Electrochemical Immunosensor Based on Nanoelectrode Ensembles for the Serological Analysis of IgG-type Tissue Transglutaminase

Celiac disease (CD) is a gluten-dependent autoimmune disorder affecting a significant percentage of the general population, with increasing incidence particularly for children. Reliable analytical methods suitable for the serological diagnosis of the disorder are urgently required for performing both the early diagnosis and the follow-up of a patient adhering to a gluten-free diet. Herein we report on the preparation and application of a novel electrochemical immunosensor based on the use of ensembles of gold nanoelectrodes (NEEs) for the detection of anti-tissue transglutaminase (anti-tTG), which is considered one reliable serological marker for CD. To this end, we take advantage of the composite nature of the nanostructured surface of membrane-templated NEEs by functionalizing the polycarbonate surface of the track-etched membrane with tissue transglutaminase. Incubation of the functionalized NEE in anti-tTG samples results in the capture of the anti-tTG antibody. Confirmation of the recognition event is achieved by incubating the NEE with a secondary antibody labelled with horseradish peroxidase (HRP): in the presence of H₂O₂ as substrate and hydroquinone as redox mediator, an electrocatalytic current is indeed generated whose increment is proportional to the amount of anti-tTG captured from the sample. The optimized sensor allows a detection limit of 1.8 ng mL-1, with satisfactory selectivity and reproducibility. Analysis of serum samples from 28 individuals, some healthy and some affected by CD, furnished analytical results comparable with those achieved by classical fluoroenzyme immunoassay (FEIA). We note that the NEE-based immunosensor developed here detects the IgG isotype of anti-tTG, while FEIA detects the IgA isotype, which is not a suitable diagnostic marker for IgA-deficient patients

Challenges with Point-Of-Care Tests (POCT) for Celiac Disease

Current screening test for celiac disease involves blood test in centralized pathology laboratories, typically performing enzyme-linked immune-sorbent assays (ELISA) to detect specific celiac disease antibodies. Most of the current available celiac disease antibody tests detect anti-gliadin (AGA), anti-endomysial (EMA), anti-transglutaminase (tTG), or deamidated gluten peptide (DGP) antibodies from serum or whole blood samples. It requires blood collection from untreated celiac patients, which is often invasive and inconvenient. There is a rapid growth in demand for noninvasive celiac tests for the early and fast diagnosis of celiac disease to help potential celiac patients obtain results and take corresponding actions. Over the last decade, several point-of-care tests (POCT) have been introduced to the market, but these tests have not been widely accepted by clinicians. Moreover, the 2009 NICE guideline CG 86 recommended that self-tests and/or POCT for celiac disease should not be used as a substitute for laboratory-based tests. Here, we provide a background on the evolution of POCT for celiac disease. We discuss general principle of operation for the known commercial kits as well as the use of various antigens and antibodies in different tests developed over the years. Finally, we discuss challenges for future research directions in celiac disease POCTs

Electrogenerated chemiluminescence : from mechanistic insights to bioanalytical applications

Electrogenerated chemiluminescence (ECL) is a powerful analytical technique exploited for clinical, industrial and research applications. The high sensitivity and good selectivity, makes ECL a tool-of-choice analytical method for a broad range of assays, most importantly for a large number of commercialized bead-based immunoassays. In the present thesis, we aimed to study the ECL phenomenon and its application in development of new analytical methods.In the first part of this work, we used an imaging technique to investigate the ECL mechanisms operating in bead-based assays. Spatial reactivity mapping at the level of a single functionalised bead provides a new strategy to test the co-reactant efficiency and shows associated optical focusing effects.In the second part, the design of a novel anti-transglutaminase ECL immunoassay for celiac disease diagnostic is shown using nanoelectrode ensembles as bioelectroanalytical platforms. We also studied the characteristics of ECL generated by arrays of boron-doped-diamond nanoelectrodes (BDD NEAs) as a promising materials for bioapplications. The ECL efficiency of two co-reactants at BDD NEAs was investigated.Finally, bipolar electrochemistry is a ‘‘wireless’’ process that was exploited for the controlled motion of conductive objects exposed to an electric field in the absence of direct ohmic contact. In the third part of the thesis, we report ECL coupled to bipolar electrochemistry for tracking the autonomous trajectories of swimmers by light emission. We further expanded this concept for dynamic enzymatic sensing of glucose concentration gradient using ECL light emission as an analytical readout.La chimiluminescence électrogénérée (ECL) est une technique analytique puissante exploitée pour la détection autant au niveau industriel que dans le domaine de la recherche scientifique ou du diagnostic clinique. La sensibilité élevée et la bonne sélectivité de cette technique font de l'ECL une méthode analytique de choix pour un large éventail d'applications, dont la plus importante est son utilisation commerciale dans un grand nombre de tests immunologiques à base de billes fonctionnalisées. Dans cette thèse, nous avons cherché à étudier le phénomène ECL et son application pour le développement de nouvelles techniques analytiques.Dans la première partie de ce travail, nous utilisons les techniques d'imagerie pour étudier les mécanismes ECL se produisant sur les billes utilisées pour les tests immunologiques. La cartographie de la réactivité au niveau d'une seule microparticule fonctionnalisée avec un complexe de ruthénium fournit une nouvelle stratégie visant à tester l'efficacité du co-réactif et montre des effets optiques associés de focalisation.Dans la deuxième partie, la conception d'un test immunologique pour la détection de l'anti-transglutaminase pour le diagnostic de la maladie coeliaque est présentée en utilisant des ensembles de nanoélectrodes comme plates-formes bioélectroanalytiques. Nous avons également étudié les caractéristiques de l'ECL générée par des réseaux de nanoélectrodes dopées au bore-diamant en tant que matériaux prometteurs pour des applications biologiques ainsi que l'efficacité ECL de deux co-réactifs sur ces réseaux.L'électrochimie bipolaire est un processus sans contact que nous avons exploité pour contrôler le mouvement d'objets conducteurs exposés à un champ électrique en l'absence de contact ohmique direct. Dans la troisième partie de ma thèse, nous présentons l'ECL couplée à l'électrochimie bipolaire pour le suivi d’objets autonomes luminescents. Nous avons élargi ce concept à la détection enzymatique dynamique de glucose en utilisant l'émission de lumière ECL comme signal analytique

Study of surface chemistry strategies to enhance the electrochemical detection of proteins and DNA markers

Els biosensors son dispositius analítics basats en la interacció específica entre un element biològic sensor i la seva molècula diana juntament amb un transductor per al processament de la senyal. Aquests dispositius tenen moltes aplicacions pràctiques en diferents camps d’investigació, des del diagnòstic mèdic a l’anàlisi mediambiental, i amb un gran potencial per a la seva comercialització. Tot i les grans expectatives, únicament hi ha uns pocs exemples de biosensors comercials, sent el mercat dominat principalment pels sensors de glucosa per gent amb diabetis, amb aproximadament un 85 % del mercat mundial. Aquesta lenta penetració al mercat es pot atribuir als elevats costos de desenvolupament i producció, i també a barreres tecnològiques com la sensibilitat, reproduïbilitat, efectes de la matriu en mostres reals, estabilitat i qualitat. En aquest treball, es presenta una fàcil estratègia per reduir els costos de fabricació mitjançant la simplificació a una sola etapa del mètode d’immobilització a la superfície de proteïnes receptores. Aquesta estratègia s’ha basat amb la introducció química de grups disulfurs a l’estructura de les proteïnes, i fou aplicada tant a anticossos com antígens per a la detecció òptica i electroquímica de proteïnes relacionades amb accidents cerebrovasculars isquèmics i amb la malaltia celíaca respectivament. Diverses avantatges potencials, com la miniaturització, integració, anàlisi multiplexat, així com també la utilització de chips d’un sol ús, haurien de ser explotades per a què els biosensors impactin en el mercat i migrin de sofisticats laboratoris als punts d’atenció. Treballant en aquesta direcció, també es presenta un procediment per a l’amplificació i detecció multiplexada de set marcadors genètics del càncer de mama amb una sensibilitat d’una única cèl•lula tumoral utilitzant un array d’elèctrodes de baixa densitat fabricats en plaques de circuit imprès de baix cost. Aquesta metodologia proporciona una nova estratègia per a la determinació del perfil genètic de cèl•lules tumorals mitjançant un procés integrat d’amplificació i detecció.Los biosensores son dispositivos analíticos basados en la interacción específica entre un elemento biológico sensor y su molécula diana en combinación con un transductor para el procesamiento de la señal. Estos dispositivos tienen muchas aplicaciones prácticas en diferentes campos de investigación, desde el diagnóstico médico a análisis medioambientales, y con un gran potencial para su comercialización. Sin embargo, a pesar de las grandes expectativas, solo hay unos pocos ejemplos de biosensores comerciales, siendo el mercado dominado principalmente por los sensores de glucosa para gente con diabetes, con aproximadamente un 85 % del mercado mundial. Esta lenta penetración en el mercado se puede atribuir a los elevados costes de desarrollo y producción, y a algunas barreras tecnológicas como la sensibilidad, reproducibilidad, efectos de la matriz en muestras reales, estabilidad y calidad. En este trabajo, se presenta una fácil estrategia para reducir los costes de fabricación mediante la simplificación a una sola etapa del método inmovilización en la superficie de proteínas receptoras. Esta estrategia se basó en la introducción química de grupos disulfuros en la estructura de la proteína y fue aplicada tanto a anticuerpos como antígenos para la detección óptica y electroquímica de proteínas relacionadas con accidentes cerebrovasculares isquémicos y la enfermedad celíaca respectivamente. Varias ventajas potenciales, como la miniaturización, integración, análisis multiplexados, así como también el uso de chips desechables, deberían ser explotadas para que los biosensores impactaran en el mercado y migraran de sofisticados laboratorios a los puntos de atención. Trabajando en esta dirección, también se presenta un procedimiento para la amplificación y detección multiplexada de siete marcadores genéticos de cáncer de mama con una sensibilidad de una única célula tumoral usando un array de electrodos de baja densidad fabricados en placas de circuito impreso de bajo coste. Esta metodología proporciona una nueva estrategia para la determinación del perfil genético de células tumorales mediante un proceso integrado de amplificación y detección.Biosensors are analytical devices based on the specific interaction between a biological sensing element and its target molecule in combination with a transducer for signal processing. They have shown many practical applications to several research fields, from medical diagnostics to environmental analysis, and have great potential for commercialization. However, despite of the great expectations, there are just few examples of commercial biosensors, being the market mainly driven by the glucose sensors for people with diabetes with approximately 85 % of the world market. This slow penetration into the market could be attributed to the elevated development and production costs and some important technological hurdles, such as sensitivity, reproducibility, matrix effects in real samples, stability and quality assurance. In this work, we report on an easy strategy to reduce the manufacturing cost by simplifying the surface immobilisation method of the receptor proteins to a single step. This approach was achieved by the chemical introduction of disulfide groups into the protein structure and was applied to both antibodies and antigens for the optical and electrochemical detection of ischemic stroke and celiac disease related proteins respectively. Several potential advantages, such as miniaturisation, integration, multiplexing analysis, as well as the use of low cost disposable chips, should be exploited for the biosensors to impact on the market and migrate from sophisticated laboratories to the point-of-care. Working on that direction, we also report on a procedure for the multiplex amplification and detection of seven genetic markers for breast cancer with a single tumour cell sensitivity using a low-density electrode microarray manufactured on standard low-cost printed circuit board (PCB) substrates. This approach provides a novel strategy for the genetic profiling of tumour cells via integrated “amplification-to-detection”

Simulació atomística d’anticossos sobre una superfície d’or per a interfícies de sensors

La modelització atomística computacional ha demostrat ser una eina de gran fiabilitat i s’ha consolidat com una mètode fonamental per l’anàlisi de l’estructura i les propietats de sistemes proteínics complexos. En l’estudi d’aquest projecte dos sistemes formats pels anticossos CR3022 i S309, específics per la detecció de la RBD del virus SARS-COV-2 han estat simulats. L’objectiu principal amb el que s’ha desenvolupat el treball a estat l’anàlisi estructural d’aquests dos sistemes d’anticossos per comprovar la viabilitat de la seva futura aplicació en immunosensors capaços de detectar el virus SARS-COV-2. Per aquest motiu s’ha dut a terme una immobilització de la proteïna a través de la regió Fc, sobre una superfície d’or. Tot seguit s’han realitzat una sèrie de simulacions clàssiques i d’aMD per tal d’observar el comportament dels sistemes durant un determinat període de temps i explorar el major nombre de conformacions possibles. Els posteriors resultats extrets mostren un comportament un comportament positiu i molt similar pels dos sistemes, que permeten portar l’objectiu inicial al següent nivell. Sent el sistema format per l’anticòs CR3022 aquell en que s’observa una major estabilitat en l’estructura final i funcionalitat en regions més específiques, malgrat estar inicialment sotmès a unes forces d’interacció amb la superfície majors.La modelización atomística computacional a demostrado ser una herramienta de elevada fiabilidad y se ha consolidado como un método fundamental para el análisis estructural y de las propiedades de sistemas proteínicos complejos. En el estudio de este proyecto, dos sistemas formados por los anticuerpos CR3022 y S309, específicos para la detección de la región RBD del virus SARS-COV-2 han sido simulados. El objetivo principal en el desarrollo del trabajo ha estado el análisis estructural de estos dos sistemas de anticuerpos para evaluar la viabilidad de su futura aplicación en inmunosensores capaces de detectar el virus SARS-COV-2. Para ello, se ha llevado a cabo un proceso de inmovilización de la proteína a través de la parte inferior de la región Fc, sobre una superficie de oro. Seguidamente se han realizado una serie de simulaciones clásicas y de aMD para poder observar la evolución en el comportamiento de los sistemas durante un periodo de tiempo determinado y explorar el mayor número de conformaciones posibles. Los posteriores resultados muestran un comportamiento positivo y muy similar en los dos sistemas que permiten llevar el objetivo inicial al siguiente nivel. Siendo el sistema formado por el anticuerpo CR3022 aquel en que se observa una mayor estabilidad en la estructura final i manteniendo la funcionalidad en las regiones más específicas a pesar de estar inicialmente sometido a unas fuerzas de interacción con la superficie superiores.Computational atomistic modelling has proven to be a highly reliable tool and has established itself as a fundamental method for the structural analysis of complex protein systems. In the study of this project, two systems formed by the antibodies CR3022 and S309, specifics for the detection of the RBD regions of the SARS-COV-2 virus has been simulated. The main objective in the development of this work has been the structural analysis of these two antibody systems to evaluate the viability of their future application in immunosensors capable of detecting the SARS-COV-2 virus. For this, a protein immobilization process has been carried out through the lower part of the Fc region, on a gold surface. Subsequently, a series of classical and aMD simulations have been carried out to be able to observe the evolution in the behaviour of the systems during a determined period of time and to explore as many conformations as possible. The subsequent results show a positive and very similar behaviour in the two systems that allow taking the initial objective to the next level. The system formed by the CR3022 antibody being the one in which greater stability is observed in the final structure and maintaining functionality in the more specific regions despite being initially subjected to higher interaction forces with the surface