Construction of an immunosensor for human cytomegalovirus infection diagnosis

Human Cytomegalovirus (HCMV) is a herpes virus that establish a lifelong latent infection of the host, so once a person is infected, the virus persists in a state of cellular latency. Following primary infection, HCMV is excreted in body fluids and its transmission occurs through mucous contact and exposure to urine, blood transfusion and organ or bone marrow transplant procedures, being extremely difficult to identify the transmission route. HCMV infection induces no overt disease in healthy carriers, owing to effective immune control, but this infection can be severe or even fatal in immunosuppressed individuals, fetuses and newborns. Furthermore, HCMV is also relatively common among women in reproductive age, with seroprevalence ranging from 45 to 100%. The diagnosis of HCMV disease remains controversial because of the difficulty of separating patients who are asymptomatic but shedding HCMV in body fluids, from patients who have the symptomatic disease. Nowadays the most common methods for diagnosis of HCMV infection are: - serological tests based on IgM and IgG detection; - direct free HCMV detection by viral isolation and viral antigens detection in tissue, urine or saliva samples; and - PCR, which is based on amplification of selected segments of the HCMV genome and its hybridization. However, these methods are disadvantageous to be routinely used in clinical diagnosis as point of care because they require a long time to perform or are costly. Thus, there is a need to develop a method which is fast, effective and inexpensive for this virus diagnosis. As an alternative, the use of capture antibodies against the envelope glycoproteins of HCMV open the possibility of faster immunochemical methods. Glycoprotein B of HCMV (gB) is the dominant antigen in the envelope of HCMV, being possible its determination in body fluids like urine and saliva, where viral loads are higher. In consequence, the development of new methods based on the accurate detection of gB in body fluids, is of great interest. In recent years, electrochemical biosensors were widely used to determine various substances with different properties and for continuous monitoring of biological processes. Bioanalytical assays such as immunoassays (IAs), are also very important in many fields. IAs are based on antibodies ability to form complexes with the corresponding antigen, making them highly specific and selective. Thus, electrochemical immunoassays offer enhanced sensitivities and reduced instrumentation costs compared to their counterparts using other transducing elements. Also, screen-printed electrodes (SPE) contribute to develop miniaturized, easy to handle and reliable IAs devices. In addition, SPEs allow for a high-volume production of electrode systems with uniform size and geometry, ensuring measurement reproducibility at low cost. They are also very versatile, since a wide range of designs and materials can be applied in their construction. The present work describes the development of an alternative method for HCMV gB detection and quantification. It is intended the development of an immunosensor to quantify the presence of gB in urine samples. For the construction of this device we made use of a sandwich type immunoassay, wherein HCMV gB is sandwiched between a primary antibody, previously immobilized on a solid surface, and a labelled secondary antibody. Sandwich immunoassays are currently the most commonly and successfully used, mainly due to their high sensitivity and minimized background signal. Moreover, they can be performed on any kind of sensing surface, being the main criterion for these assays the availability of two antibodies with different binding sites on the target antigens. Three different immunoassays were developed. The first one was an electrochemical immunoassay, gB detection was carried out over electrochemical stripping analysis of silver nanoparticles quantitatively deposited on the immunosensor through catalysis by nanogold labels. Capture anti-gB antibodies were absorbed on screen-printed carbon electrodes, and a secondary anti-gB antibody labelled with gold nanoparticles. Nevertheless, the reproducibility of the method (RSDs ≈ 12%) was not very good owing to the random immobilization of the primary antibody on the working electrode, which resulted in small efficiency of antigen detection. Contributing to the low observed RSD was also the nonspecific deposition of silver on the sensor surface. For these reasons, it was decided the development of another approach to overcome the observed limitations. A spectrophotometric magnetic particle-based enzyme immunoassays (mpEIA) was constructed. The use of magnetic beads (MBs) functionalized with protein G (MBs-prG) as solid surface for primary antibody (mAb1) immobilization allows its oriented attachment, resulting in a more effective recognition of gB. Additionally, they improve the affinity interaction thanks to a faster assay kinetics of the dispersed beads in urine samples. The results obtained with this spectrophotometric mpEIA compared favorably to those obtained in other reports of gB detection in terms of analytical performance. Despite the advantages, ELISA readers cannot be applied as portable devices to make in situ measurements. It was then proposed an adaptation to electrochemical transduction on screen-printed electrodes. This variation aimed the achievement of a simple, sensitive, disposable and portable device. It was maintained the immunoassay scheme based on the analyte protein gB sandwiched between the primary monoclonal antibody and the secondary anti-gB-HCMV HRP labelled antibody. Similarly, magnetic particles functionalized with protein G (MBs-prG), were used. The developed immunosensor was shown to be a portable, fast, accurate, rigorous, low cost and an effective method of detecting gB in human urine samples for the valuable diagnosis/screening of HCMV infections.O citomegalovírus humano (HCMV) é o maior vírus da família Herpesviridae e da subfamília β-herpesviridae. Como em todos os vírus herpes, a infeção pelo HCMV resulta no estabelecimento de uma infeção latente ao longo da vida do hospedeiro. Assim, sempre que uma pessoa é infetada, o vírus persiste num estado de latência celular, no qual as células infetadas não produzem nenhuma partícula infeciosa do vírus, mas retêm o seu genoma completo, tendo potencial para começar a produzir partículas virais mais tarde. Após infeção primária, o HCMV é excretado em fluidos corporais, como urina, sangue, saliva, lágrimas, secreções vaginais e cervicais, sêmen e leite materno. Este processo pode durar de meses a anos. Dessa forma, o HCMV pode ser transmitido por via oral, congénita, sexual, através da exposição à urina, por transfusão de sangue e transplante de órgãos ou medula óssea, sendo extremamente difícil identificar a sua via de transmissão. O HCMV é considerado um vírus de paradoxos, pois este pode ser um potencial assassino ou um companheiro silencioso para toda a vida. Isto deve-se ao facto de a infeção pelo HCMV não induzir doença evidente em portadores saudáveis, devido a um controle imunológico efetivo, contudo a infeção pode ser grave e até fatal em indivíduos imunocomprometidos, como é o caso de transplantados, infetados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e aqueles com um sistema imunológico imaturo, como fetos e recém-nascidos. O HCMV também é considerado um dos mais bem-sucedidos parasitas, pois pode ser encontrado tanto em sociedades industrializadas e desenvolvidas como em grupos indígenas isolados, sendo a infeção por este vírus relativamente comum entre mulheres em idade reprodutiva, com seroprevalência variando de 45 a 100%. O diagnóstico da infeção por HCMV permanece controverso, pois é difícil separar os pacientes assintomáticos (mas que excretam HCMV em fluidos corporais) e que poderão vir a necessitar de terapia, de pacientes com doença sintomática (pneumonia ou retinite). Atualmente, os métodos laboratoriais para o diagnóstico da infeção por HCMV podem ser divididos em técnicas sorológicas e virológicas. Os métodos sorológicos são usados principalmente para avaliar os anticorpos do doador ou do recetor em situações de transplante e prever o risco de os pacientes imunocomprometidos virem a desenvolver doença sintomática. Por outro lado, o diagnóstico virológico da doença por HCMV é geralmente baseado no isolamento do vírus por métodos de cultura. Estes métodos podem ser usados mediante a utilização de amostras de sangue, urina, saliva, fezes, lágrimas, leite materno, secreções cervicais e vaginais e sêmen. Os métodos mais comuns para o diagnóstico da infeção por HCMV são então: - testes sorológicos baseados na deteção de IgM e IgG; - a deteção direta de HCMV através de isolamento viral em cultura de fibroblastos e deteção de antigénios virais em amostras de tecido, urina ou saliva; e - PCR, que se baseia na amplificação de fragmentos específicos do genoma do HCMV e sua posterior hibridização. No entanto, estes métodos apresentam alguns inconvenientes na sua aplicação como métodos de triagem em laboratórios de análises clínicas, pois requerem um longo período de tempo até à obtenção de um diagnóstico ou são caros. Assim, existe a necessidade de desenvolver um método que seja rápido, eficaz e barato para o diagnóstico deste vírus, capaz de ser usado em série. Nos últimos anos, os biossensores eletroquímicos foram amplamente utilizados na determinação de variadas substâncias com diferentes propriedades e para a monitorização contínua de processos biológicos. A deteção eletroquímica é usada devido a sua sensibilidade aprimorada e custos de instrumentação reduzidos em comparação com outros métodos de transdução. Para além disto, para desenvolver dispositivos eletroquímicos confiáveis, miniaturizados e gerenciáveis, a tecnologia screen-printing é uma escolha inteligente. Os elétrodos serigrafados (SPE) contribuem para o desenvolvimento de novos biosensores em dispositivos miniaturizados, que apresentam as vantagens acima descritas, permitindo a obtenção de resultados em poucos minutos. Adicionalmente, os SPEs permitem uma produção massiva de sistemas eletródicos com tamanho e geometria uniformes, garantindo reprodutibilidade entre medições a baixo custo. Outra mais-valia destes sensores é o facto de serem descartáveis, o que evita alguns problemas frequentemente associados aos elétrodos tradicionais, como a necessidade de um processo de limpeza. Eles são igualmente bastante versáteis, uma vez que uma ampla gama de designs e materiais podem ser aplicados para na sua construção. Na literatura podemos encontrar relatos do uso de dispositivos de deteção miniaturizados para o reconhecimento eletroquímico de sequências amplificadas de ADN provenientes de HCMV. Num desses trabalhos, baseado em elétrodos serigrafados, o ADN alvo foi adsorvido e hibridado com uma sonda de ADN biotinilada e os híbridos formados foram determinados com estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP). Apesar da amplificação de sinal ter sido conseguida, a atividade do conjugado tem de ser controlada periodicamente devido à estabilidade da enzima. Para superar essa limitação, um outro grupo explorou outra estratégia recorrendo a marcação do ADN com nanopartículas de ouro. Apesar de terem tido melhores resultados, ambos os métodos descritos não descartam a utilização de PCR, o que os torna dispendiosos e inúteis como métodos de triagem. Um sensor piezoelétrico também foi descrito para detetar a glicoproteína do HCMV. Embora a técnica não dependa de ADN amplificado, requer o uso de instrumentação cara. Adicionalmente, um dispositivo de deteção baseado em imunofluorescência foi desenvolvido por outro grupo, aqui a amostra biológica é aplicada sobre uma superfície de ouro revestida com anticorpos específicos para HCMV (se presente em amostras biológicas, o HCMV é aprisionado na superfície deste). Ensaios positivos e negativos eram discriminados pelo uso de uma sonda fluorescente. A principal desvantagem deste dispositivo é a baixa sensibilidade que compromete a sua aplicabilidade em amostras com baixas cargas virais. Recentemente, foi ainda proposto um imunoensaio para a deteção do antígeno pp65 do HCMV utilizando HPR e nanopartículas de Pt-Pd funcionalizadas com single-walled nanohorns de carbono. A abordagem permitiu a deteção rápida de HCMV, no entanto, o uso de elétrodos de carbono vítreo não é uma alternativa prática para um método de triagem. O presente trabalho descreve o desenvolvimento de um método alternativo para a deteção e quantificação de HCMV gB. O objetivo é construir um imunossensor que determine a presença de gB em amostras de urina. O uso de anticorpos de captura contra as glicoproteínas do envelope do HCMV abre a possibilidade para o desenvolvimento de novos métodos de análise imunoquímica. A glicoproteína B do HCMV (gB) é uma glicoproteína viral que desempenha um papel crucial na entrada do vírus na célula e surge durante os estágios iniciais de uma infeção pelo mesmo vírus. A gB também é o antigénio dominante presente no envelope do HCMV, sendo possível a sua determinação em fluídos corporais como a urina e saliva, onde as cargas virais são maiores. Como consequência, o desenvolvimento de novos métodos baseados na deteção de gB em fluídos corporais é de grande interesse. Para a construção dos dispositivos, usamos sempre imunoensaios com configuração em sandwich, pois a gB é colocada entre um anticorpo primário, previamente imobilizado numa superfície sólida, e um anticorpo secundário marcado. Os imunoensaios em sandwich são atualmente os mais frequentemente usados, principalmente devido a sua alta sensibilidade e correspondente minimização de interferências. Para além disto, podem ser realizados em qualquer tipo de superfície, sendo o principal critério destes ensaios a disponibilidade de dois anticorpos com sítios de ligação diferentes para o mesmo antigénio-alvo. Durante o decorrer deste trabalho foram desenvolvidos três imunoensaios diferentes. O primeiro foi um imunoensaio eletroquímico. Foram usados anticorpos de captura anti-gB absorvidos em elétrodos de carbono serigrafados e um anticorpo secundário anti-gB marcado com nanopartículas de ouro. A deteção de gB foi realizada por meio da análise eletroquímica de nanopartículas de prata depositadas quantitativamente no imunossensor através de catálise por nanopartículas de ouro, as quais foram utilizadas como marcadores do anticorpo secundário. A reprodutibilidade do método (RSDs de cerca de 12%) não foi muito boa devido à imobilização aleatória do anticorpo primário no elétrodo de trabalho, o que resultou numa pequena eficiência de deteção do antígeno (foram observados baixos sinais considerando a grande quantidade de anticorpo utilizado). Contribui-o também para a baixa RSD observada a deposição não específica de prata na superfície do sensor. Por estas razões, decidiu-se desenvolver outra abordagem para superar as limitações observadas. Desenvolvemos um imunoensaio enzimático espectrofotométrico baseados em partículas magnéticas (mpEIA). O uso de esferas magnéticas (MBs) funcionalizadas com proteína G (MBs-prG) como superfície sólida para a imobilização do anticorpo primário (mAb1) permite a sua fixação orientada, resultando num reconhecimento mais efetivo do gB. Para além disto, estas partículas melhoram a interação de afinidade graças a uma cinética de análise mais rápida. O anticorpo secundário foi marcado com HRP para possibilitar a deteção espectrofotométrica. Os resultados obtidos com este mpEIA espectrofotométrico são favoravelmente comparáveis com outros relatos de deteção de gB em termos de desempenho analítico. No entanto, apesar das vantagens, os leitores ELISA não podem ser aplicados como dispositivos portáteis para fazer medições in situ. Para superar essa limitação, o método mpEIA mencionado acima foi adaptado à transdução eletroquímica recorrendo ao uso de elétrodos serigrafados. Esta variação visou a obtenção de um dispositivo simples, sensível, descartável e portátil. É mantido o esquema de imunoensaio com base na proteína analítica gB intercalada entre um anticorpo monoclonal primário e o anticorpo secundário anti-gB marcado com HRP, que permite igualmente deteção eletroquímica. Da mesma forma, partículas magnéticas funcionalizadas com proteína G (MBs-prG) são usadas para permitir a imobilização orientada ao anticorpo (mAb1). O imunossensor desenvolvido mostrou ser um método portátil, rápido, preciso, rigoroso, de baixo custo e, portanto, eficaz na deteção de gB em amostras de urina humana para a valiosa triagem de infeções por HCMV

Disposable immunosensor for diagnosis of human cytomegalovirus congenital infection

Human cytomegalovirus is a herpes virus which can cause pneumonia, retinitis, colitis and encephalopathies in immunosuppress individuals, as transplanted ones, persons infected by HIV, and individuals with immature immune system, like fetuses and newborns. In the last ones microcephaly, small body size, hepatomegaly, blindness, deafness and mental retardation can also be observed. This infection is the most frequent cause of embryogenic and fetal pathology induced by a virus. In the actuality, the diagnosis of HCMV is based on clinical and immunologic data. There are several methods for HCMV detection: the virus isolation in fibroblasts culture, the shell-vial method, the PCR technique, the ELISA test and the western blotting technique. However all of them require a long period of time to perform or are costly which is problematic for diagnosis. Therefore, an immunosensor was developed for human cytomegalovirus glycoprotein B detection based on electrochemical stripping analysis of silver nanoparticles. In this sandwich type immunosensor, the silver deposition solution is added to the electrode surface where the gold nanoparticles attached to antibodies, will catalyze the reduction reaction of silver ions, leading to the formation of silver nanoparticles. The higher concentration of analytes means that more amounts of gold nanoparticles are capture on the sensor surface, producing more silver nanoparticles. The silver nanoparticles are dissolved and measured by anodic stripping voltammetry. This method allows a faster and, we expect, a more sensitive way to detect HCMV.O Citomegalovírus humano é um vírus que pode causar pneumonia, renite, colite e encefalopatias em indivíduos immunosuprimidos, como sujeitos transplantados, infectadas com o vírus VIH e com sistema imune imaturo, como fetos e recém-nascidos. Nestes últimos, pode-se observar microcefalia, pequeno tamanho corporal, hepatomegalia, cegueira, surdez e atraso mental. Esta infecção é a causa mais frequente de patologias embriogénicas e fetais induzidas por um vírus. Na infeção aguda por HCMV são gerados anticorpos específicos para um grande número de proteínas estruturais e não estruturais. Embora o vírus codifique mais de 100 proteínas apenas as glicoproteínas B e H induzem anticorpos capazes de neutralizar o vírus e eliminar células infetadas (anticorpos neutralizantes). A glicoproteína B (gB) é o antígeno dominante existente na cápsula de HCMV e aproximadamente 100% dos indivíduos infetados com HCMV desenvolvem anticorpos contra esta proteína. Na glicoproteína B foram identificados três sítios de ligação ao anticorpo: domínio antigénico 1 (AD-1),2 (AD-2) e 3 (AD-3). O domínio AD-2 compreende dois locais, local I (resíduos 68-77) e local II (resíduos 50-54). Dos três domínios, apenas o domínio AD-1 e o local II do domínio AD-2 são capazes de induzir anticorpos neutralizantes do vírus durante a infecção natural. O domínio AD-1 representa o local imunodominante da gB. Na verdade, cerca de 100% dos indivíduos infectados que são seropositivos para gB têm anticorpos contra o domínio AD-1 enquanto o domínio AD-2 é apenas reconhecido por 47%. AD-1 é um domínio estrutural muito complexo, que tem entre 552-635 resíduos de gB. A ligação de anticorpos requer a presença da sequência completa de AD-1 e a formação de uma ligação disulfureto intramolecular entre a cisteína 573 e cisteína 610. Supõe-se que a ligação dos anticorpos a AD-1 não é afectada por glicosilação da gB, uma vez que os anticorpos também reconhecem a proteína não glicosilada. Além disto, enquanto outros domínios da molécula mostram uma variação significativa entre os isolados, o domínio AD-1 parece ser das regiões da gB mais altamente conservada. Assim, o domínio de AD-1 pode ser visto como uma fração promissora a ser usada em testes de diagnóstico para verificar a presença de anticorpos neutralizantes e pode ser utilizado para estabelecer uma relação entre a presença destes anticorpos e a ocorrência de sintomas. Atualmente, o diagnóstico de citomegalovírus humano (HCMV) é baseado em informações clínicas e imunológicas. Existem vários métodos para a deteção de HCMV. O isolamento do vírus em cultura de fibroblastos é o método convencional. Neste, é feito o isolamento do vírus a partir de um tecido de biopsia ou de um fluido corporal, tal como a urina. Após isolamento, o HCMV é replicado “in vitro”, incubado com fibroblastos a 36 °C durante uma a três semanas e posteriormente a incubação é analisada com o objetivo de identificar inclusões de HCMV em fibroblastos. Este método, que requer assepsia total, não é utilizado pois requer um longo período de tempo para sua execução, dificultando assim o diagnóstico. O método “Shell-vial” é muito similar ao anterior, mas o tempo de revelação (feito por imunofluorescência indireta) diminui para 24, 48 ou 72 horas, devido à utilização de anticorpos monoclonais contra diferentes antigénios de HCMV e à utilização de centrifugação que facilita o processo da penetração do vírus em fibroblastos. Outro método alternativo para análise de amostras clínicas é o PCR (Polimerase Chain Reaction). É uma técnica rápida (~ 6h) que apresenta uma elevada sensibilidade, baseada na amplificação seletiva de sequências específicas de ácidos nucleicos, permitindo a detecção de ADN viral. A sensibilidade e especificidade deste método é semelhante ao método de isolamento viral, mas o PCR apresenta algumas vantagens, tais como a velocidade de obtenção do resultado e a possibilidade de uso de amostras congeladas. Esta técnica é bastante utilizada apesar do seu custo elevado e dificuldade de realização. Pode ser utilizada tanto qualitativamente (diagnóstico por PCR) como quantitativamente através da medição da carga viral, que é proporcional ao nível de ADN de HCMV. Outra técnica é a de ELISA (Enzime-Linked Immunosorbent Assay), esta apresenta uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 86% na deteção de anticorpos no sangue. No entanto, existe a possibilidade de resultados falso-positivos, causados por reações cruzadas com algum vírus da família Herpesviridae, fator reumatóide e anticorpos antinucleares. Finalmente, outro método que pode ser usado para a deteção é o “Western Blotting”, que permite a medida da afinidade do anticorpo para o antigénio. No entanto, este método também apresenta uma disponibilidade comercial questionável, porque igualmente alguns resultados falso-positivos podem ser observados. Como descrito, todas estas técnicas de ensaio envolvem, por vezes, ou equipamentos caros e/ou procedimentos igualmente caros, demorados, complicados e conducentes a falsopositivos. As células eletroquímicas são de grande interesse na análise de substâncias devido à sua robustez, fabrico fácil e económico. Uma das técnicas mais utilizadas no fabrico dos elétrodos que se utilizam nas células eletroquímicas é a serigrafia. Esta técnica permite construir sensores químicos com uma alta reprodutibilidade e uma infraestrutura mínima. A serigrafia é um método de impressão direta, também denominado de impressão por penetração. A deposição de tintas é realizada por camadas sobre um substrato. A qualidade dos sensores químicos assim fabricados depende, em grande medida, dos materiais utilizados. Mediante a tecnologia de elétrodos serigrafados, é possível a miniaturização dos sensores, que oferecem a vantagem de terem baixo custo, serem versáteis, poderem ser fabricados com configurações de elétrodo distintas e com diferentes tintas. Devido às suas características, esta tecnologia ajusta-se bem à produção em massa de elétrodos descartáveis. Para aumentar a seletividade dos elétrodos, estes são modificados por diferentes métodos, por exemplo imobilizando uma substância na sua superfície. O método de imobilização é muito importante pois influencia o tempo de vida do sensor e a sua sensibilidade. Existem diferentes tipos de imobilização, designadamente: adsorção, aprisionamento, reticulação e ligação covalente. O dispositivo desenvolvido neste trabalho, através da sua simplicidade, baixo custo e tempo de análise relativamente curto, tem como objectivo superar todas as desvantagens referidas anteriormente para as técnicas de diagnóstico normalmente utilizadas, pois combina as vantagens dos dispositivos electródicos com o uso de anticorpos específicos para a detecção de glicoproteína B. Neste trabalho, desenvolveu-se um immunosensor do tipo sandwich. Neste é adicionada uma solução de deposição de prata à superfície onde, os anticorpos marcados com nanopartículas de ouro irão catalisar a reacção de redução dos iões de prata, levando a formação de nanopartículas de prata. Uma maior concentração de analito significa que uma maior quantidade de nanopartículas de ouro serão capturadas na superfície do eléctrodo que, por sua vez, irão levar à produção de mais nanopartículas de prata. As nanopartículas de prata são depois dissolvidas e medidas por voltametria de redissolução anódica. Este método permite uma forma mais rápida, económica e sensível para a detecção de glicoproteína B

Evaluación de tres programas de vacunación contra laringotraqueitis infeccciosa aviar usando dos vacunas vectorizadas en pollos de carne

El objetivo del estudio fue evaluar la protección conferida por tres programas de vacunación contra Laringotraqueítis infecciosa (LTI) en pollos de engorde usando dos vacunas comerciales recombinantes. Se utilizaron 288 pollos machos de la línea Ross 308 de 1 día de edad, que fueron distribuidos en cuatro grupos de 72 animales con tres repeticiones de 24 aves por grupo. El grupo A fue vacunado al primer día de edad por vía subcutánea con la vacuna recombinante comercial del virus de viruela aviar que expresa el gen de la glicoproteína B del virus de laringotraqueítis infecciosa aviar (VLTI), el grupo B fue vacunado simultáneamente al día 14 con una vacuna inactivada por vía subcutánea más una vacuna recombinante comercial del virus de viruela aviar que expresa el gen de la glicoproteína B del VLTI aplicada por punción alar, el grupo C fue vacunado al día 1 de edad por vía subcutánea con una vacuna recombinante comercial de herpesvirus de pavo (HVT) asociado a células que expresa los genes de las glicoproteínas I y D del VLTI y, el grupo D no fue vacunado. A los 35 días de edad todas las aves fueron desafiadas con una cepa del VLTI con un título de 107 DIE50. Post desafío las aves sin vacuna presentaron mayor severidad de signos respiratorios que las vacunadas (p0.05) entre grupos, sin embargo el grupo C mostró una mejor tendencia respecto de los demás grupos. Las dos vacunas vectorizadas indujeron una protección parcial contra la enfermedad, obteniéndose la mejor protección contra Laringotraqueítis en las aves vacunadas con la vacuna recombinante HVT que expresa los genes de las glicoproteínas I y D del VLTI. Palabras claves: Laringotraqueítis, vacunación, recombinanteTesi

"Citomegalovirus" congénito: análisis de los genotipos virales

Citomegalovirus humano (CMVh) infecta a muchos tipos de células dando lugar a un rango diverso de manifestaciones clínicas sugiriendo que la evolución clínica puede estar relacionada con la variación genética entre las cepas y la respuesta inmune del hospedador. Las técnicas diagnósticas utilizadas en la actualidad no nos permiten identificar que pacientes infectados desarrollarán secuelas; sin embargo, la evidencia disponible hasta la fecha sugiere que tanto los factores del hospedador y factores virales como la inmunidad maternal, la carga viral en el líquido amniótico o el tipo de cepa de CMVh, pueden contribuir a la evolución de la infección congénita, siendo recientemente la carga viral propuesta como un buen marcador predictivo y pronóstico de la severidad de la enfermedad especialmente de la pérdida auditiva y las manifestaciones sistémicas, pero aún se desconoce que genes influyen en las cargas virales. Aproximadamente veinte Open Read Fragments han demostrado exhibir variabilidad nucleotídica en diversos estudios estableciendo la existencia de diferentes grupos o genotipos. Si esta variabilidad contribuye a la evolución de la infección por CMVh en general y a la infección congénita en particular, está actualmente en pleno debate. HIPÓTESIS: El estudio de los diferentes genotipos de las diferentes genes que codifican las proteínas de la envoltura como gB, gH, y el homólogo del receptor del factor de necrosis tumoral UL144, y su correlación con la severidad y curso clínico de la infección, nos ayudarán a establecer qué marcadores de virulencia deben ser monitorizados con fines pronósticos, y a la adecuación de la duración del tratamiento antiviral cuando esté indicado..

Molecular profile of human cytomegalovirus in bone marrow transplant recipients with active infection

Orientador: Sandra Cecilia Botelho CostaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: O Citomegalovírus Humano (HCMV) continua sendo uma causa significante de morbidade em pacientes imunocomprometidos, especialmente em transplantados de medula óssea, e pode manifestar diversas complicações que incluem hepatite, doença gastrointestinal e pneumonia intersticial ou a denominada "Síndrome Viral por HCMV"caracterizada por febre, leucopenia e trombocitopenia. O HCMV pode também ter um efeito imuno-modulador, fazendo da infecção por esse vírus um fator de risco importante para o desenvolvimento de rejeição ao enxerto aguda e crônica e para co-infecção com outras herpesviroses. A detecção do genoma do HCMV pela PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é específica e sensível, e pode ser usada como uma poderosa ferramenta para o diagnóstico precoce da infecção causada por este vírus. Variações em regiões funcionalmente relevantes do genoma do HCMV têm sido utilizadas como marcadores genéticos em diversos estudos clínicos para diferenciar as linhagens do vírus e associá-las com a patogênese viral e com as manifestações clínicas no paciente. A glicoproteína B (gB) é a maior glicoproteína do envelope do HCMV e tem sido relacionada à entrada na célula hospedeira, transmissão célula-a-célula, e conseqüentemente à fusão das células infectadas. A amplificação do gene gB pela PCR combinada com análise de restrição por RFLP em regiões polimórficas deste gene são eficientes para a identificação dos genótipos do HCMV, tornando possível a distinção de pelo menos 4 padrões eletroforéticos. Por outro lado, a determinação da carga viral em pacientes imunologicamente afetados tem sido associada como marcador ou preditor do desenvolvimento de doença por HCMV órgão-específica. Sendo assim, a determinação da carga viral, especificamente nestes pacientes, é fundamental para a supervisão da terapia antiviral. Além disso, os valores da carga viral estão relacionados aos níveis de imunossupressão, à patogênese do HCMV e ao grupo de pacientes e/ou ao tipo de transplante e podem indicar o início da administração da terapia antiviral.O método de real-time PCR (RT-PCR) foi aplicado para a quantificação do genoma do HCMV em amostras clínicas e a detecção e posterior quantificação do DNA do HCMV em amostras de soro por esta técnica é capaz de distinguir entre pacientes com infecções sintomáticas daqueles com infecções inativas ou latente.Avanços têm sido feitos na prevenção da doença por HCMV após o transplante de medula óssea, inclusive a administração profilática, por períodos prolongados, de antivirais como o Acyclovir e o Ganciclovir e como conseqüência, pode originar linhagens resistentes relacionadas principalmente a dois genes virais: a fosfotransferase viral (UL97) e a DNA polimerase viral (UL54). Sabendo-se da importância da identificação das linhagens do HCMV em pacientes transplantados de medula óssea e da possível relação com a infecção e apresentação clínica; da relevância em determinar a carga viral como preditor de doença; e finalmente, da detecção de linhagens resistentes aos agentes antivirais disponíveis, este estudo avaliou, prospectivamente, pacientes transplantados de medula óssea em seguimento no Hemocentro/UNICAMP. Além disso, teve como principais objetivos: determinar a prevalência dos genótipos do HCMV e avaliar uma possível associação com a apresentação clínica nesses pacientes; determinar a carga viral para o monitoramento da terapia antiviral; e identificar e correlacionar mutações que conferem resistência ao Ganciclovir com carga viral e apresentação clínica. Foram incluídas na casuística, 169 amostras de DNA de sangue periférico e 187 amostras de DNA de soro de 22 pacientes transplantados de medula óssea. Dentre as 47 amostras de DNA de sangue periférico HCMV positivas, 42 foram genotipadas e observamos a prevalência do genótipo gB1 (47%) como descrito em literatura, e embora sem comprovação estatística, notamos a tendência deste genótipo com melhor prognóstico. Aplicamos a RT-PCR em 96 amostras de DNA de soro de 12 pacientes transplantados de medula óssea seguidos no Ambulatório de Hematologia, e observamos que o método é adequado para a avaliação da carga viral neste grupo de pacientes. No entanto, é necessário estabelecer um valor de corte a fim de se utilizar esta metodologia para obtenção de um valor que seja preditivo de doença e para o monitoramento do tratamento dos pacientes. Este método mostrou-se mais preciso que a ?nested?-PCR no mesmo tipo de amostra. Além disso, identificamos 8 novas mutações no gene UL97, uma delas pode estar relacionada à resistência viral ao Ganciclovir. Dentre os polimorfismos identificados, 3 parecem estar relacionados ao genótipo gB1 e possivelmente podem ser utilizadas como marcadores genéticos para a genotipagem do HCMV. Para o gene UL54 foram identificadas 5 novas mutações na região IV do gene e que geralmente é relacionada à resistência ao Ganciclovir. Nós concluímos que a determinação da carga viral é importante, mas não é o único modo de avaliar a eficiência do tratamento antiviral. Dessa forma, a avaliação de outros parâmetros moleculares, como a genotipagem e mutações relacionadas à resistência aos antivirais, são informações complementares e devem ser consideradas para o monitoramento da evolução clínica em pacientes transplantados de medula ósseaAbstract: Human Cytomegalovirus (HCMV) remains a significant cause of morbidity in immunocompromised patients, especially in bone marrow transplant recipients. It may manifest severe complications including hepatitis, gastrointestinal disease, and interstitial pneumonitis or as so-called ?HCMV viral syndrome? with fever, leukopenia, and thrombocytopenia. The HCMV may also has an immunomodulatory effect, potentially making HCMV infection an important risk factor for the development of an acute and chronic allograft rejection and for coinfection with other herpesviruses. The detection of the HCMV genome by PCR (Polymerase Chain Reaction) is specific and sensitive. Besides this, it can be used as a powerful tool for the early diagnoses of the infection caused by this virus. Variations in functionally relevant areas of the HCMV genome have been used as genetic markers in numerous clinical studies to differentiate the HCMV strains and to associate them with the viral pathogenesis further with the patients? clinical manifestations. The glycoprotein B (gB) is the major glycoprotein of HCMV?s envelope and it has been implicated in host cell entry, cell-to-cell virus transmission, consequently in the fusion of infected cells. The gB amplification by PCR combined with the restriction analysis by RFLP in polymorphic areas are effective for the identification of the HCMV genotypes, becoming possible the distinction of at least 4 electrophoretic patterns. On the other hand, the determination of the viral load in the immunologically affected patients has been associated as marker or predictor for the development of the organ specific disease by the HCMV. Hence, the determination of the viral load in these specific patients is fundamental for the management of the antiviral therapy. In addition, the viral load values are related to levels of the immune-suppression, the pathogenesis of the HCMV and the group of patients and/or the type of transplant. Furthermore, the viral load values can indicate the beginning of the antiviral therapy administration. A real-time PCR (RT-PCR) assay was applied for quantifying the HCMV genome load in clinical samples and the detection and quantification of HCMV DNA in blood serum through RT-PCR are able to distinguish patients with symptomatic infections among those with latent or inactive infections. Advances have been made in the prevention of HCMV disease after bone marrow transplantation, including prophylactic administration of antivirals such as Acyclovir and Ganciclovir. The HCMV prophylaxis with antiviral in this patients? group is administered for prolonged periods of therapy, consequently it can originate resistant viruses related mainly to two genes: the viral phosphotransferase (UL97) and the viral DNA polymerase (UL54). Ahead the importance of the identification of HCMV strains in bone marrow transplant patients, the HCMV strains performance in the patients? infection and clinical presentation, the relevance of determinating the viral load as a disease predictor, and finally, the detection of the resistant strains to the available antivirals, this study prospectively evaluated bone marrow transplant recipients followed at Hemocentro/UNICAMP. Moreover, it had as main goals: to determine the prevalence of the HCMV gB genotypes, to evaluate a possible gB genotype association with the patients? clinical presentation; to determinate the viral load for monitoring the antiviral therapy, and to correlate Ganciclovir resistant mutations in UL97 and UL54 gene with the viral load and patients? clinical presentation. From 22 bone marrow transplant recipients, DNA samples of peripheral blood (169) and DNA samples of blood serum (187) were included in this casuistic. Among 47 HCMV positive samples, 42 were genotyped. We observed the prevalence of gB1 genotype (47%), as described in the specific literature, however without statistical analysis, the raw data exhibited that gB1 genotype can be related to patients? better prognostics. From 12 followed bone marrow transplant recipients, we applied the RT-PCR in 96 DNA blood serum samples and we observed that the method was accurate for the viral load evaluation in this patients? group. However, it is necessary to establish a crucial cutoff to consider whether a specific value of viral load is a predictive value to cause HCMV disease and to monitor the patients? treatment. This method was more precise than the nested-PCR for blood serum samples. Additionally, we identified 8 new mutations in UL97 gene, one of them can be related to Ganciclovir HCMV resistance. Among all of identified polymorphisms, 3 of them can be related to gB1 genotype and may be used as genetic marker to HCMV genotyping. In the region IV of the UL54 gene, 5 new mutations were identified, and can possibly be related to Ganciclovir HCMV resistance. We concluded that the determination of the patients? viral load is crucial, even so it is not the only way to evaluate the antiviral treatment efficacy. Then, the evaluation of other molecular parameters as genotyping and mutations related to the HCMV antiviral resistance, are complementary information and must be considered to monitor the clinical evolution of bone marrow transplant recipientsDoutoradoCiencias BasicasDoutor em Clínica Médic

Experiência Profissionalizante na Vertente de Farmácia Comunitária e Investigação

A presente dissertação apresenta, no Capítulo 1, o trabalho desenvolvido na componente de Investigação e, no Capítulo 2, os conhecimentos e competências adquiridos durante o estágio em Farmácia Comunitária, realizado na Farmácia São João, Covilhã, e pretende ser o trabalho final para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Citomegalovírus é um vírus DNA de cadeia dupla, o maior e o mais complexo vírus da família Herpesviridae sendo considerado um dos agentes infeciosos mais perigosos em indivíduos imunocomprometidos, no recém-nascido e na mulher grávida. Constitui a principal causa de infeção congénita provocando malformações no feto e recém-nascido e constituindo um problema de saúde pública. Após a infeção primária o vírus tem a capacidade de permanecer no organismo do hospedeiro de forma latente, reativando depois sem razão aparente específica e podendo causar manifestações clínicas sintomáticas e recorrentes. O diagnóstico da infeção por CMV é feito por técnicas virológicas e moleculares para deteção direta da presença do vírus, ou por metodologias serológicas que detetam uma resposta imune específica do hospedeiro. No entanto, os métodos de diagnóstico disponíveis são, muitas vezes, complexos, demorados e dispendiosos, dificultando a sua utilização em larga escala e como métodos de rastreio. Torna-se, então, importante o desenvolvimento de um método rápido e eficiente, de baixo custo e com a possibilidade de adaptação a sistemas de “point-of-care”, que permita o diagnóstico da infeção por CMV, e uma abordagem efetiva para a prevenção e tratamento das doenças associadas. Nesse sentido, um grupo de investigação da UBI desenvolveu um imunossensor eletroquímico descartável, cujo princípio de funcionamento é um imunoensaio do tipo mpEIA “sandwich” utilizando anticorpos específicos contra a glicoproteína B de CMV. No trabalho de investigação apresentado no capítulo 1, pretende-se iniciar a segunda fase de validação do imunossensor, avaliando a sua aplicabilidade a amostras biológicas. As amostras biológicas utilizadas foram previamente analisadas em laboratório clínico para pesquisa de DNA de CMV por RT-PCR, sendo conhecido o resultado relativamente à presença ou ausência de CMV. O ensaio experimental realizado foi a metodologia mpEIA “sandwich”, que está na base de desenvolvimento do imunossensor. Os resultados obtidos permitem esboçar valores de “cut-off”, sensibilidade e especificidade para a técnica. A farmácia Comunitária, pela sua fácil acessibilidade à população em geral e pela formação e qualificação dos seus colaboradores, é um local privilegiado para a prestação de cuidados de saúde contribuindo, de uma forma ativa, para a melhoria da qualidade de vida das populações que servem. O Farmacêutico Comunitário é um profissional de saúde dotado de conhecimentos técnico-científicos que lhe permitem estabelecer a ligação medicamento-utente de forma responsável e profissional, intervindo ativamente na sensibilização para o uso correto e racional dos medicamentos e outros produtos de saúde, assegurando a sua eficácia e segurança, e garantindo a máxima qualidade em todos os serviços que presta. Por forma a permitir que o farmacêutico comunitário desempenhe com rigor e qualidade as suas funções, a farmácia deve possuir uma estrutura adequada tanto ao nível das instalações e equipamentos como no que diz respeito aos recursos humanos e científicos, sistema informático e fontes de informação. Disso se dará conta no Capítulo 2, bem como das atividades desenvolvidas e dos conhecimentos e competências adquiridos no decurso do estágio em farmácia comunitária.This dissertation presents, in Chapter 1, the work developed at the research component and, in Chapter 2, the knowledge and skills acquired during the internship in Community Pharmacy held at Farmácia São João, Covilhã, and intends to be the final work to obtain the Master's degree in Pharmaceutical Sciences. Cytomegalovirus is a double-stranded DNA virus, being the largest and most complex virus of the Herpesviridae family and is considered one of the most dangerous infectious agents in immunocompromised individuals, newborns and pregnant women. It is the main cause of congenital infection causing malformations in the fetus and newborn constituting a public health problem. After primary infection, the virus has the ability to remain in the host organism latently, reactivating afterwards for no apparent specific reason and causing symptomatic and recurrent clinical manifestations. The diagnosis of CMV infection is made by virological and molecular techniques for the direct detection of virus presence, or by serological methodologies that detect a specific host immune response. However, the diagnostic methods available are often complex, time-consuming and expensive, making it difficult to use on a large scale and as screening methods. It is therefore important to develop a fast and efficient, low-cost method with the possibility of adapting to point-of-care systems, which allows the diagnosis of CMV infection, and an effective approach to the prevention and treatment of diseases associated with CMV. In this sense, a research group from UBI developed a disposable electrochemical immunosensor, operating under the principle of a sandwich mpEIA immunoassay using specific antibodies against CMV glycoprotein B. In the present research work, it is intended to proceed to the second phase of validation of the immunosensor, evaluating its applicability to biological samples. The biological samples used were previously analyzed in a clinical laboratory to search for CMV DNA by RT-PCR, the result being known regarding the presence or absence of CMV. The experimental test carried out was the sandwich mpEIA methodology, which is the basis for the development of the immunosensor. The results obtained allow to determine cutoff values, sensitivity and specificity for the technique. The Community Pharmacy, due to its easy accessibility to the general population and the training and qualification of its employees, is a privileged place for the provision of health care, actively contributing to the improvement of populations quality of life. The Community Pharmacist is an health professional with technical-scientific knowledge that allows him to establish the drug-user connection in a responsible and professional manner, actively intervening in raising awareness of the correct and rational use of medicines and other health products, ensuring their efficiency and safety, and guaranteeing maximum quality in all provided services. In order to allow the community pharmacists to perform their functions with rigor and quality, the pharmacy must have an adequate structure both in terms of facilities and equipment and regarding to human and scientific resources, computer system and information sources. This will be explained in Chapter 2, as well as the activities developed, and the knowledge and skills acquired during the internship in community pharmacy

Evidencia serológica de infección por herpesvirus caprino tipo 1 en cabras en México

Serologic studies of caprine herpesvirus type 1 infection (CpHV-1) have not been done to date in Mexico. A serological survey was conducted to identify the presence of anti-CpHV antibodies with two widely used blocking ELISA tests for detection of antibodies against bovine herpesvirus type 1 glycoprotein B (gB) and anti-glycoprotein E (gE). Of the 838 tested animals, 123 (14.68 %) were positive with the ELISA test. Anti-CpHV-1 antibodies were detected in samples from the states of Puebla, Morelos, Nuevo Leon, Mexico City, Guanajuato and Queretaro. This is the first report of the presence of antibodies against caprine herpesvirus-1 in Mexico.En México no se han realizado estudios serológicos sobre herpesvirus caprino tipo 1 con el propósito de saber el estado de la infección por CpHV-1. Se llevó a cabo un análisis serológico para determinar la presencia de anticuerpos contra el virus usando un ELISA de bloqueo comercial para detección de anticuerpos contra la glicoproteína B (gB) y glicoproteína E (gE) del herpesvirus bovino tipo 1, de acuerdo con la prueba diagnóstica que se utiliza de forma rutinaria. De un total de 838 animales analizados, 123 (14.68 %) resultaron positivos a la prueba de ELISA. En los estados de Puebla, Morelos, Nuevo León, Ciudad de México, Guanajuato y Querétaro se encontró evidencia serológica de la presencia del CpHV-1 en cabras. Este reporte es el primer estudio que señala la presencia de anticuerpos contra herpesvirus caprino en cabras en México

Development of a semi-quantitative pcr method using a plasmid cloned with part of the gb gene of cytomegalovirus

A infecção por citomegalovírus é disseminada em nosso meio e costuma acometer, com significante morbimortalidade, indivíduos imunodeprimidos, especialmente, transplantados de medula óssea e de rim bem como pacientes com AIDS. Neste trabalho, descrevemos o desenvolvimento de uma PCR semiquantitativa para detectar e quantificar cargas de CMV, presentes em materiais clínicos. Para tanto, inserimos em plasmídios PCR II (Invitrogen, USA), o fragmento com 296 pares-base do gene da glicoproteína B do CMV. Os plasmídios com inserto foram transfectados em Escherichia coli, multiplicados, verificados quanto à presença do inserto por seqüenciamento nucleotídico, purificados, e quantificados. Os plasmídios com inserto foram titulados em diluições decimais e as mesmas foram submetidas à PCR descrita anteriormente,que foi, também, utilizada nos testes semiquantitativos, permitindo determinar a sensibilidade da técnica, 867 cópias de CMV / mg de DNA. Com base nas densidades das bandas eletroforéticas dos amplicons de amostras clínicas, comparadas às da titulação de plasmídios contendo inserto de glicoproteína B do CMV, obtivemos as cargas virais. A técnica de PCR semiquantitativa, por nós padronizada, tem, como vantagens, o baixo custo e o fácil manuseio após sua padronização, podendo ser testada na detecção da carga de CMV em diferentes tipos de pacientes com suspeita de citomegalovirose.Cytomegalovirus (CMV) infections are highly prevalent in Brazil. CMV is a caus ative of significant morbidity and mortality in immunodepressed patients including bone marrow and kidney transplanted individuals as well as AIDS patients. The present work shows on the development of a semi-quantitative PCR for determination of CMV load in clinical samples. A 296 nucleotides segment of the gB gene of CMV was inserted into PCR II plasmids (Invitrogen, USA), and these plasmids were transfected into Escherichia coli. After confirmation of the presence of the insert and multiplication, the plasmids were quantified in the original sample. Following, a titration of the cloned plasmids was carried out in order to determinate the sensitivity of the semiquantitative PCR using primers that anneal to the gB gene of CMV. That was 867 plasmid copies/mg of DNA. The CMV load in the leukocytes of clinical samples was determined after PCR, by comparison of densities of the amplicon bands with those of the quantified cloned plasmid titration. This is a is a simple and low cost CMV semi-quantitative PCR, and it could be used for detecting viral loads in clinical samples of patients infected with CMV.   &nbsp