Utilização de lisinas de bacteriófagos no controlo de bactérias patogénicas gram-positivas

Tese de mestrado, Biologia (Microbiologia Aplicada), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasAs endolisinas ou, simplesmente, lisinas são hidrolases da parede celular bacteriana, sintetizadas na fase final do ciclo lítico de fagos de DNA de cadeia dupla, cuja acção permite a libertação da progenia viral. Diversos estudos recentes demonstraram que as lisinas quando aplicadas exogenamente a bactérias Gram-positivas, como proteínas recombinantes purificadas, têm a capacidade de degradar o peptidoglicano da parede celular, causando a lise rápida da célula bacteriana. Com este trabalho pretendeu-se inicialmente caracterizar, clonar e expressar lisinas activas contra Staphylococcus aureus e Propionibacterium acnes. Para aumentar a solubilidade destas enzimas produziram-se proteínas truncadas, contendo apenas o domínio catalítico e, lisinas quiméricas em que se conjugaram diferentes domínios catalíticos e motivos de ligação à parede celular de origem heteróloga. As lisinas que demonstraram melhor solubilidade e actividade lítica foram purificadas por cromatografia de afinidade. Estas foram uma lisina truncada (Lys161) contendo apenas o domínio de endopeptidase CHAP da lisina Lys87, especifica para S. aureus, e duas lisinas quiméricas (Lys168- 87 e Lys170-87) contendo, respectivamente, os domínios catalíticos endopeptidase CHAP e de Amidase-2 de lisinas de Enterococcus sp., fundidos ao domínio C-terminal de Lys87 que apresenta os motivos de ligação ao peptidoglicano. A avaliação da actividade lítica das lisinas em isolados bacterianos de meios hospitalares e da comunidade evidenciou um elevado potencial lítico das lisinas quiméricas em mais de 90% das estirpes de S. aureus testadas, incluindo uma elevada fracção destas com resistência à meticilina. Estas quimeras demonstraram também capacidade de lise em estirpes de Enterococcus spp., Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Micrococcus luteus e Bacillus spp. A lisina truncada Lys161, comparativamente, apresentou menor actividade lítica, com redução do espectro lítico. Os resultados obtidos demonstram o potencial das lisinas quiméricas produzidas na eliminação de bactérias patogénicas, incluindo estirpes de S. aureus resistentes à meticilina.Endolysins, or simply lysins, are bacterial cell wall hydrolysing enzymes that are produced at the end of the lytic cycle of double stranded DNA phages, to allow the release of viral progeny. Many recent studies have shown that when applied externally to Gram-positive bacteria, as purified recombinant proteins, lysins are capable of degrading the cell wall peptidoglycan, resulting in a rapid bacterial cell lyses. This study initially aimed the characterization, cloning and expression of lysins targeting Staphylococcus aureus and Propionibacterium acnes. To increase their solubility the enzymes were produced in the form of truncated proteins, which exclusively carried the catalytic domain, and chimerical polypeptides where different catalytic and cell wall binding domains of heterologous origin were fused. The lysins that exhibited higher solubility and lytic activity were purified by affinity chromatography. Specifically, these were a truncated derivative of Lys87 (Lys161), containing only a CHAP peptidase domain acting on S. aureus, and two chimerical lysins (Lys168-87 and Lys170-87) comprising, respectively, the functional CHAP peptidase and amidase-2 domains of Enterococcus sp. lysins fused to the cell wall targeting domain of the S. aureus lysin Lys87. The evaluation of lysin bacteriolytic activity on bacterial clinical isolates from hospital and community samples showed a high lytic potential of chimerical lysins, which were able to lyse more than 90% of the tested S. aureus strains, including a high fraction of methicillin-resistant isolates. These chimeras also displayed lytic activity against strains of Enterococcus spp., Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Micrococcus luteus and Bacillus spp. Truncated lysin Lys161 showed less lytic activity and a narrow spectrum when compared to the chimerical endolysins. Our results demonstrate the potential of chimerical lysins to eliminate pathogenic bacteria, including methicillin-resistant S. aureus strains

Activity of compounds isolated from Carpobrotus edulis on efflux pumps of bacteria and cancer cells

Introdução: A resistência aos antibióticos é um grave problema de saúde quer em Portugal quer a nível mundial. Nos dias de hoje, uma grande percentagem dos isolados clínicos de bactérias Gram-negativas é multi-resistente (MR) e, sempre que estudado, o fenótipo MR é mediado pela sobre-expressão de bombas de efluxo (BE). A sobre-expressão de bombas de efluxo em bactérias resulta da exposição destas a um antibiótico que, por vários processos, lhes confere um fenótipo MR. Contudo, o processo pelo qual a estirpe bacteriana desenvolve resistência durante a terapia com determinado antibiótico, ainda não foi completamente demonstrado em laboratório. Frequentemente, o grau de resistência dos isolados clínicos é muitas vezes superior à dose constante de antibiótico usada na terapia e atingida no plasma do paciente. Entre as Enterobacteriaceae, a principal BE pertence à família RND, na qual a energia necessária ao efluxo provém da força proto-motriz (PMF). Factores do meio envolvente, tais como, cálcio, pH ou glucose (fonte de energia), têm extrema influência nos mecanismos de retenção ou efluxo de compostos pela célula. Contudo, uma vez que o invólucro celular é o primeiro componente bacteriano a enfrentar alterações das condições do meio onde a bactéria se encontra, tais como alteração da pressão hidrostática, osmolaridade ou pressão antibiótica, é essencial compreender a generalidade dos processos envolvidos na aquisição de resistência. Assim, é urgente compreender como é que as condições do meio influenciam a composição da membrana celular e os seus mecanismos de efluxo. A primeira parte desta dissertação estuda o efeito dessas condições na composição da membrana externa e nas respostas celulares. Foi então estudado o efeito do stress provocado quer por aumentos crescentes na concentração de antibiótico, quer por passagens sucessivas da estirpe bacteriana em concentrações constantes de antibiótico, simulando o que acontece no paciente quando submetido a longos períodos de terapia com antibiótico. Moduladores do efluxo podem ser usados em terapia, conjuntamente com os antibióticos, de modo a aumentar o seu efeito terapêutico. A sua utilização começa a seraceite como uma nova abordagem terapêutica contra a multi-resistência. Deste modo a segunda parte desta tese foca a purificação e caracterização de compostos isolados da planta Carpobrotus edulis, cujo extracto metanólico mostrou, anteriormente, inibir BE bacterianas. Uma vez que foi já demonstrado existir uma relação entre BE de bactérias e de células cancerígenas, foi também estudado o efeito inibitório dos compostos purificados num dos transportadores com mais relevância em multi-resistência em células cancerígenas (P-gp). Métodos: Foram utilizados métodos de extracção de proteínas e electroforese para estudar a composição da membrana externa de células bacterianas cujo crescimento ocorreu em dois meios diferentes: sólido e líquido. O efeito da pressão antibiótica na expressão de BEs foi estudada através do crescimento de estirpes bacterianas em concentrações crescentes de antibiótico ou mantendo-as em concentrações de antibiótico constantes por longos períodos de tempo. No final das sucessivas passagens foi estudada a resposta celular a diferentes antibióticos na presença de moduladores de efluxo bem como os níveis de expressão de BEs por RT-PCR em tempo real. O efeito de moduladores de efluxo tais como CCCP, PAβN, verapamil ou fenotiazinas e os efeitos do cálcio, pH e fontes de energia foram estudados pelo método semi-automático que segue a acumulação ou efluxo de brometo de etidium pelas células bacterianas, em tempo real, nas condições aplicadas ao meio do ensaio experimental. O estudo das actividades in vitro dos compostos isolados de C. edulis em relação a estirpes de referência e outras multi-resistentes, que sobre-expressam determinadas BE, foi realizado por determinação das concentrações mínimas inibitórias dos compostos, bem como de outros antibióticos, aos quais as estirpes eram resistentes, na presença do composto. O método semi-automático atrás referido foi também utilizado no estudo destes compostos como moduladores de efluxo. A influência destes compostos na morte de estirpes bacterianas fagocitadas por macrófagos foi também estudada: ensaios ex vivo. Por fim, foi estudada a actividade antiproliferativa dos compostos isolados em linhas celulares cancerígenas bom como a sua capacidade de inibição da P-gp responsável pela multi-resistência nessas linhas celulares. Resultados: Durante este estudo foi observado que em meio líquido há maior expressão de uma proteína com 55kDa em oposição ao que acontece quando a bactéria cresce emmeio sólido. A simulação da resposta bacteriana durante a terapia pelos dois processos descritos, mostrou que a resposta bacteriana é dependente do processo de adaptação seguido. Os resultados desta dissertação sugerem, também, que o efluxo e a acumulação de EB por células de E. coli são dependentes do pH e de energia, os quais influenciam o desempenho da bomba de efluxo AcrAB. Esta BE depende da concentração periplasmática de protões para a sua activação. O efluxo é independente do pH do meio onde as células bacterianas cresceram, contudo, é dependente do pH do ensaio, o que sugere que a bactéria é capaz de se adaptar a diferentes condições do meio tais como pH ou agentes prejudiciais à sua sobrevivência. Devido à sua capacidade quelante, o composto CCCP foi usado a diferentes pH com o objectivo de compreender o papel da concentração protónica e da PMF no efluxo. O uso de CCCP juntamente com variações no pH, possibilitou a identificação dos principais tipos de sistemas de efluxo que respondem às diferentes condições do meio. Contudo, o composto PAβN interfere com o efluxo de EB, por competição com este, pelo sítio activo da bomba de efluxo (um KM para esta competição foi determinado). Os compostos isolados da planta C. edulis foram: ácido oleanólico, β-amirina, uvaol, catequina, epicatequina, MGDG e procianidina B5. Foi observado que estes compostos tinham diferentes actividades consoante o mecanismo de resistência característico de cada uma das estirpes em que a sua actividade foi estudada. Este facto está de acordo com os resultados obtidos para a resposta celular de bactérias, cuja multi-resistência foi obtida por diferentes mecanismos, perante o uso de moduladores. Os resultados obtidos sugerem que, de entre os compostos isolados, o composto uvaol foi o mais activo como modulador da actividade de efluxo, quer em células bacterianas quer em células cancerígenas. Também demonstrou uma actividade significativa contra Staphylococcus aureus intracelular. Conclusão: Uma proteína de 55kDa foi anteriormente descrita como factor de virulência. A mesma proteína encontrava-se menos expressa em bactérias cultivadas na presença de uma fenotiazina, um composto descrito como modulador de efluxo. Deste modo a acção destes compostos como adjuvantes terapêuticos pode dever-se à sua capacidade de reduzir a virulência de determinada estirpe. Deste modo, os resultadosobtidos, quando células bacterianas cresceram em meios líquido e sólido, são extremamente importantes pois podem indicar o motivo pelo qual infecções pelo mesmo organismo, mas por via de diferentes origens alimentares, apresentam diferentes graus de infecção e virulência para o paciente. A adaptação induzida por passagens sucessivas em meio com a mesma concentração de antibiótico sugere a presença de genes “mutantes” cuja actividade possibilita a sobrevivência celular em condições de “stress”, reduzindo o consumo de energia. De outro modo este seria mais elevado devido à sobre-expressão dos sistemas de efluxo, tal como acontece quando a bactéria é sujeita a passagens em concentrações crescentes de antibiótico. Os resultados desta dissertação também sugerem que a activação do efluxo, mediado pela bomba de efluxo AcrAB, é dependente da concentração protónica no periplasma. Assim, quando células de E. coli experimentam condições adversas causadas por agentes tóxicos, o efluxo é efectuado preferencialmente por transportadores do tipo ABC se o pH for maior que 7. O facto de o efluxo ser uma resposta independente do pH a que a estirpe cresceu, mas dependente do pH do meio em que o ensaio está a decorrer, sugere que a bactéria é capaz de se adaptar a diferentes pH do meio, tais como os que encontra durante o processo de infecção. Os mecanismos de efluxo dependentes de energia também variam com o pH. Deste modo a conjugação destes dois factores é muito importante para o estudo e compreensão da fisiologia e dos mecanismos de efluxo. As BEs que pertencem à família ABC têm uma função importante a pH 8, contudo a PMF é fundamental para o efluxo por via dos transportadores da família RND, como observado nos ensaios a pH 5. O uso de compostos que interferem com a PMF ou afectam directamente os sistemas de efluxo tem também um papel relevante no estudo dos mecanismos de efluxo e sua fisiologia. Os resultados obtidos com os compostos purificados da planta C. edulis, sugerem que esta planta contem compostos promissores com actividade antibacteriana e anticancerígena. É importante salientar que a abundância desta planta na orla marítima de Portugal faz com que a produção em larga escala dos seus constituintes seja fácil, o que é um factor essencial no desenvolvimento de quaisquer produtos a usar na prática clínica.Introduction: Resistance to antibiotics and chemotherapy is a major health problem in Portugal and also globally. Nowadays, a significant proportion of clinical Gram-negative isolates are multi-drug resistant (MDR) and whenever studied, the MDR phenotype has been shown to be mediated by over-expressed efflux pumps (EPs). The over-expression of bacterial EPs is known to result from their exposure to one antibiotic that in some manner renders the bacterium with an MDR phenotype. Nevertheless, the process by which the development of an MDR phenotype that occurs during the period the patient is being treated with an antibiotic has yet to be completly demonstrated in the laboratory. Moreover, the degree of resistance of the Gram-negative clinical isolate is often-times many fold greater than the constant concentration used in therapy and reached in the patient plasma. Among Enterobacteriaceae, the major EP belongs to the RND superfamily which is mainly driven by energy coming from the proton motive force (PMF). Environmental factors such as Calcium (Ca2+), pH or glucose (energy source) have major influence in the mechanisms of retention or efflux of compounds by the cell. However, because the cell envelope is the first bacterial cell component to face changes in the environmental conditions such as hydrostatic pressure, osmolarity or antibiotic pressure, it is essential to have an over-view of all the processes involved in the acquisition of resistance. Therefore it is worthy to understand how such environmental conditions influence the outer-membrane composition of the cell and its mechanism of efflux. The first part of this dissertation focuses on the effect of such environmental conditions, on the composition of the outer membrane and the cellular responses It was, then, studied the role of antibiotic-promoted stress via step-wise increasing concentrations of antibiotic or serial passages of the bacterial strain in the same concentration of antibiotic, simulating what happens in the patient when she/he is submitted to long periods of antibiotic therapy. Efflux modulators can be used in therapy together with antibiotics for improvement of antibiotic action. Their use starts to be widely accepted as a new approach for thetherapy of multi-drug resistance. Therefore, the second part of this dissertation focuses on the purification and characterization of compounds purified from the plant Carpobrotus edulis whose methanolic extract had been previously shown to inhibit MDR EPs of bacteria. Because it was previously shown by others the relationship between EP in bacteria and cancer cells, the purified compounds were also studied for their inhibitory activity on one of the major efflux pump transporters of cancer cells (P-gp). Methods: Methods of protein extraction and electrophoresis were employed to assess the composition of the outer membrane after the bacterial cells face two different kind of growth media: solid and liquid. The effect of the antibiotic pressure on the EP expression was studied by growing different bacterial strains under increasing concentration of antibiotic or maintaining them in the same concentration for longer periods of time. The progeny strains were then tested for their response to the antibiotics in the presence of EPI and for their EP expression by real time reverse transcription PCR (rtRT-PCR). The effect of efflux pump modulators such as CCCP, PAβN, verapamil, phenothiazines, and the modulating effects of calcium, pH and energy source were studied by the semi-automated ethidium bromide (EB) method that follows the accumulation or efflux of EB, on a real time manner, by the bacterial cells under the conditions applied to the media. The assessment of C. edulis compounds for in vitro activity against wild type bacterial strains and their counterpart strains that over-produce given EPs was conducted by determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of the purified compounds as well as for other antibiotics of reference for each strain in the presence of the compounds to be tested. The activity of the compounds as efflux modulators were also tested by the semi-automated EB method, already mentioned. The compounds were also assessed for their capacity to increase the killing activity of macrophages infected with bacterial strains: ex vivo activity. Finally, the purified compounds were tested for their antiproliferative effect on cancer cell lines and their capacity to inhibit the P-gp responsible for the multi-drug resistance in those cell lines.Results: During this study it was observed that in liquid medium a greater expression of a 55kDa protein takes place as opposed to Salmonella strains grown in solid medium. The simulation of the response of bacteria to the therapy with antibiotics through the two different adaptation processes showed that the bacterial response is dependent upon the method of adaptation to the antibiotic used. The results of this dissertation also suggest that efflux and accumulation of EB by E. coli strains are dependent on pH and energy that influence the performance of the AcrAB pump. This EP is dependent upon protons present in the periplasm for its activation. The efflux response is independent of the pH of growth of the bacteria whereas it is dependent on the pH of the assay, suggesting that bacteria are able to adapt to different environmental conditions such as pH and presence of noxious agents. Due to its capacity for binding protons, CCCP was used at different pH, in order to understand the role of protons and PMF on the efflux. The use of CCCP together with variations in the pH helped to identify the main types of efflux transporters that respond to the different environmental conditions. However, PAβN modulates efflux of ethidium bromide by competing with it for the site of extrusion of the pump (a KM was determined). Oleanolic acid, β-amyrin, uvaol, catechin, epicatechin, MGDG and procyanidin B5 were the compounds isolated from the plant C. edulis. It was observed that the activity of some of these compounds was differed according to the mechanisms of resistance that characterizes the different strains against which their activity was studied. This is in agreement with the results obtained for the response of the bacterial cell adapted through different mechanisms to the use of efflux modulators. The results suggest that the triterpene uvaol was the most active compound as an efflux modulator in bacteria and cancer cells. It also has significant activity against intracellular Staphylococcus aureus. Conclusion: A 55kDa protein was previously described as a virulence factor. The same protein had less expression when the bacteria were grown in presence of a phenothiazine, a compound described as an efflux modulator. Consequently, the action of these compounds as adjuvants may be due to their capacity to reduce the virulence of the strain. Therefore the results obtained for bacteria grown in solid and liquid mediaare of extreme importance because they can be an evidence for the reasons by which these compounds are described as helper compounds. They can also indicate why infections by the same organism but through different food sources have different degrees of infection and virulence on the patient. Adaptation caused by serial passages in the same concentration of antibiotic suggests the presence of “mutator” genes that allows the cell to survive under stress conditions and reduce energy consumption that would otherwise be higher with the over-expression of efflux systems as occurs when bacteria is exposed to step-wise increasing concentrations of antibiotic. The results of this dissertation also suggest that the AcrAB mediated efflux is dependent upon protons present in the periplasm for their activation. Hence, when E. coli faces stress conditions caused by a noxious agent, its extrusion would be preferentially performed by an ABC type transporter at pH greater than 7. The efflux response is independent on the pH of growth of the bacteria but dependent on the pH of the assay suggesting that bacteria are able to adapt to different conditions such as environmental pH that it has to face during the infection process in the human body. Energy dependent efflux mechanisms vary upon the pH and the conjunction of pH and glucose is an important tool in the study and understanding of the physiology and mechanisms of efflux. Efflux pumps belonging to the ABC superfamily have an important role in efflux at pH 8; however, PMF is essential for RND family mediated efflux as per the results obtained at pH 5. The use of compounds that interfere with the PMF or directly affect the efflux systems has also a relevant role in the study of the efflux mechanisms and their physiology. Based on the results obtained with compounds purified from C. edulis, this plant is a promising source for search of more effective antibacterial, antimycobacterial and anticancer compounds. It is worthy to mention that the extremely easy availability of this plant in the coast of Portugal makes it an outstanding raw material for large scale production of its constituents which is essential for the development of any products to be used in practical medicine

Biofunctional silk-fibroin membranes with antioxidant properties for the treatment of chronic wounds

Atualmente, as feridas crónicas são uma patologia cada vez mais recorrente, apresentando uma maior incidência na população idosa, principalmente quando existem fatores de co-morbilidade, tais como Diabetes Mellitus e doenças cardiovasculares. Nos últimos anos, têm sido propostos novos materiais de penso, incorporando uma diversidade de agentes bioativos para o tratamento de feridas crónicas. Entre os biomateriais naturais propostos, a seda ganhou atenção devido à sua biocompatibilidade, biodegradação, por ser facilmente modificada quimicamente e por possuir boas propriedades mecânicas. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento, otimização, e caracterização de membranas biofuncionais feitas à base de fibroína de seda (SF), com a incorporação de dois agentes antioxidantes (ácido cafeico – CA – e ácido tânico – TA) para o tratamento de feridas crónicas superficiais e consequente regeneração da pele. Através da técnica de solvent casting, seguida de um tratamento térmico, produziram-se membranas estáveis, que foram posteriormente caracterizadas relativamente à morfologia da superfície (SEM e perfilometria ótica), à composição química (FTIR-ATR), perfil de degradação, performance mecânica, análise térmica (TG-DTA), capacidade antioxidante e citocompatibilidade. A degradação foi avaliada pela percentagem de peso perdido pelas amostras. A atividade antioxidante foi avaliada pelo método ABTS. Os testes de citocompatibilidade foram realizados, utilizando a linha celular imortalizada de células de fibroblastos de rato (L929), através do método de contacto direto e dos extratos. Todas as membranas desenvolvidas demonstraram ser transparentes, inodoras, apresentando uma superfície homogénea, ainda que com espessura variável. As imagens de SEM mostraram que todas as membranas apresentavam uma superfície lisa e homogénea, sem rugosidade aparente à escala micrométrica. Através da perfilometria ótica concluiu-se que, à escala nanométrica, a adição de glicerol aumentou a rugosidade da superfície e, através dos ensaios mecânicos, verificou-se que este composto reduziu a rigidez das membranas, tornando-as mais maleáveis. Com as membranas no estado seco, os agentes antioxidantes potencializaram um efeito anti-plasticizante, enquanto, no estado hidratado, a água potencializou o efeito plasticizante do glicerol. As membranas de SF apresentaram uma massa constante ao longo de 15 dias, em PBS, enquanto que as restantes membranas apresentaram uma perda de massa inicial de aproximadamente 30%, após as primeiras 2 horas de incubação, maioritariamente relacionada com libertação de glicerol. Com a presença de Protease XIV, a mesma perda de massa inicial foi observada, aumentando drasticamente após 24 horas de incubação, evidenciando a suscetibilidade da seda para a degradação proteolítica. A resistência térmica da SF diminuiu com a introdução do glicerol nas formulações. À concentração de 0.5% de ambos os agentes antioxidantes essa propriedade foi aumentada e o oposto foi observado na concentração de 1%. As membranas de SF mostraram ter capacidade antioxidante, tendo a adição de 0.5% TA reforçado este efeito. Apenas o extrato puro de 1% TA revelou um efeito citotóxico para as células L929. Todas as restantes membranas não apresentaram citotoxicidade. Este sistema demonstrou ser bastante promissor, reconhecendo a capacidade das membranas de SF para incorporar moléculas antioxidantes e o seu possível potencial no tratamento de feridas crónicas.Nowadays, chronic wounds are an increasingly recurrent pathology, presenting a higher incidence in the elderly population, especially when there are comorbidity factors such as Diabetes Mellitus and cardiovascular diseases. In recent years, new dressing materials incorporating a variety of bioactive agents have been proposed for the treatment of chronic wounds. Among the proposed natural biomaterials, silk gained attention due to its biocompatibility, biodegradation, for being easily chemically modified and due to its good mechanical properties. The objective of this study was the development, optimization, and characterization of biofunctional silk fibroin (SF) based membranes, with the incorporation of two antioxidants agents (AA) (caffeic acid - CA - and tannic acid - TA) for the treatment of superficial chronic wounds and consequent regeneration of the skin. Stable membranes were produced using the technique of solvent casting followed by a thermal treatment, which were characterized regarding surface morphology (SEM and optical profilometry), chemical structure (FTIR-ATR), degradation profile, mechanical performance, TG-DTA, antioxidant capacity and cytocompatibility. The degradation was assessed by obtaining the percentage of weight lost by samples. Antioxidant activity was evaluated by the ABTS method. Cytocompatibility tests were performed using the immortalized cell line of mouse fibroblast cells (L929) by direct contact and extracts tests. All the membranes were transparent, odorless and presented a homogeneous surface, although with variable thickness. SEM images showed that all membranes had a smooth and homogeneous surface, with no apparent roughness at the micrometer scale. Optical profilometry showed that, at the nanoscale, the introduction of glycerol (Gly) in the formulations increased the surface roughness and, the mechanical tests confirmed that this compound reduced the stiffness of the membranes, making them more malleable. With the membranes in the dry state, the AA potentiate an anti-plasticizer effect, while, in the hydrated state, water has potentiated the plasticizer effect of Gly. SF membranes exhibited a constant mass over 15 days in PBS, while the remaining membranes showed an initial weight loss of approximately 30%, after the first 2 hours of incubation, most likely related to Gly release. In the presence of Protease XIV, the same initial weight loss was observed, increasing drastically after 24 hours of incubation, evidencing the susceptibility of the silk to the proteolytic degradation. The thermal resistance of SF decreased with the introduction of Gly. At a concentration of 0.5%, the AA increased this property and the opposite was observed when the concentration raised to 1%. SF membranes showed to have antioxidant capacity, and the addition of 0.5% TA reinforced this effect. The pure 1% TA extract revealed a cytotoxic effect in L929 cells. All other membranes were non-cytotoxic. This system proved to be quite promising, recognizing the ability of SF membranes to incorporate antioxidant molecules and their potential in the treatment of chronic wounds

Optimization of high added-value pigments production by Gordonia alkanivorans strain 1B

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016Com o aumento das restrições mundiais relativas à concentração de enxofre nos combustíveis fósseis, houve necessidade de estudar processos que removessem este composto. O processo implementado e que está ainda em uso é a hidrodessulfurização. No entanto, esta técnica representa elevados custos, devido às condições extremas que usa, nomeadamente, pressão e temperatura elevadas entre outros. Uma alternativa a este processo é a biodessulfurização que utiliza microrganismos como catalisadores, que usam o enxofre que removem, nas suas vias metabólicas. Este processo tem como principais vantagens relativamente à hidrodessulfurização o facto de ser mais ecológico, e de funcionar em condições amenas (temperaturas e pressão mais baixas). No entanto, os custos associados a este processo ainda continuam a ser um dos fatores limitantes à sua aplicação a nível industrial. Assim, têm vindo a ser feitas tentativas no sentido de minimizar os custos associados à biodessulfurização quer pela minimização do valor associado ao processo (meios de cultura, equipamento, fonte de carbono, entre outros), quer pela exploração de produtos resultantes da atividade dos catalisadores(1–5). De entre vários microrganismos capazes de dessulfurizar estão espécies do género Gordonia, como por exemplo, Gordonia alkanivorans estirpe 1B(6). Esta bactéria é aeróbia, gram-positiva e com uma cor rosa/alaranjada e com elevada capacidade de dessulfurização. Recentemente, Silva et al. descreveram a capacidade de produção de pigmentos, nomeadamente carotenoides, por esta estirpe(7). Os carotenoides são usados principalmente como aditivos e corantes (na piscicultura, por exemplo) ou como suplementos nutricionais. Funcionalmente, são responsáveis por proteger as células de stress oxidativo devido à sua capacidade antioxidante e, como tal, estão associados à prevenção de diversos tipos de cancro. Desempenham também outras funções, tais como estabilização da membrana em bactérias, para além de serem responsáveis pela cor de muitos organismos. São portanto compostos com elevado valor económico(8,9). Existem vários estudos que descrevem condições para otimizar/potenciar a produção de carotenoides, sendo que muitos referem a aplicação de condições de stress sobre os microrganismos. A formulação dos meios de cultura (composição em sais), temperatura de crescimento, oxigenação, fonte de carbono, exposição à luz e a diferentes comprimentos de onda de luz são algumas das condições testadas(10–13). Neste contexto, e dando seguimento ao estudo desenvolvido por Silva et al., este trabalho teve como principal objetivo otimizar as condições de cultura da bactéria G. alkanivorans estirpe 1B com o intuito de maximizar a produção de carotenoides(14). Numa primeira fase, sabendo que a estirpe 1B é frutofílica(15), estudou-se qual a influência da combinação de fontes de carbono, nomeadamente da % de glucose numa mistura de glucose-frutose (0-100% glucose) e da concentração de sulfato (7-37 mg.L-1) na produção de carotenoides por esta bactéria. Para isso fizeram-se dois planeamentos experimentais (PEs) baseados na distribuição de Doehlert(16) para os dois fatores acima referidos, em diferentes condições de luz (400 lux de luz e sem luz). As respostas avaliadas nestes PEs foram a produção da biomassa e dos carotenoides totais, após 72 h e 216 h. Baseado nas diferentes respostas obtidas em ambos os PEs, a melhor condição para produção de carotenoides foi com 100% de glucose e concentração de sulfato ≥22 mg.L-1, na presença de luz durante ≥216 h. Estes resultados mostraram que a luz, tempo, glucose e concentração de sulfato têm grande impacto na produção de carotenoides pela estirpe 1B. Tendo por base a importância do tempo para a maior produção de pigmentos. Avaliou-se o comportamento da estirpe 1B durante o seu crescimento ao longo do período de 26 dias para a produção de pigmentos. Deste modo, a estirpe 1B foi cultivada em frasco agitado, com 10 g.L-1 glucose e 22 mg.L-1 sulfato, sob diferentes condições de luz (L0 - escuro, L400 – 400 lux, L3000 – 3000 lux, com fotoperíodo variando entre 3000-7000 lux). Neste ensaio, L400 obteve a maior taxa de crescimento (0.0259 h-1), seguida de L0 (0.0235 h-1) e por fim L3000 (0.0227 h-1). Considerando a produção de biomassa, as culturas com luz obtiveram 4.2 g.L-1, enquanto que a cultura L0 apenas atingiu 3.5 g.L-1. Como esperado, L0 obteve a produção de carotenoides mais baixa de todos os ensaios, com apenas 220 μg (447 μg.gpeso seco -1), contrastando com o valor de 1609 μg (2596 μg.gpeso seco-1) em L400 e 1455 μg (2359 μg.gpeso seco-1) em L3000. Os resultados das culturas com luz foram os mais elevados obtidos com a estirpe 1B descritos até ao momento (0.24 – 0.26%). Este rendimento, foi ainda melhor num ensaio adicional em que a cultura foi mantida a 3000 lux sem fotoperíodo, atingindo um valor de 0.31% (3100 μg. gpeso seco-1), o melhor de entre outras estirpes de Gordonia. No ensaio, sem luz a produção de carotenoides parou assim que terminou a fase exponencial do crescimento da estirpe 1B, enquanto que, no ensaio com luz, mesmo após a fonte de carbono se ter esgotado continuou a existir produção ao longo do tempo. Os diferentes extratos foram também analisados por HPLC de modo a identificar-se os principais tipos de carotenoides produzidos por G. alkanivorans estirpe 1B. Apenas astaxantina e luteína foram identificadas nos extratos, mas estes carotenoides representam apenas uma parte dos pigmentos totais produzidos (entre 37 a 52%), havendo assim ainda muitos carotenoide por identificar. O ensaio ao longo do tempo foi seguido também por citometria de fluxo de forma a avaliar o estado fisiológico das células, visto existirem diversos estudos que apresentam uma relação direta entre stress e aumento de produção de pigmentos. A maior percentagem de células stressadas/mortas foi obtida nas culturas com maior produção de carotenoides (culturas à luz) com 39%/12% e 32%/8% respetivamente, para L400 e L3000. Por outro lado, L0 apenas teve 18%/1% de células stressadas e mortas, no entanto e consequentemente, esta cultura foi a que obteve maior percentagem de células saudáveis 81% vs. 49% em L400 e 60% em L3000. Estes resultados estão assim de acordo com a literatura, no sentido em que existe uma relação entre elevado stress celular e maior produção de carotenoides. De facto, ao sujeitar as células a stress induzido por luz resultou num aumento da produção de carotenoides de 447 μg. gpeso seco-1 para 2359-2596 μg. gpeso seco-1. Considerando as funções e possíveis aplicações dos carotenoides, o último passo passou por testar a atividade antioxidante e antimicrobiana destes extratos. Na atividade antimicrobiana não foram obtidos resultados positivos. Por outro lado, na atividade antioxidante, as amostras estudadas apresentaram resultados positivos. O melhor resultado foi obtido com o extrato da cultura sem luz, que obteve cerca de 3.4% de descoloração de DPPH•. Considerando que esta amostra tinha 478 μg.L-1 de carotenoides e comparando com o padrão de ácido ascórbico de concentração semelhante (500 μg.L-1), este último apenas teve 1.8% de descoloração, quase metade da atividade do extrato. No entanto, devem ser efetuados mais testes utilizando os pigmentos purificados, uma vez que nos extratos podem existir outros compostos que foram simultaneamente extraídos com os pigmentos e que podem influenciar (positiva ou negativamente) a atividade antioxidante observada. Em conclusão, estes resultados apontam para o interesse em explorar a G.alkanivorans estirpe 1B como híper produtora de pigmentos que poderão ser aplicados em diversas indústrias devido ao seu valor elevado como moléculas bioativas. Torna assim real a possibilidade de aplicar estes compostos a diversas industrias dos mais variados sectores, como químico, farmacêutico, alimentar e cosmético. Não esquecendo que a estirpe 1B é conhecida pelo seu grande potencial para dessulfurizar combustíveis fósseis, a exploração simultânea deste produto de valor acrescentado poderá beneficiar, futuramente, o aumento de escala da BDS para uma aplicação nas fases finais de uma refinaria petrolífera, tornando assim o processo mais rentável.The actinomycetes of the genus Gordonia have been continually gaining interest, mainly due to their ability to degrade a variety of xenobiotics, environmental pollutants between others. They also have the capacity of synthesising organic compounds with commercial interest such as carotenoids. Carotenoids are high added-value compounds, due to their wide application especially as colorants, food additives and also, considering some of their characteristics (antioxidant activity, scavenging, photoprotection, between others), they can be used as bioactive products in nutraceutical. Hence, the increasing interest on these valuable bioactive molecules has led to the search of alternatives, more cost-effective and with higher yields, towards their industrial production. In fact, microbial metabolism offers a promising option for pigments production. Herein, Gordonia alkanivorans strain 1B, a known desulfurizing bacterium, is exploited as a high carotenoid-producer microorganism. The main goal of this work was the optimization of the carotenoids production conditions with further identification of the main type of carotenoids present. In this context, two parallel experimental designs (EDs) were carried out, one in the absence of light (ED1 – L0) and the other at approximately 400 lux light (ED2 – L400), to demonstrate the importance of light factor into carotenoids production even in the same growth conditions of C-source and S-source. Therefore, following the Doehlert distribution based surface response methodology, it was evaluated in both EDs the influence of two factors: % of glucose in a mixture glucose + fructose (0-100% glu in 10 g.L-1), and sulfate concentration (7-37 mg.L-1), for two responses assessed (biomass, total carotenoids). Moreover, two different times were studied to evaluate a possible influence of time: 72 and 216 h. Based on the different response surfaces obtained in both EDs, the best combination for carotenoids production by strain 1B was: 100% glucose and a sulfate concentration higher than 22 mg.L-1 in the presence of light for 216 h. Results demonstrated that light, time period, glucose and sulfate content in the culture medium, played an important role towards the highest carotenoids production by strain 1B. Next, the influence of time was studied in more detail, as well as, the influence of light performing an assay without light, with 400 lux and with photoperiod with a basal value of 3000 lux. In terms of growth, the culture with 400 lux had a higher growth rate than the others. The cultures with light had higher biomass (4.2 g.L-1 instead of 3.5 g.L-1). The highest value of carotenoid production described so far by G. alkanivorans strain 1B was achieved with this assay, reaching a value of 1608.6 μg (2596 μg.gDCW-1) in the culture with 400 lux and 21 days of growth. Higher light exposure or lower than the previous resulted in lower yields of carotenoids. An attempt to identify the type of carotenoids present was performed through further HPLC analysis of the different extracts. Only astaxanthin and lutein were identified, and these two pigments corresponded only to a percentage of 37 - 52% of the total carotenoids extracted. This set of assays showed that carotenoid production increased through time in all light conditions, and as so, this is an important factor for this production. A supplementary assay using a stable value of 3000 lux without photoperiod was performed and resulted in the highest yield obtained so far, 0.31%, by a Gordonia species. An evaluation of the cells physiology was made through flow cytometry analysis, considering that there is a set of studies describing the association between stress and carotenoid production. The results showed that the highest carotenoid producers (400 lux and 3000-7000 lux) were the ones with an overall higher population of stressed/dead cells (stressed:39-32% and dead: 8-12%), conversely, without light the healthy population was higher (81% instead of 49-60%), confirming this way the association between stress and carotenoid enhancement. Lastly, considering the described properties of carotenoids, antioxidant and antimicrobial assays were performed. The antimicrobial activity showed no positive results. On the other hand, in the antioxidant activity assay, the extract with higher activity (culture without light) achieved 3.4% of DPPH• (2,2-difenil-1-picril-hidrazilo) discoloration while the standard with similar concentration only had 1.8% of discoloration. Further testing should be performed using the purified pigments, since that in a crude extract other extractives may be present than pigments that can influence (positive or negatively) the overall properties of any bioactive compound present. In conclusion, these promising results point out for the exploitation of G. alkanivorans strain 1B as a possible hyper pigment-producer microorganism that may be applied towards different industries, since carotenoids are valuable bioactive molecules for chemical, pharmaceutical, food and cosmetic sectors. Additionally, since strain 1B is known by its great potential to desulfurize fossil fuels, the simultaneous exploitation of this high added value product produced by this microorganism may benefit a future scale-up of BDS, aiming to its further application downstream of a petroleum refinery towards ultra-low sulfur fuels, turning the overall BDS process more cost-effective

Molecular modelling of ABC transporters: from ATP hydrolysis to substrate transport

Dissertação para a obtenção de grau de doutor em Bioquímica pelo Instituto de Tecnologia Química e Biológica da Universidade Nova de LisboaDespite the great advances that have been made in the past decades in the ABC transporters field, the molecular mechanisms involved in transport across membranes remains largely an enigma. To date, questions regarding the molecular mechanism of transport, nucleotide hydrolysis and inorganic phosphate exit from the binding sites are still unanswered. In this thesis the dynamic behavior of several ABC transporters during the ATP-hydrolytic cycle is investigated using molecular modeling methods. The content of this thesis is compiled in three main scientific publications [1-3], corresponding to sections 3, 4 and 5, respectively. Although these three works are performed in prokaryotic family ABC transporters, it is likely that eukaryotic ones use similar mechanisms for nucleotide hydrolysis, inter-domain communication and allocrite translocation.(...)Esta tese teve o apoio financeiro da FCT e do FSE no âmbito do Quadro Comunitário de Apoio, BD nº SFRH/BD/21433/200

Prognostic modelling of breast cancer patients: a benchmark of predictive models with external validation

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia Electrotécnica e de Computadores – Sistemas Digitais e Percepcionais pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e TecnologiaThere are several clinical prognostic models in the medical field. Prior to clinical use, the outcome models of longitudinal cohort data need to undergo a multi-centre evaluation of their predictive accuracy. This thesis evaluates the possible gain in predictive accuracy in multicentre evaluation of a flexible model with Bayesian regularisation, the (PLANN-ARD), using a reference data set for breast cancer, which comprises 4016 records from patients diagnosed during 1989-93 and reported by the BCCA, Canada, with follow-up of 10 years. The method is compared with the widely used Cox regression model. Both methods were fitted to routinely acquired data from 743 patients diagnosed during 1990-94 at the Christie Hospital, UK, with follow-up of 5 years following surgery. Methodological advances developed to support the external validation of this neural network with clinical data include: imputation of missing data in both the training and validation data sets; and a prognostic index for stratification of patients into risk groups that can be extended to non-linear models. Predictive accuracy was measured empirically with a standard discrimination index, Ctd, and with a calibration measure, using the Hosmer-Lemeshow test statistic. Both Cox regression and the PLANN-ARD model are found to have similar discrimination but the neural network showed marginally better predictive accuracy over the 5-year followup period. In addition, the regularised neural network has the substantial advantage of being suited for making predictions of hazard rates and survival for individual patients. Four different approaches to stratify patients into risk groups are also proposed, each with a different foundation. While it was found that the four methodologies broadly agree, there are important differences between them. Rules sets were extracted and compared for the two stratification methods, the log-rank bootstrap and by direct application of regression trees, and with two rule extraction methodologies, OSRE and CART, respectively. In addition, widely used clinical breast cancer prognostic indexes such as the NPI, TNM and St. Gallen consensus rules, were compared with the proposed prognostic models expressed as regression trees, concluding that the suggested approaches may enhance current practice. Finally, a Web clinical decision support system is proposed for clinical oncologists and for breast cancer patients making prognostic assessments, which is tailored to the particular characteristics of the individual patient. This system comprises three different prognostic modelling methodologies: the NPI, Cox regression modelling and PLANN-ARD. For a given patient, all three models yield a generally consistent but not identical set of prognostic indices that can be analysed together in order to obtain a consensus and so achieve a more robust prognostic assessment of the expected patient outcome

Improving stakeholder engagement in local strategic planning - experience sharing based on Portuguese examples

Participatory local governance refers to any mechanism that promotes the involvement of stakeholders in the public policy decision-making process. It goes from weaker initiatives related to conveying information on policy decisions in more effective means to stronger engaging processes in which stakeholders have an actual influence in the public policy (ranging from planning to implementation, monitoring and evaluating). Current context has triggered a fast dissemination of participatory initiatives, prompted by the expected benefits as increasing local government responsiveness and accountability; getting a better match between policy decisions and beneficiaries’ preferences; acknowledging stakeholders’ expertise; improving confidence on politicians; promoting informal knowledge transfer; reinforcing citizens’ capability to intervene and to commit upon the decisions and contributing to a higher implementation success. Yet, there are also some recognized risks as the prolonged decision-making process, overstated stakeholders’ expectations, privileging some specific groups of civil society, lack of technical skills of stakeholders or the possible biased motivation of local authorities. In this context, the main aim of this paper consists in sharing practice based experience on collaborative local strategic planning, highlighting specific methods that have been put in place by the authors to enhance stakeholders’ engagement, trying to surpass some of the identified risks. This experience was gained through the authors’ participation, as an external and independent expertise team, in three Portuguese participatory processes. By combining several group dynamics and problem solving tools, the methods shared in this paper allowed for the development of local strategic plans, built by stakeholders, ensuring a high commitment with the planned objectives and actions. In two of the tree cases analysed, such plans were used to apply to regional policy instruments of ESF for 2014-2020, having been highly recognized by the Structural Funds managing authorities, thus resulting in the allocation of important funds to local entities, vital for territorial development. An evaluation of the applied methods is provided, envisioned to support future similar initiatives. The collaborative methods have received an encouraging feedback expressed both by the citizen representatives and local authorities, being the quality and diversity of stakeholders and the methodology applied by the expertise team referred as its main strengths. Therefore, these can be considered good practice examples for achieving more effective means of local participatory mechanisms as they support independent debate groups, promote equal participation, knowledge sharing, new ideas and consensus reaching, building on local stakeholders technical skills. In sum, the applied methodologies contribute for a strong involvement of stakeholders and actual influence on public policy decisions.N/

Ulceração Genital Aguda em Jovem

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Infecções Sexualmente Transmissíveis em Homens com 50 Anos ou Mais em Clínica de Doenças Sexualmente Transmissíveis de Lisboa, Portugal

Introduction: Sexually transmitted infections (STIs) are a significant public health problem worldwide. They are more frequent in young men; however the prevalence in older individuals is increasing. The aim of this study was to access the prevalence of STIs diagnosis in men aged 50 years and older. We also aimed to compare the demographic and behavioral characteristics of those diagnosed with STIs and those with non-STI conditions.Methods: We conducted a retrospective study including all men aged 50 years and older who have attended a Sexual Transmitted Diseases (STD) clinic of a central hospital in Lisbon, Portugal, between July 2015 and December 2017.Results: Between July 2015 and December of 2017,  1722 men attended the STD clinic, of which 323 (18.8%) were aged 50 years and older. Out of these 323 men, 137 (41.4%) were diagnosed with a STI, more often anogenital warts (32.9%), genital herpes simplex virus infection (19.7%) and early syphilis (19.0%). The mean age of the patients with a STI was 59.9 years and almost all (90.5%) reported an inconsistent use of a condom (90.5%). The number of men that have sex with men (MSM) was significantly higher in patients with a STI (p = 0,003) than those with a non-STI diagnosis. Additionally, 40 (29.2%) of these STI patients had been previously infected with the human immunodeficiency virus (HIV) and 33 (24.1%) had a past history for syphilis, which were significantly higher than in patients in patients with a non-STI diagnosis (p = 0.015 and p = 0.001, respectively).Conclusion: Existing data on STI has mainly focused younger population with few studies performed in older individuals. Our study reports a large number of men aged 50 years and older that allows a better understanding of this age group. High levels of unsafe sex and previous diagnosis of HIV and syphilis emphasizes the importance of sexual health promotion in older individuals.Introdução: As infeções sexualmente transmissíveis (ISTs) são um problema de saúde pública a nível global. São mais frequentes em jovens do sexo masculino, no entanto verifica-se um aumento da sua prevalência em indivíduos mais velhos. Este estudo teve como objectivo principal analisar a prevalência de ISTs em homens com idade igual ou superior a 50 anos. Também foram comparadas as características demográficas e comportamentais dos doentes com diagnóstico de IST com os doentes com diagnóstico não-IST.Métodos: Realizámos um estudo retrospetivo que incluiu todos os homens com idade igual ou superior a 50 anos que recorreram à Consulta de ISTs do Centro Hospitalar de Lisboa Central, Portugal, entre Julho de 2015 e Dezembro de 2017.Resultados: Entre Julho de 2015 e Dezembro de 2017, na Consulta de ISTs foram observados 1722 indivíduos do sexo masculino, dos quais 323 (18,8%) com idade igual ou superior a 50 anos. Destes 323 homens, 137 (41,4%) tiveram o diagnóstico de IST, mais frequentemente condilomas anogenitais (32,9%), infecção genital por herpes simplex (19,7%) e sífilis recente (19,0%). A idade média dos doentes com IST foi de 59.9 anos e a maioria reportou um uso ocasional de preservativo (90,5%). O número de homens com sexo com homens foi significativamente superior nos doentes com IST (p = 0,003) em relação aos doentes com diagnóstico não-IST. Além disso, 40 (29,2%) dos doentes com IST tinham o diagnóstico prévio de infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (VIH) e 33 (24,1%) tiveram sífilis no passado, ambos em numero significativamente superior que nos doentes com diagnóstico não-IST (p = 0,015 e p = 0,001, respectivamente).Conclusão: Dados atuais sobre ISTs focam-se principalmente na população jovem com escassos estudos efetuados em indivíduos mais velhos. O nosso estudo reporta um elevado número de homens com idade igual ou superior a 50 anos, permitindo uma melhor percepção desta faixa etária. Níveis elevados de ausência de protecção sexual e diagnóstico de VIH enfatizam a importância da promoção da educação sexual em indivíduos mais velhos