Caracterización del mecanismo responsable de la resistencia a HALOXIFOP-P-METIL y Glifosato en Sorghum halepense

Los herbicidas son una importante herramienta en la producción agrícola para controlar malezas, evitar la erosión del suelo y mantener altos rendimientos. En Argentina, el modelo agro-productivo consolidado en las últimas décadas se basa en el cultivo de soja transgénica tolerante a glifosato (ya sea en monocultivo, o bien, en una rotación con maíz transgénico tolerante al mismo herbicida). Sin embargo, la elevada eficacia combinada con la simplicidad de operación de estos sistemas resultó en el uso excesivo de un pequeño número de herbicidas. Esto trajo como consecuencia inmediata una disminución en la diversidad productiva, una reducción sustancial en la abundancia de numerosas especies de malezas y la evolución de biotipos resistentes. El primer caso de resistencia a herbicidas en Argentina fue detectado en 1996, y al día de la fecha existen 18 especies diferentes que han desarrollado resistencia al menos a un herbicida, ascendiendo este número a 262 especies a nivel mundial. Así, la resistencia a herbicidas en malezas representa hoy uno de los problemas más importantes que enfrentan los sistemas agropecuarios en todo el mundo. El sorgo de Alepo (Sorghum halepense (L.) Persoon) ha sido introducido al país con propósitos forrajeros, pero actualmente es considerada una de las malezas más problemáticas del mundo, causando grandes pérdidas económicas. Es una gramínea C4, perenne y alotetraploide. Sus características la vuelven una especie sumamente competitiva, interfiriendo con los barbechos previos a cultivos primavero-estivales como soja, maíz o girasol. El principal inconveniente que presenta para su control químico eficaz y económico es su carácter de perennidad a través de la formación de rizomas de gran extensión y biomasa, especialmente en condiciones de ausencia de labranza. Este atributo es el que dificulta marcadamente el control mediante tratamientos con herbicidas sistémicos post-emergentes. En este trabajo de tesis se caracterizó la resistencia múltiple a herbicidas inhibidores de la ACCasa y a glifosato de una subpoblación de Sorghum halepense hallada en campos de Gobernador Crespo (GC-R). Los ensayos in vivo con haloxifop-p-metil mostraron que la subpoblación GC-R es altamente resistente con valores de LD50 y GR50 mayores a ocho veces la dosis recomendada a campo. Experimentos de dosis respuesta sobre ciertos individuos seleccionados de esta subpoblación (GC-C4, GC-C6 y GC-C7) permitieron explicar la resistencia observada y justificar los valores de GR50 y LD50 de la subpoblación original. A su vez, los estudios XI moleculares de secuencias nucleotídicas permitieron identificar dos mutaciones en el gen de la ACCasa. Las sustituciones provocadas por estos cambios (I2041N y A2096G) fueron reportadas previamente como responsables de conferir altos niveles de resistencia a varios principios activos de herbicidas del grupo A. Además, se encontró una sustitución no reportada (IXXXXT) sobre el dominio CT de la ACCasa, exclusiva de la subpoblación en estudio, que podría estar implicada en el fenotipo de resistencia. La identificación de nuevos alelos que confieren resistencia resulta de gran interés por su potencial aplicación en el desarrollo de cultivos tolerantes a herbicidas. Por otra parte, los estudios de qPCR realizados indicaron la ausencia de un mecanismo de amplificación génica. Además, no se encontraron evidencias para postular a un mecanismo de resistencia metabólica contribuyendo de manera significativa a la resistencia. Por consiguiente, los resultados obtenidos confirman que la resistencia a haloxifopp-metil de la subpoblación GC-R se debe principalmente a un mecanismo asociado al sitio de acción. Con respecto al glifosato, los estudios de dosis respuesta confirmaron la resistencia de la subpoblación GC-R con un valor de LD50 poco mayor a la dosis recomendada a campo. Sin embargo, la biomasa remanente se vio severamente afectada a dicha dosis. Los estudios moleculares permitieron descartar un mecanismo asociado al sitio de acción (mutaciones en la secuencia y amplificación del gen EPSPS), de acuerdo con lo reportado previamente para esta maleza. La profunda caracterización de los mecanismos de resistencia en la subpoblación GCR, derivó en el desarrollo y optimización de una PCR cuantitativa alelo específica (ASqPCR) que posibilita la identificación rápida y confiable de la relación de alelos mutados respecto a los alelos salvajes en individuos de una especie poliploide con múltiples copias del gen bajo estudio. Finalmente, se logró expresar de manera recombinante y obtener en fase soluble el dominio CT de la ACCasa de Sorghum halepense. La obtención de las distintas versiones alélicas del dominio CT recombinante abre las puertas para su caracterización funcional en presencia de inhibidores y para la exploración de nuevas sustituciones implicadas en la resistencia. Así, la optimización de esta herramienta de análisis representa una estrategia prometedora a fin de evaluar alelos novedosos que puedan encontrarse en poblaciones naturalmente resistentes.Herbicides represent the major weeds control tool for agricultural production. In Argentina, the consolidated agricultural model is mostly based on the use of glyphosate-tolerant soybean (either in monoculture, or in rotation with glyphosate-tolerant corn). The high efficiency combined with the simplicity of these systems resulted in the excessive use of a small number of herbicides, favoring the evolution of resistant weeds. The first case of herbicide resistance in Argentina was detected in 1996, and nowadays there are 18 different species that have evolved resistance to at least one herbicide. Considering that this number rises to 262 species worldwide, herbicide resistance in weeds is today one of the most important problems that agricultural systems are facing. Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Persoon) was introduced as a forage grass into the country, but now is considered one of the most common and troublesome weeds in the world, causing major economic losses. Sorghum halepense is a perennial, tetra-allopolyploid C4 grass. It is highly competitive, interfering with fallows prior to spring-summer crops such as soybean, corn or sunflower. The main drawback that it presents for its effective chemical control is its perennial nature through the formation of large rhizomes, especially in non-tillage systems. This attribute makes johnsongrass very difficult to control through post-emergent applications with systemic herbicides. In this thesis, multiple resistance to glyphosate and herbicides inhibiting ACCase from a subpopulation of Sorghum halepense found in Gobernador Crespo (GC-R) fields was characterized. In vivo tests with haloxyfop-p-methyl showed that GC-R subpopulation was highly resistant, with LD50 and GR50 values greater than eight times the recommended field dose. Molecular studies of nucleotide sequences allowed two mutations in the ACCase gene to be identified. The substitutions caused by these changes (I2041N and A2096G) were previously reported as responsible for conferring high levels of resistance to several active ingredients of group A herbicides. In addition, an unreported substitution (IXXXXT) on the CT domain of the ACCase was exclusively found in the subpopulation under study, which could be involved in the resistance phenotype. The identification of new alleles that confer resistance is of great interest because of their potential application in the development of herbicide-tolerant crops. On the other hand, the qPCR studies carried out indicated the absence of a gene amplification XIII mechanism. In addition, no evidence was found to suspect of an enhanced metabolism significantly contributing to the resistance. Consequently, the results obtained confirm that the haloxyfop-p-methyl resistance of the GC-R subpopulation is mainly associated to a target-site mechanism of action. Regarding glyphosate, dose response studies confirmed the resistance of the GC-R subpopulation with a LD50 value slightly higher than the recommended field dose. However, the remaining biomass was severely affected at that dose. Molecular studies allowed to rule out a target-site resistance mechanism (either mutations in the sequence or amplification of the EPSPS gene), in line with previous reports for this weed. The deep characterization of the resistance mechanisms in the GC-R subpopulation resulted in the development and optimization of an Allele-Specific quantitative PCR (ASqPCR). It enables a rapid and reliable identification of the ratio of mutated to wild-type alleles in individuals of a polyploid species with multiple copies of the gene under study. Finally, it was possible to recombinantly express the CT domain of the Sorghum halepense ACCase. Obtaining the different allelic versions of the recombinant CT domain may allow for its functional characterization in the presence of inhibitors and for the exploration of new substitutions involved in resistance. Thus, the optimization of this analysis tool represents a promising strategy for the study of novel alleles that can be naturally found in resistant populations.Fil: Apellido, Nombre. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaMartinatto, Andrea K.. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentin