas efrinas em vertebrados são também encontradas em invertebrados. Foi sugerido que as funções das efrinas teriam evoluido de desempenhar um papel mais simples em processos cellular, ainda mantido em grupos mais basais na filogenia, para papeis mais versateis e diversificados, como os observados em cordados. Neste projecto propusemos um estudo de Evo-Devo da familia de genes das efrinas, pelo seu importante papel no desenvolvimento e pela sua presença em todas as espécies de Metazoa estudadas até a data, usando como modelo experimental o anfioxo europeu, devido à sua posiçao filogenética e caracteristicas. Com o objecctivo de melhor compreender a historia evolutiva e as funções durante o desenvolvimento deste genes os principais passos desenvolvidos foram: i) anotar e descrever os receptores e ligandos de efrinas em Branchiostoma floridae; ii) clonar e sequênciar os genes de efrina na especie europeia Branchiostoma lanceolatum ; iii) elucidar a relação filogenética da familia génica das efrinas em genomas de Metazoa disponiveis (Tab.1) ; iv) determinar os padroes de expressão, em diversos estadios de desenvolvimento, em ambos ligandos e receptores de efrina em Branchiostoma lanceolatum por hibridação in situ. A relação filogenética dos receptores de efrinas esta descrita na Fig.9 desta dissertação e foi realizada com sequências de proteinas no programa Mega4. Nesta analise pode-se verificar que as Eph de vertebrados agrupam-se monofiléticamente juntas. Os genes de cefalocordados estão basais aos de vertebrados, agrupando-se com os dos não-cordados. As Eph de urocordados formam um grupo polifilético, sugerindo a ocorrência de duplicações independentes nesta linhagem, estando CiEphE, CiEphD e CiEphG mais proximos dos vertebrados. Os receptores de efrina dos Cefalocordados parecem ter divergido mais cedo do que os receptores de efrina de urocordados CiEphE, CiEphD and CiEphG, estando de acordo com a topologia proposta por Delsuc (2006) para o Filo Chordata. Os genes de Nematostella vectensis agrupam-se com o outgrupo Ephydatia fluviatilis, sugerindo que esta especie esteve sujeita a duplicaçoes independentes. A topologia obtida para os ligandos de efrina esta representada na Fig.10. É de notar que os ligandos dos vertebrados formam dois grupos monofiléticos distintos, um que agrupa as efnA e outro as efnB. As efnA de vertebrados parecem estar filogenéticamente mais proximas das efnA de urocordados (CiefnAa, CiefnAb, CiefnAc and CiefnAd) e efnB mais proximas das efn de cefalocordados (Bfefn1, Bfefn2 e Bfefn3). Tal como observado com os receptors, os ligandos dos não-cordados formam um grupo monofilético. O estudo da expressão dos receptores (BlEph1 e BlEph2) e ligandos (Blefn1 e Blefn2) de efrina foi feita pela técnica de hibridação in situ em embriões de Branchiostoma lanceolatum durante varios estadios de desenvolvimento (morulas de 32 celulas até larvas de 60horas). No estadio de morula todos os genes expressam-se no embrião inteiro. 6 Durante a neurulação BlEph1 expressava-se na mesoderme lateral, nos somitos em formação e possivelmente no precursor da vesicular cerebral. Na neurula tardia encontrava-se expresso na notocorda e no tubo neural e na future região oral. No estadio de pré-boca expressava-se na notocorda anterior e posterior, na boca e faringe em formação. No estadio de larva este gene expressava-se na notocorda anterior e posterior, na vesicular cerebral, na boca, no endostélio, na glandula club-shaped, no diverticulum. (Fig.11) Durante a gastrulação, BlEph2 parecia expressar-se em todos os tecidos. Um padrão segmentado parecia aparecer durante a neurulação que parece seguir o padrão dos somitos em formação. No estadio de pré-boca BlEph2 expressava-se na boca em formação e na notocorda anterior. Nas larvas a expressão deste gene parecia localizar-se na boca e na região da faringe. (Fig.12) O padrão de expressão dos ligandos de efrina (Blefn1 e Blefn2) parecia estar de acordo com o padrão observado nos receptores. Em gastrulas Blefn1 expressava-se maioritariamente na mesoderme justo ao blastoporo. Durante a neurulação a expressão era mesodermica, junto ao fecho do tubo neural e também parecia expressar-se em populacões de neuronios. No estadio pré-boca parecia expressar-se na futura região oral, na notocorda posterior e a endoderme posterior. No estado de larva a expressão parecia mais restringida a zona da boca e da faringe, mas ligeiramente expresso nos restantes tecidos, exceptuando a vesicula cerebral. (Fig.13) Durante a gastrulação Blefn2 parecia expressar-se na gastrula inteira. Durante a neurulação a expressão parecia restringida a mesoendoderme, exceptuando o dominio mais posterior. Em embriões pré-boca parecia localizar-se na região da faringe em formação, na glandula de muco e na notocorda posterior. Em larvas a expressão parecia localizar-se na região da boca e da faringe e também na notocorda posterior (Fig.5F). Na literatura esta descrito que as efrinas expressam-se em cordados nas zonas dos somitos em formação, na notocorda, no tubo neural, na mesoderme paraxial e nos nervos perifericos, como demonstrado pelas imagens obtidas por hibridação in situ (Fig.11 a 14). Em vertebrados estes genes também participam na formação de varias estruturas faciais incluido a região oral e os seus padrões de inervação, padrão também observado nos receptores e ligandos de efrinas de Branchiostoma lanceolatum sugerindo a co-opção destes genes para esta função durante o desenvolvimento em Chordados (Fig.11-14). Com este trabalho foi possivel elucidar algumas das questoes sobre a expressão e a posição filogenética dos membros da familia genica das efrinas no anfioxo europeu (Branchiostoma lanceolatum). A estrutura destes genes parece ser conservada desde as esponjas aos vertebrados, mas também as funções desempenhadas durante no desenvolvimento. Entre estes incluem-seos processos a nivel cellular que, ao longo da evolução sofreram fenomenos de complexificação, na transição para cordados. Adicionado a estas observações, a topologia filogenética sugere fenomenos de co-opção para as novas funçoes de duplicações especificas de linhagem. Existem também evidências para convergência evolutiva entre espécies e de evolução paralela dentro da mesma espécie. Os cefalocordados parecem ocupar, relativamente a esta analise, uma posição entre os não-cordados e os vertebrados o que suporta a nova filogenia sugerida por Delsuc et al em 2006. No geral, pode-se sugerir que os genes da familia das efrinas diversificaram varias vezes ao longo da evolução dos 7 Metazoa e também que o ancestral dos urocordados e vertebrados apresentaria um unico receptor de efrina e dois ligandos. Contudo, dados adicionais sobre as funções, padrões de expressão génica e filogenia dos Metazoa seriam necessarios para melhor estabelecer uma relação evolutiva da familia génica das efrinas e o seu papel durante a evolução.The Ephrin receptor and ligand gene families are implicated in several cellular processes such as cellular adhesion, communication, division, migration, and compartmentalization. These play an important role in development including, for instance, neural crest cell migration, somitogenesis, axon guidance, and have even been shown to have tumor promoting properties. They are described to be present from sponges to vertebrates in multiple copies, maintaining a conserved genomic structure. Cephalochordates, recently placed at the base of the Chordata, are considered to be the living animal that best approximates the ancestor at the transition from invertebrates to vertebrates. The phylogenetic analysis of this project shows that Eph and efn families have been independently expanded in amphioxus, vertebrate, and other Metazoan clades suggesting that each have convergently evolved complex Eph/efn complements. In the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum) the Eph/ephrin gene family seems to express mostly in the forming mouth apparatus, somites and notochord, as assessed by whole-mount in situ hybridization (ISH). The Eph/ephrin ISH expression pattern corresponds to some vertebrate characteristics for these genes, but they are also implied in several cellular processes similarly to invertebrates. In spite of the evidence, it is difficult to assess the exact evolutionary relationship and developmental role of these genes in amphioxus with these data, or to extrapolate to Metazoa

Sistema de deteção Timepix e Fitpix na análise de materiais em RBS/C

Mestrado em FísicaEsta tese relata a implementação de um detetor sensível à posição do tipo Timepix num laboratório de feixe de iões para uso com feixe de 1H+ e 4He+ com 2MeV colimado a 0.5mm para uso em Espetroscopia de Retrodispersão de Rutherford (RBS/C). É dada uma descrição completa da metodologia usada para calibração em energia, análise de dados de RBS e sua simulação com o método de Monte Carlo através do programa FLUX. A calibração em energia foi realizada por impulsos internos e a resultante resolução e precisão foram verificadas em dois modos. O primeiro usando uma fonte de partículas alfa composta pelos isótopos 239Pu, 241Am e 244Cm e o segundo usando um espectro de RBS da medida de um filme fino de Au/SiO2/C. Caracterização do sistema de medida para experiências de canalização iónica for realizada com cristais únicos de silício (Si), carboneto de silício (6HSiC) e titanato de estrôncio (SrTiO3). A resolução em energia alcançada foi de 47.2keV para He+ a uma energia de retrodisperção de 1862keV e resolução angular de 0.11 (desvio padrão). Foram alcançadas taxas de contagens até 2kHz com uma velocidade de frame de 15 frames/s. Taxas de contagens mais elevadas são possíveis, no entanto, tem o custo de um aumento do tempo morto do detetor. Não foi encontrado nenhum efeito notável na resolução em energia devido a dano por radiação depois de uma fluência de 7.5 107partículas/cm2.This thesis reports the implementation of a Timepix position sensitive detector in a ion beam facility with a 0.5mm collimated beam of 2MeV 1H+ and 4He+ for use in Rutherford Back-scattering Spectrometry channelling (RBS/C). A complete description is given of the methodology used for energy calibration, RBS data analysis and simulation with the FLUX Monte Carlo simulation program. Energy calibration was performed with internal test pulses and resulting resolution and accuracy were verified in two ways. The first time using a triple alpha source with the isotopes 239Pu, 241Am and 244Cm and secondly using a RBS spectrum of a thin film sample of Au/SiO2/C. Setup characterization for channelling measurements was performed using single crystals of Si, 6H-SiC and SrTiO3. An energy resolution of 47.2keV at 1862keV for He+ and an angular resolution of 0.11 (standard deviation) was achieved. Count rates as high as 2kHz were achieved with a frame rate of 15 frames/s. Higher count rates are possible, however, at the cost of an increase pile-up or increase in the detector dead-time. No radiation damage effect on the energy resolution was perceivable after a fluence of 7.5 107particles/cm2

Track Lab: extensible data acquisition software for fast pixel detectors, online analysis and automation

Fast, incremental evolution of physics instrumentation raises the question of efficient software abstraction and transferability of algorithms across similar technologies. This contribution aims to provide an answer by introducing Track Lab, a modern data acquisition program focusing on extensibility and high performance. Shipping with documented API and more than 20 standard modules, Track Lab allows complex analysis pipelines to be constructed from simple, reusable building blocks. Thanks to multi-threaded infrastructure, data can be clustered, filtered, aggregated and plotted concurrently in real-time. In addition, full hardware support for Timepix2, Timepix3 pixel detectors and embedded photomultiplier systems enables such analysis to be carried out online during data acquisition. Repetitive procedures can be automated with support for motorized stages and X-ray tubes. Freely distributed on 7 popular operating systems and 2 CPU architectures, Track Lab is a versatile tool for high energy physics research.Comment: Proceedings of the 24th International Workshop on Radiation Imaging Detectors (IWORID 2023

Conexão. A (in)visualidade na esgrima

Embora possa parecer surpreendente, o tema desta dissertação é esgrima para pessoas com deficiência visual. Inserindo-se na vertente do design inclusivo, a elaboração desta dissertação teve como ponto de partida a minha experiência como assistente do Mestre de Esgrima Eugénio Roque nas suas aulas piloto de esgrima com espada para pessoas com deficiência visual em Portugal, que se iniciaram no ano de 2014. Na sequência destas aulas, a observação direta fez surgir questões não só sobre a facilidade e a rapidez de aprendizagem dos esgrimistas, como também sobre a facilidade de ensino e comunicação por parte do Mestre. Não pondo em causa a qualidade das aulas, dos alunos, do Mestre e do ambiente, a presente dissertação visa contribuir para o sistema de ensino e a adaptação deste a casos particulares, neste caso a deficiência visual. Deste modo, surgiu a oportunidade de inovar na adaptação de objetos existentes com o propósito de facilitar a aprendizagem, desenvolver a autonomia, melhorar a técnica e a performance do aluno e inovar nas técnicas de ensino que auxiliam os Mestres. O design dos novos equipamentos inclui os seguintes modelos finais: (I) Auxiliar de Postura, (II) Manequim, (III) Ponta de Espada, (IV) Viseira e (V) Pista. Estes constituem um eventual ponto de partida para um futuro desenvolvimento de produto final

Electron Emission Channeling for lattice location of radioactive isotopes in single crystals: Improvements from a Timepix3 quad detector and new PyFDD data analysis software

Electron Emission Channeling (EC) is a powerful technique for the investigation of the lattice location of radioactive isotopes implanted into single crystals. After implantation the isotopes occupy certain lattice locations in the crystal, which can in some cases be altered by annealing. Upon decay, the emission of a charged particle, typically a beta, may result in a channeling trajectory when its starting lattice location is aligned with major symmetry axes or planes of the crystal. By measuring the emission anisotropy in the direction of these axes for distinct annealing temperatures, the lattice location of the isotope can be determined with great precision and insightful information can be obtained on how annealing affects the occupied sites. This work reports on the installation of a Timepix3 quad detector and Katherine Gen2 readout in an experimental setup located at ISOLDE at CERN. The large increase in the number of pixels of the Timepix3, in comparison to previously used pad detectors, required more sophisticated tools for data treatment and fitting of channeling patterns. From this need, the PyFDD software was born. Its latest update features an intuitive graphical interface, with tools for noise masking, pattern visualization, simulations browsing, chi-square or maximum likelihood based fits and gamma background correction.Comment: Submitted to the proceedings of the Channeling 2023 conferenc

Emission Channeling Lattice Location Studies in Semiconductors using Highly Pixellated Timepix Detectors

The implantation of dopant impurities in semiconductor crystals and the understanding of their lattice site location behaviour in the manufacturing process is essential for the control of their electrical, magnetic and optical properties. The development and improvement of the detection systems used in lattice location experimental techniques with charged particles, specifically Rutherford Backscattering Spectrometry with Channeling (RBS/C) and Emission Channeling (EC), has been seen as a fundamental step in the enhancement of the quantitative capacities of these techniques. In this thesis, a highly pixelated timepix-quad detector developed by the Medipix collaboration based at CERN was studied with the aim of testing its performances, envisaging a replacement detector for the previously used pad detector. The new detector was mounted in a custom-built vacuum chamber and annexed to the existing EC experimental setup. The timepix detector causes a large increase in details of measured channeling patterns due to its array of 512 × 512 pixels with 55 × 55 μm² area each, much finer than the one of the pad detector composed of 22 × 22 pixels with 1.3 × 1.3 mm² area. The impact of the new detector on the lattice location results was studied regarding the reduction of the statistical uncertainties and the dispersion of results between axes measured, together with the practical aspects of its use. This purpose required the development of a new fitting software, PyFDD, that can use a chi-square or a maximum likelihood parameter optimization and has proven essential for fitting patterns with a low number of counts per pixel, and for accurately calculating the resulting uncertainties. Additionally, the background of beta and gamma radiation was also investigated as a source of uncertainty. The new analysis software allowed the comparison of the new timepix with the pad detector in the measurement of the isotopes 43K, 24Na, and 27Mg implanted into gallium nitride, GaN. These tests have shown that the results from both detectors agree in the obtained relative lattice site fraction. However, some differences were observed in the absolute fractions which are mostly thought to be caused by the lack of accuracy of the gamma background on EC measurements

Timepix and FitPix detection system for RBS/C materials analysis

This thesis reports the implementation of a Timepix position sensitive detector in a ion beam facility with a 0.5 mm collimated beam of 2MeV 1H$^{+}$ and 4He$^{+}$ for use in Rutherford Back-scattering Spectrometry channeling (RBS/C). A complete description is given of the methodology used for energy calibration, RBS data analysis and simulation with the FLUX Monte Carlo simulation program. Energy calibration was performed with internal test pulses and resulting resolution and accuracy were verified in two ways. The first time using a triple alpha source with the isotopes $^{239}$Pu, $^{241}$Am and $^{244}$Cm and secondly using a RBS spectrum of a thin film sample of Au/SiO$_{2}$/C. Setup characterization for channeling measurements was performed using single crystals of Si, 6H$^{-}$SiC and SrTiO$_{3}$. An energy resolution of 47.2 keV at 1862 keV for He$^{+}$ and an angular resolution of 0.11 (standard deviation) was achieved. Count rates as high as 2kHz were achieved with a frame rate of 15 frames/s. Higher count rates are possible, however, at the cost of an increase pile-up or increase in the detector dead-time. No radiation damage effect on the energy resolution was perceivable after a fluence of $7.5 \times 10^{7}$ particles/cm$^{2}$

Valor potencial de pesquisa de micobactinas para identificação de micobactérias na prática clínica

RESUMO: A produção de micobactinas foi feita utilizando o método em duas etapas do ácido ctilenadiamino-di-o-hidroxifenílacético (EDDHA). Novas propostos de sistemas de solventes foram utilizadas para analisar 17 espécies micobacterianans em cromatografia por camada fina. Todas as espécies do complexo MAIS (incluindo um exemplo de cada serotipo do complexo M. avuium) formaram micobactinas idênticas. De acordo com resultados prévios, cada uma das espécies dos groupos. M. kansasii, M. marinum, e M. terrae, M. gastri,·M.·triviale formaram microbactinas distintas. M. szulgai e M. flavescenes formaram um mesmo padrâo de micobactinas, diferente doqueles encontrados noutras espécies microbacterianas incluindo M. gordonae e M. asiaticum. Em contradição com observações precedentes sobre o complexo M. tuberculosis, as nossas investigações mostraram·diferenças nos padrões de micobactinas entre M. bovis BCG e M. tuberculosis. O método proposto para a produção de micobactinas é compatível com um esquema de identificação micobacteriana. SUMMARY: The ethylenediamine-di-o-hydroxyphenyl-acetic acid (EDDHA) two-step method was used for mycobactin production. New solvant systems were proposed for their analysis by TLC and were used to examine 17 mycobacterial species. All the species tested within the MAIS complex (including one example from each serotype of the M. avium complex) formed identical mycobactins. Result concerning M. kansasii and M. marinam, as well, as. M. terrae, M. gastri and M. triviale were in agreement with the previous findings, i.t each specias formed a distinet mycobactin. M. szulgai and M. flavescens, formed identical mycobactin patterns, differing from those or other mycobacterial species tested including M. gordonae and M. asiaticum. Contrary to previous observations concerning the M. tuberculosis complex, our investigations showed differences between the M.· bovis BCG and M. tuberculosis mycobactin profiles. The method proposed for mycobactin production and detection is directly applicable in classical identification schemes for mycobacteria. Palavaras-chave: Micobactinas, espécies Mycobacterium, Key-words: Mycobactins, Mycobacterium specie