The beneficial fungus Piriformospora indica confers tolerance to plants under drought stress and pathogen attack

P. indica is a beneficial root endophytic fungus which promotes plant growth and induces resistance against abiotic and biotic stress. The wide host range also provides the possibility for investigating the role of multiple functions in symbiosis. In my research, the following 3 aspects were investigated. 1. The role of P. indica in Chinese cabbage/P. indica interaction under drought stress P. indica strongly colonizes the roots of Chinese cabbage and promotes lateral root development. Under drought stress, activities of antioxidants were highly upregulated within 24 h in the leaves of fungal-colonized plants. P. indica also prevents the degradation of chlorophyll and thylakoid proteins. MDA accumulates less in the drought-exposed leaves of colonized plants. In addition, the drought-related genes were upregulated and the amount of the CAS protein was strongly increased in the leaves of the colonized plant. The drought stress was reliefed in the presence of P. indica. 2. The role of P. indica in Arabidopsis/P. indica interaction under V. dahliae challenge P. indica reduces V. dahliae-mediated disease development and inhibits growth of V. dahliae on agar plates as well as in seedlings. The P. indica-pretreated plants perform better after V. dahliae infection, do not activate stress hormones and defense genes and the number of microsclerotia is dramatically reduced. In addition, the pathogenicity of V. dahliae is associated with an increase in [Ca2+]cyt induced by an exudated compound of the pathogen in Arabidopsis roots and requires the ethylene-activated transcription factor EIN3. 3. Auxin plays a more important role in the interaction of P. indica with Chinese cabbage than with Arabidopsis Both Chinese cabbage and Arabidopsis do not require P. indica-derived auxin for the growth response. But the elevated auxin levels in Chinese cabbage suggest that the P. indica-induced growth promotion is strongly dependent on auxin

Implicación de genes de Pseudomonas simiae PICF7 en endofitismo, control biológico y promoción del crecimiento vegetal

The olive (Olea europaea L.) is the most emblematic tree in the Mediterranean basin, since 98% of its world´s cultivated area is found in this region. The morphological characteristics of this plant, its excellent adaptation to the typical dry and hot summers of this geographical area and the multiple uses of the cultivated and wild olive, make this tree of a huge economic, social and ecological importance. Spain leads the world´s production of olive oil and table olives. However, a/biotic factors such as the presence of pathogens and pests which are difficult to eradicate, erosion and soil loss, and the foreseeable effects of climate change are major threats to the crop. Currently, Verticillium wilt of olive (VWO), a disease caused by the hemibiotrophic fungus Verticillium dahliae Kleb. is considered one of the most devastating diseases affecting olive trees, and constitutes a limiting factor for the olive oil and table olives production. Moreover, recent studies have predicted an increase in temperature and prolonged periods of drought in the Mediterranean basin, which could lead to restrictions in the use of fresh water for irrigation, making it necessary to use saline or reclaimed water. To date, individual control measures employed against VWO have been ineffective. Consequently, integrated control methods combining preventive and palliative measures are considered the best strategy to manage the disease as well as to mitigate the spread of the causal pathogen. Within the integrated management strategy, biological control represents a sustainable and environmentally friendly approach and an alternative to the traditional chemical fungicides. Previous studies have demonstrated that Pseudomonas simiae PICF7 (formerly P. fluorescens PICF7), an indigenous inhabitant of olive roots, is an effective biological control agent (BCA) against VWO. In addition, its ability to promote growth in olive and barley, as well as in the model plant Arabidopsis thaliana, has been demonstrated. So far, strain PICF7 is perhaps the best characterized BCA against VWO. Nevertheless, the mechanisms involved in disease control and its endophytic root colonization ability in several hosts (i.e. olive, barley and wheat) remain largely unknown. Efforts to unravel the keys to the success of strain PICF7 as a BCA have even been made even by studying its interaction with other pathogens. So far, it has only been demonstrated the ability of strain PICF7 to induce systemic resistance to Botrytis cinerea in A. thaliana. Moreover, it is essential that PICF7 and V. dahliae share the same ecological niche (roots, rhizosphere) for the biocontrol of VWO, since an effective suppression of this pathogen has not been observed when both BCA and fungus are spatially separated ("split-root" system). Similarly, no disease control was observed when the phytopathogenic bacterium Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (causal agent of olive knot disease) and PICF7 were inoculated in different parts of the plant (BCA in the roots and pathogen in the stem). However, it was detected a transient reduction of the pathogen population and changes in the morphology of the associated tumors were detected when both microorganisms were applied to the same point (stem). Previous work has also shown that colonization of olive and banana roots by the strain PICF7 results in changes in the expression of genes involved in defensive responses, both locally (roots) and systemically (aerial part). Finally, it has been studied whether bacterial phenotypes traditionally associated with biological control and root colonization (e.g. siderophore production or motility) could be involved in VWO control. Interestingly, the results showed that PICF7 mutants altered in these phenotypes were not compromised in their ability to control the disease. In order to untangle the molecular and genetic bases underlying the effective biocontrol of VWO exerted by strain PICF7, as well as its ability to endophytically colonize olive roots, the present Thesis evaluated the possible contribution of three new phenotypes: 1) biofilm formation, which is traditionally associated with colonization and endophytism; 2) copper tolerance, a metal present in most commercial agricultural antifungals, which could contribute to greater adaptation and survival in soils; and 3) production of phytase, an enzyme involved in phosphorus mobilization and bioavailability, thus promoting plant growth. For this purpose, more than 5.500 Tn5-TcR (Tetracycline-resistance) insertion mutants (transposants) of a pre-existing random transposon insertion mutant bank were screened. Subsequently, for the identification of the Tn5-TcR insertion sites and, consequently, of the altered genes in the selected transposants, nested PCR was used. Finally, the mutants designated as Bfm8 and Bfm9 (unable to form biofilms), Cop1 and Cop33 (altered in copper tolerance) and Phy17 and Phy18 (deficient in phytase activity) were selected to carry out the olive root colonization and VWO biocontrol assays. By using confocal microscopy, it has been shown that all mutants affected in the aforementioned phenotypes were able to superficially colonize olive roots, although analysis of longitudinal sections of these roots revealed that mutants defective in biofilm formation (Bfm8 and Bfm9) did not colonize them internally. None of the studied phenotypes seemed to be involved in the biocontrol ability of PICF7 against VWO, since all selected mutants behaved similar to the wild-type strain PICF7, even though phytase defective mutants (Phy17 and Phy18) were impaired in their ability to antagonize V. dahliae in in vitro assays on one of the culture media used. This fact highlights the importance of contrasting in vitro observations with in planta assays, where the olive-Verticillium-BCA tripartite interaction becomes more complex. This is because there are numerous interactions with and among the remaining plant´s microbiota, as well as with several environmental and pedological factors. Pseudomonas sp. strain PICF6, another effective BCA against VWO, was included in some experiments performed in this Thesis for comparative purposes in order to accomplish some of the proposed objectives. In contrast to strain PICF7, there is virtually no information concerning the control of phytopathogens or the plant growth promotion capabilities of the beneficial strain PICF6, also originating from the olive rhizosphere. To overcome this lack of knowledge, both BCA and the Bfm and Phy mutants of PICF7, were tested in in vitro experiments against several pathogens of great agroeconomic importance in different crops. Strains PICF6 and PICF7, along with all selected mutants derived from the latter, only exhibited the ability to antagonize Verticillium longisporum ELV25, despite the inhibition rates of PICF7 mutants defective in phytase activity being significantly lower. The ability of these rhizobacteria to promote plant growth and colonize oilseed rape roots, host plant of V. longisporum, was also evaluated. Although none of the strains tested promoted the growth of this plant, belonging to the Brassicaceae family, all of them were able to colonize the root surface of oilseed rape seedlings. However, no evidence of endophytic colonization was found. Production of volatile organic compounds (VOC) has been described amongst the possible mechanisms by which beneficial microorganisms are able to inhibit the growth of phytopathogens or promote plant growth. A recent study has shown that strain PICF7 is able to promote plant growth of A. thaliana, not only through direct contact between the BCA and plant roots, but also through the emission of VOC without any physical contact. Nonetheless, it is unknown whether the ability of strains PICF6 and PICF7 to reduce V. dahliae growth could be attributed to this mechanism. In this context, the characterization of PICF6 and PICF7 volatilomes, as well as of the Bfm and Phy mutants, using Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS), allowed the identification of several compounds described in the literature for their antimicrobial potential or plant growth-promoting activity. Conversely, in vitro VOC inhibition assays, using TCVA (Two Clamp VOC Assay) methodology, showed that none of the assayed strains were able to antagonize V. dahliae. Nevertheless, the compounds identified in the volatilome of these rhizobacteria, used individually and at a higher concentration, could represent a new avenue to explore substances with antagonistic capacity against V. dahliae and other relevant pathogens, as well as to evaluate their potential for plant growth promotion. As mentioned above, drought and salinity (abiotic stresses), along with to pathogen infections (biotic stresses), constitute another major threat to olive crop. Several microorganisms have shown high potential to reduce the effects of these stresses in plants. For this reason, the present Thesis has also been focused on studying the role of Pseudomonas sp. PICF6 and P. simiae PICF7 in the alleviation of the symptoms in plants caused by water scarcity of water or by salt accumulation in the soil. Numerous studies have attributed the beneficial effect of certain rhizobacteria on plants subjected to salt or drought stress to the production of the enzyme 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase (ACD). These stresses induce the biosynthesis of ethylene (ET), a phytohormone that, among the numerous processes in which it is involved, causes a negative effect on the plant at high concentrations. ACD catalyzes the conversion of ACC, the immediate precursor of ET, into α-ketobutyrate and ammonia. Therefore, ACD-producing microorganisms contribute to reduce ET levels and, consequently, the stress caused by the accumulation of this phytohormone in the plant. Furthermore, the plant can also develop different defense strategies to mitigate the negative effects caused by this type of stress, including changes in stem water potential (Ψ) and stomatal conductance (gs), or in chlorophyll (Chl), flavonoid (Flv) or proline contents. Experiments were carried out to compare the physiological parameters mentioned above in plants inoculated with an ACD-producing rhizobacteria (Pseudomonas sp. PICF6) and in plants inoculated with a non ACD-producing rhizobacteria (P. simiae PICF7). The results obtained showed that, under the experimental conditions here used, Flv values were influenced by the presence of the bacteria. However, Ψ, gs and the Chl and proline contents remained unchanged upon inoculation of the different strains. Overall, the assayed rhizobacteria, regardless of whether or not they possess ACD activity, did not alleviate the stress produced by drought or salinity in olive plants under the experimental conditions. Finally, as a consequence of the work carried out in this section, it was also demonstrated that the colonization pattern of olive roots by Pseudomonas sp. PICF6 was similar to that observed for PICF7, including its endophytic capacity. In summary, the results obtained in this Thesis allow us to conclude that the three phenotypes of P. simiae PICF7 here examined (phytase activity, biofilm formation and copper tolerance) are not involved in the ability of this BCA to control VWO, although in the particular case of mutants altered in biofilm formation no evidence of endophytic colonization of olive roots was found. Therefore, VWO biocontrol by strain PICF7 does not seem to require inner colonization of this organ. Additinally, strains PICF6 and PICF7 did not show the ability to alleviate symptoms caused by salt or drought stress in olive plants, ruling out the involvement of the ACD activity, at least under the conditions analyzed. Colonization pattern studies for both strains showed that the two olive rhizobacteria superficially colonize the root of this model plant. However, neither PICF6 nor PICF7 promoted the growth of this plant. Yet, the characterization of PICF6 and PICF7 volatilomes allowed for the identification of several VOC with a reported antimicrobial activity. Even though the involvement of VOC in the inhibition of V. dahliae growth in vitro was not observed, the collected information could pave the way for further study of these molecules individually and against different pathogens.El olivo (Olea europaea L.) es el árbol más emblemático de la cuenca mediterránea, concentrándose en esta región el 98% de superficie cultivada de este árbol a nivel mundial. Las características morfológicas de esta planta, su excelente adaptación a los veranos secos y cálidos propios de esta área geográfica, además de los múltiples usos del olivo cultivado y silvestre, hacen que este posea una enorme importancia económica, social y ecológica. España lidera la producción mundial de aceite de oliva y aceituna de mesa. Sin embargo, factores a/bióticos como la presencia de patógenos y plagas de difícil erradicación, la erosión y pérdida de suelo o los previsibles efectos del cambio climático, suponen importantes amenazas para el cultivo. Enfermedades como la verticilosis del olivo (VO), causada por el hongo hemibiotrófico Verticillium dahliae Kleb. y considerada como una de las afecciones más devastadoras del olivo, constituyen un factor limitante para la producción de aceite de oliva y aceitunas de mesa. Asimismo, estudios recientes prevén un aumento de la temperatura y episodios prolongados de sequía en la cuenca mediterránea, lo que podría conducir a restricciones en el uso de agua dulce para irrigación, haciendo necesaria la utilización de agua salada o regenerada y comprometiendo la producción. En lo que respecta a la VO, los diferentes métodos de control de la enfermedad empleados de manera individual han sido ineficaces. Es por ello que el control integrado, combinando medidas preventivas y paliativas de diversa índole, se plantea como la mejor estrategia para manejar la enfermedad y mitigar la dispersión del patógeno que la provoca. Una de las medidas dentro de esta estrategia integrada es el control biológico, herramienta sostenible y respetuosa con el medio ambiente que surge como alternativa a los tradicionales fungicidas químicos. Estudios previos demostraron que Pseudomonas simiae PICF7 (anteriormente P. fluorescens PICF7), bacteria aislada de raíces de olivo (cultivar Picual), es un eficaz agente de control biológico (ACB) frente a la VO. Además, se ha comprobado su capacidad para promover el crecimiento en olivo y cebada, así como en la planta modelo Arabidopsis thaliana. La cepa PICF7 es quizás el ACB mejor caracterizado contra la VO, aunque los mecanismos implicados en el control de la enfermedad y en la capacidad de colonización endofítica de raíces en diversos huéspedes (olivo, cebada y trigo) continúan siendo bastante desconocidos. Las claves del éxito de la cepa PICF7 como ACB se han intentado desvelar incluso estudiando su interacción con otros patógenos. Hasta el momento solo se ha demostrado que induce resistencia sistémica frente a Botrytis cinerea en A. thaliana. Por otra parte, en el caso del control de la VO, es necesario que PICF7 y V. dahliae compartan el mismo nicho ecológico (raíces, rizosfera), pues no se ha observado un control efectivo de este patógeno cuando ACB y hongo se inoculan en raíces separadas en distintos compartimentos (sistema “split-root”). De igual manera, no se observó control cuando la bacteria fitopatógena Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (agente causal de la tuberculosis del olivo) y PICF7 se inoculaban en órganos diferentes de la planta (ACB en las raíces y patógeno en el tallo), pero sí se detectó una reducción transitoria de la población del patógeno y un cambio en la morfología de los tumores cuando ambos microorganismos eran aplicados en el mismo lugar (tallo). Trabajos anteriores también han demostrado que la colonización de las raíces de olivo y platanera por la cepa PICF7 desencadena cambios en la expresión de genes implicados en respuestas defensivas tanto a nivel local (raíces) como sistémico (parte aérea). Finalmente, se ha estudiado si fenotipos bacterianos tradicionalmente asociados con el control biológico y colonización de las raíces (p. ej., producción de sideróforos o motilidad) podían influir en el control de la VO, evidenciándose que mutantes de PICF7 alterados en estos fenotipos no veían mermada su capacidad para controlar la enfermedad. Con el objetivo de desentrañar las bases moleculares y genéticas que subyacen y explican el control efectivo de la VO ejercido por la cepa PICF7, así como su capacidad para colonizar endofíticamente raíces de olivo, en la presente Tesis se evaluó la posible contribución de tres nuevos fenotipos: 1) formación de biopelículas, fenotipo tradicionalmente asociado a colonización y endofitisimo; 2) tolerancia al cobre, metal presente en la mayoría de antifúngicos agrícolas comerciales, que podría contribuir a una mayor adaptación y supervivencia en suelos; y 3) producción de fitasa, enzima que ayuda a incrementar la movilización y disponibilidad del fósforo promoviendo el crecimiento vegetal. Para ello, se llevó a cabo el escrutinio de más de 5.500 mutantes procedentes de una mutateca preexistente generada mediante inserciones al azar del transposón Tn5-TcR, el cual confiere a los transposantes resistencia al antibiótico tetraciclina. Posteriormente, para la identificación de los lugares de inserción de Tn5-TcR y, consecuentemente, de los genes alterados en los transposantes seleccionados, se empleó la técnica de PCR anidada (“nested”-PCR). Finalmente, los mutantes denominados Bfm8 y Bfm9 (incapaces de formar biopelículas), Cop1 y Cop33 (alterados en tolerancia al cobre) y Phy17 y Phy18 (deficientes en actividad fitasa) se seleccionaron para llevar a cabo los ensayos de colonización de la raíz del olivo y biocontrol de la VO. En cuanto a colonización, el uso de microscopía confocal demostró que todos los mutantes afectados en los fenotipos mencionados fueron capaces de colonizar superficialmente las raíces de olivo, aunque el análisis de secciones longitudinales de dichas raíces reveló que los mutantes defectivos en formación de biopelículas (Bfm8 y Bfm9) no las colonizaron internamente. En lo que respecta a capacidad de biocontrol, ningún fenotipo pareció estar involucrado en esta habilidad, ya que todos los mutantes seleccionados controlaron la enfermedad al mismo nivel que la cepa parental PICF7, aun cuando los mutantes defectivos en actividad fitasa (Phy17 y Phy18) vieron mermada su capacidad de antagonizar V. dahliae in vitro en uno de los medios de cultivo empleados. Este hecho pone de manifiesto la crucial importancia de contrastar las observaciones efectuadas in vitro con los ensayos in planta, donde la interacción tripartita olivo-Verticillium-ACB se torna más compleja al entrar en juego las interacciones con y entre el resto de la microbiota de la planta, así como de diversos factores ambientales y pedológicos. La cepa Pseudomonas sp. PICF6, otro ACB eficaz frente a la VO, se incluyó en esta Tesis a efectos comparativos para abordar algunos de los objetivos planteados. Al contrario de lo que ocurre con PICF7, la información sobre esta bacteria beneficiosa originaria de la rizosfera de olivo en lo que respecta al control de fitopatógenos o a la promoción del crecimiento vegetal es prácticamente nula. Para soslayar esta deficiencia, ambos ACB, así como los mutantes Bfm y Phy de PICF7, se enfrentaron en experimentos in vitro a varios patógenos de gran importancia agroeconómica en diferentes cultivos. Las cepas PICF6 y PICF7, así como todos los mutantes derivados de esta última, sólo mostraron capacidad de antagonizar a Verticillium longisporum ELV25, aunque los índices de inhibición de los mutantes PICF7 defectivos en actividad fitasa fueron significativamente inferiores. También se evaluó la capacidad de estas rizobacterias de promover el crecimiento vegetal y de colonizar las raíces de colza, planta huésped de V. longisporum. Aunque ninguna de las cepas ensayadas promovió el crecimiento de esta brasicácea, todas fueron capaces de establecerse superficialmente sobre sus raíces. Sin embargo, no se encontró evidencia de colonización endófita. Entre los posibles mecanismos por los cuales microorganismos beneficiosos son capaces de inhibir el crecimiento de fitopatógenos o promover el crecimiento de las plantas se ha descrito la producción de compuestos orgánicos volátiles (COV). Un estudio reciente ha demostrado que la cepa PICF7 es capaz de promover el crecimiento vegetal de A. thaliana, no solo a través del contacto directo entre el ACB y las raíces de la planta, sino también a través de la emisión de COV sin mediar contacto físico. Sin embargo, se ignora si la capacidad de las cepas PICF6 y PICF7 para reducir el crecimiento de V. dahliae podría deberse a este mecanismo. La caracterización del volatiloma de las rizobacterias PICF6 y PICF7, así como de los mutantes Bfm y Phy de esta última, mediante el uso de Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (GC-MS), permitió identificar numerosos compuestos descritos en la bibliografía por su potencial actividad antimicrobiana o promotora del crecimiento vegetal. Aun así, los ensayos de inhibición in vitro por COV, en los que se usó la metodología TCVA (de sus siglas en inglés “Two Clamp VOC Assay”), mostraron que ninguna de las cepas analizadas era capaz de antagonizar frente V. dahliae. A pesar de todo, los compuestos identificados en el volatiloma de estas rizobacterias, usados de forma individual y a una concentración mayor, podrían suponer una nueva vía para explorar sustancias con poder antagonista frente a V. dahliae y otros patógenos relevantes, así como para evaluar su potencial en la promoción del crecimiento de plantas. Como se menc

Verticillium wilt resistance in Arabidopsis and tomato: identification and functional characterization

Vascular wilt pathogens, which comprise bacteria, fungi and oomycetes, are among the most destructive plant pathogens that affect annual crops as well as woody perennials, thus not only impacting world food and feed production but also natural ecosystems. Vascular wilt pathogens colonize the xylem vessels of their host plants and interfere with the normal transportation of water and nutrients from the roots to upper parts of the plant, thus causing wilting symptoms. The structure and composition of xylem vessels has a significant impact on the colonization of host plants by these pathogens. Presently, genetic resistance is the most preferred control strategy against this group of plant pathogens. Verticillium wilt disease, which is caused by the vascular fungal pathogen Verticillium spp., is among the major diseases in various horticultural crops in tropical, subtropical, and temperate agro-ecological regions. The genus Verticilllium comprises of three major plant pathogenic species; V. dahliae, V. albo-atrum,and V. longisporum. While V. dahliae and V. albo-atrum arecharacterized with the ability to infect broad host range, V. longisporum has relatively limited host range infecting mainly crucifers family. V. dahliae and V. albo-atrum isolates are categorized into race 1 and race 2 based on their ability to infect tomato plants containing a Ve1 resistance gene. On tomato, while race 1 isolates are contained by Ve1 resistance gene, race 2 isolates overcome Ve1-mediated resistance. Chapter 1is the introduction to the thesis that describes xylem defence responses that are directed against vascular wilt pathogens. Plants recognize xylem-invading vascular wilt pathogens by using extracellular or intracellular receptors. Pathogen recognition activates innate immune responses that include physical and chemical defense responses in the xylem vessels and the surrounding parenchyma cells. While physical defense responses often halt pathogen movement between vessels, chemical defense responses can eliminate the pathogen or inhibit its growth, thereby leading to resistance. In order to identify novel sources of Verticillium wilt resistance, a collection of activation-tagged Arabidopsis mutants was screened for plants that displayed enhanced Verticillium wilt resistance. Chapter 2 describes four mutants (A1 to A4) that showed enhanced resistance to not only V. dahliae, but also to V. albo-atrum, and the Brassicaceae pathogen V. longisporum. Further characterization of resistance in these mutants against other vascular wilt pathogens, Ralstonia solanacearum and Fusarium oxysporum f. sp. Raphani, and the foliar pathogens such Botrytis cinerea, Plectosphaerella cucumerina, Alternaria brassicicola, and Pseudomonas syringae pv. tomato, is presented in this chapter. Except for mutant A2, that showed enhanced resistance to R. solanacearum, and mutants A1 and A3, that showed enhanced susceptibility to P. syringae, all the mutants responded similar as wild-type plants to these pathogens. In chapter 2, we furthermore describe the cloning and functional characterization of the gene encoding the AT-hook DNA-binding protein AHL19 that is responsible for the enhanced resistance of the A1 mutant to Verticillium wilt disease. The Arabidopsis genome contains 29 AHL proteins (Fujimoto et al., 2004)some of which have been implicated in various biological processes including plant development (Lim et al., 2007; Xiao et al., 2009)and defense (Kim et al., 2007Kim et al., 2007; Lu et al., 2010). AHL19 provides Verticillium wilt resistance upon over-expression, whereas knock-out enhances susceptibility, indicating that AHL19 positively regulates Verticillium wilt resistance. AHL19 not only regulates Verticillium wilt resistance, but also affects plant development, as AHL19 over-expressing plants showed larger leaf size, delayed maturity, and low seed production (Yadeta et al., 2011). Chapter 3describes the cloning and functional characterization of EVR1 (for Enhanced Verticillium Resistance 1), the gene that is responsible for the enhanced Verticillium wilt resistance in mutant A2. Mutant A2 furthermore confers resistance to the bacterial vascular wilt pathogen R. solanacearum (Yadeta et al., 2011). While EVR1 over-expression enhances Arabidopsis resistance to three vascular wilt pathogens: V. dahliae, R. solanacearum, and F. oxysporum, knock-out enhances susceptibility to V. dahliae and R. solanacearum. Furthermore, EVR1 appears to regulate drought stress resistance. EVR1 is a single copy gene that encodes a protein of unknown function, and EVR1 homologs are only found in Brassicaceae species thus far. Interestingly, over-expression of the B. oleraceae EVR1 homolog in Arabidopsis conferred Verticillium wilt resistance. Moreover, over-expression of Arabidopsis and B. oleraceae EVR1 and BoEVR1 in the Solanaceous species N. benthamiana enhanced Verticillium wilt resistance. This suggests that the Brassicaceae-specific EVR1 gene can be used to engineer Verticillium wilt resistance in other plant families. Whereas chapters 2 and 3 focus on the identification of novel sources of Verticillium wilt resistance by screening a collection of Arabidopsis gain-of-function mutants, Chapter 4 describes the identification of novel Verticillium wilt resistance in wild tomato accessions. Six wild accessions were identified that displayed enhanced resistance to race 2 isolates. Surprisingly, however, these accessions did not show enhanced resistance to race 1 isolates. Using virus-induced gene silencing, the resistance signalling leading to race 2 resistance in the wild accessions was investigated, showing that the resistance signalling in the wild accessions is distinct from the signalling pathway employed by the resistance protein Ve1. Finally in chapter 5, the highlights of this thesis are discussed and placed in a broader perspective. </p

Estructura y diversidad genética de poblaciones bacterianas en la rizosfera de olivo (Olea europaea L. subsp. europaea) en Andalucía

El olivo (Olea europaea L. subsp. europaea) ha sido culturalmente y económicamente el principal cultivo oleaginoso de la Cuenca Mediterránea. España es el mayor productor de aceite de oliva en el mundo, y Andalucía, la región sur del país, es el principal área de cultivo con 62% de la superficie de olivar en España, ocupando >1.5 millones ha, y un 17% de su superficie total en un monocultivo impresionante. En España, el olivo se puede encontrar en dos formas, silvestre (Olea europaea L. subsp. europaea var. sylvestris) y cultivada (Olea europaea L. subsp. europaea var. europaea). Las interacciones planta-microorganismo en la rizosfera y endosfera ha sido objeto de considerables estudios, ya que las comunidades bacterianas desempeñan un importante papel en el balance, desarrollo y funcionamiento del ecosistema suelo en diferentes sistemas agrícolas en muchas especies de plantas cultivadas. Esta Tesis Doctoral, se ha centrado en el estudio de la estructura y diversidad genética de las comunidades bacterianas de la rizosfera de olivos cultivados y silvestres en Andalucía, determinando el papel que los sistemas de manejo del suelo y los factores asociados a la planta pueden tener sobre éstas. En España, recientemente se han introducido métodos alternativos del manejo del suelo para reducir al mínimo la vulnerabilidad de los olivares a la erosión del suelo, uno de los principales problemas para la sostenibilidad del olivo en Andalucía, incluyendo el no-laboreo combinado con el control mecánico de malas hierbas, laboreo reducido con y sin control de malas hierbas y siembra de cubiertas vegetales en el otoño y eliminación de malas hierbas con herbicidas en la primavera y/o posterior desbroce o pastoreo. En este trabajo, se utilizó el análisis FT-RFLP (Análisis del Polimorfismos de Longitud del Fragmento de Restricción Terminal Fluorescente) de las secuencias amplificadas de la región 16S del ADNr para estudiar las diferencias en la estructura de las comunidades bacterianas en muestras de suelo de 46 plantaciones comerciales de olivo orgánico y 12 áreas naturales cercanas con diferentes tipos de suelo. Las fincas de olivar estudiadas han estado sometidas a los diferentes sistemas de manejo de suelo durante largo tiempo en dos de las zonas más representativas para el cultivo de olivar en Andalucía, y representan ejemplos de sistemas agroforestales y plantaciones tradicionales. Nuestros resultados demostraron que dentro de cada finca de olivar tanto el tipo de suelo como el manejo de éste contribuyeron en este orden a modificar la estructura y diversidad de las comunidades bacterianas de acuerdo a los valores de los índices de Riqueza y Shannon Weiner. Los suelos de olivar de Sierra Morena con laboreo ligero o pastoreo con ovejas durante todo el año, presentaron mayores valores de estos índices de diversidad comparados con todos los sistemas de manejo del suelo en Campiña (laboreo convencional y cobertura del suelo con desbroce). Mediante este análisis FT-RFLP algunos fragmentos de restricción terminal han sido identificados y asociados significativamente a sistemas de manejo de suelo específicos, los cuales podrían ser utilizados en el futuro como indicadores para evaluar el efecto de cambios en el manejo de suelo en la modificación de las propiedades biológicas del suelo incluyendo la calidad biológica del mismo. Entre los árboles cultivados y silvestres, el olivo es una de las especies de mayor longevidad y riqueza en variabilidad genética. En España, más de 200 variedades son actualmente cultivadas. En Andalucía ocho cultivares de olivo (Hojiblanca, Lechín de Sevilla, Manzanilla de Sevilla, Nevadillo Negro, Picual, Picudo, y Verdial de Huévar) representan >90% del área total cultivada, y nuevos cultivares (Arbequina y Frantoio) están siendo actualmente introducidos. En esta Tesis Doctoral, utilizando un enfoque tanto cultivo-dependiente e independiente (FT-RFLP de las secuencias amplificadas de la región 16S ADNr), evaluamos la influencia específica del genotipo de olivo, vivero de origen de los plantones, y el tiempo de incubación en la estructura de las comunidades bacterianas así como en las comunidades bacterianas cultivables totales (BCT) y Pseudomonas fluorescentes (Ps) en la rizosfera y endosfera de seis cultivares (Arbequina, Frantoio, Hojiblanca, Manzanilla de Sevilla, Picual, y Picudo). Nuestros resultados indicaron que en primer lugar el vivero de origen, y en segundo lugar el genotipo del olivo, tuvieron una influencia significativa en la estructura de las comunidades iniciales y densidad de población de bacterias cultivables en la rizosfera y endosfera. En general, los cultivares Arbequina y Frantoio mostraron los mayores niveles de densidad de población. Asimismo, la estructura de las comunidades bacterianas de la rizosfera de seis cultivares de olivo muestreados en distintos tiempos de crecimiento fueron diferenciados en primer lugar en función del tiempo de muestreo y en segundo lugar en función del genotipo del olivo, con densidad de poblaciones de BCT y Ps manteniéndose estables o incrementando sus niveles de densidad de población durante el tiempo de crecimiento. En esta Tesis Doctoral, nuestra hipótesis fue que ambas formas de olivo, cultivada y silvestre, pueden ser una importante fuente de variabilidad genética la cual puede contener comunidades bacterianas en la rizosfera con importantes aplicaciones en la medicina, veterinaria, agricultura o industria. Mediante un enfoque de análisis polifásico, examinamos la estructura y diversidad de las comunidades bacterianas en la rizosfera de olivos silvestres en Andalucía. Primero, utilizando la técnica de análisis FT-RFLP de la región 16S ADNr, encontramos una alta heterogeneidad en la composición de las comunidades bacterianas de la rizosfera, sugiriendo la existencia de comunidades específicas en función del genotipo de la planta y localización geográfica, siendo cada reducto de acebuche un reservorio único de diversidad. Posteriormente, investigamos el potencial antagonista de esas poblaciones bacterianas cultivables asociadas a la raíz. De un total de 675 aislados bacterianos de la rizosfera y endosfera de olivos silvestres, 94 (14%) mostraron una fuerte actividad antagonista in vitro contra V. dahliae patotipo defoliante, el cual es considerado uno de los más importantes patógenos que afectan al cultivo del olivo en el mundo. La proporción más alta de antagonistas se obtuvo de la rizosfera (59,6%) en comparación con la endosfera (40,4%). En total, la mayoría de los antagonistas (entre un 58,5 a 78,3%), mostraron actividad proteolítica, lipolítica, quitinolítica, produjeron ácido indol-acético y sideróforos. Mediante la secuenciación del gen 16S del ADNr, los antagonistas se identificaron indicando que la mayoría de las bacterias pertenecen al género Bacillus (56,4%), Pseudomonas (27,7%) y Paenibacillus (7,4%). Asimismo, varios de los aislados bacterianos que se identificaron no habían sido citados previamente en olivo incluyendo Acinetobacter sp. (3,2%), Chryseobacterium vyrstaatense (2,1%), Rhodococcus wratislaviensis (1,1%), y Rahnella sp. (1,1%). En general, varias de estas bacterias mostraron un alto y gran número de mecanismos de antagonismo, por lo que deben ser consideradas para futuros análisis como potenciales agentes de biocontrol contra V. dahliae en olivo. Finalmente, realizamos un intenso estudio centrado en nuevas bacterias pertenecientes a Duganella spp. con pigmentación morada productoras de violaceína con interés biotecnológico habitando la rizosfera de olivos silvestres y cultivados en el sur de España. Mediante una caracterización fisiológica y bioquímica, análisis filogenético de diferentes genes incluyendo 16S ADNr, gyrB y vioA (implicado en la síntesis de violaceína), aislamos e identificamos por primera vez Duganella spp. asociadas con la rizosfera de plantas leñosas en medio ambientes de clima Mediterráneos que son capaces de producir violaceína, un metabolito secundario de color azul-morado con importantes aplicaciones biológicas, médicas e industriales de alto interés biotecnológico. Las siete cepas de Duganella spp. estudiadas pudieron ser identificadas como dos potenciales especies nuevas y fueron diferenciadas de acuerdo a su huésped de origen (Duganella baetica en olivos silvestres versus Duganella olivae en olivos cultivados). Todas las cepas de Duganella spp. produjeron violaceína in vitro, con niveles de producción natural más altos (hasta X65) que los citados en la literatura para cepas de otras especies bacterianas productoras de violaceína. Este alto rendimiento, hacen de estas bacterias buenas candidatas para su explotación biotecnológica, ya que los bajos rendimientos en la producción de violaceína se consideran una de las principales limitaciones de las cepas silvestres para su producción masiva y explotación comercial. Aunque no se demostró actividad inhibidora in vitro frente a bacterias gram-negativas y hongos fitopatógenos, el filtrado crudo de violaceína si demostró actividad inhibidora contra bacterias gram positivas. También observamos que las cepas de Duganella spp. de olivos silvestres y cultivados mostraron actividad proteolítica y lipolítica y una débil producción de sideróforos lo cual merece una investigación más extensa como potenciales inoculantes de plantones de olivo para mejorar su crecimiento y el establecimiento y supresión de patógenos del suelo

Neue Konzepte für den biologischen Pflanzenschutz am Beispiel des Biological Control Agents Serratia plymuthica HRO-C48

The management of soil-borne diseases by microbial antagonists provides an environmental friendly alternative to the use of chemical-based pesticides. The beneficial bacterium Serratia plymuthica HRO-C48 colonizes plant roots preventing the host from fungal attack and is able to promote plant growth. In the present work, the AHL-based quorum sensing system of HRO-C48 was shown to be involved in the population density-dependent expression of beneficial traits including hydrolytic enzymes and antibiotics. Considering plant health and plant growth, the utilization of bio-priming to inoculate oilseed rape seeds and young olive plant by root dipping resulted in effective population densities.Die Nutzung mikrobieller Antagonisten zur Bekämpfung von Schadorganismen stellt für die Agrarproduktion eine umweltfreundliche Alternative zu konventionellen Pestiziden dar. Das Bakterium Serratia plymuthica HRO-C48 besiedelt die Pflanzenwurzel und vermittelt dort einen Schutz gegen bodenbürtige Schadpilze sowie eine Pflanzenwachstumsförderung. Es konnte gezeigt werden, dass die nützlichen Eigenschaften des Bakteriums in Abhängigkeit von der Zelldichte reguliert werden. Die für die Inokulation von Rapssamen entwickelte Methode des Bio-Primings sowie die Behandlung von Olivenpflanzen mit der Wurzeltauchbadtechnik resultierte in eine wirksame Populationsdichte von HRO-C48

Regeneración y transformación genética para la obtención de plantas de olivo resistentes a patógenos fúngicos

No se observaron diferencias morfológicas con respecto al control, a excepción de la línea AFP13 que mostró un menor crecimiento. Ninguna de las líneas que expresaban el gen afp mostró resistencia frente a V. dahliae; sin embargo, se observó una correlación positiva entre el nivel de expresión afp y resistencia parcial a R. necatrix. La línea AFP13, que no expresaba afp, mostró una alta resistencia a Verticilosis. La resistencia podría estar relacionada con una variación somaclonal inducida por el cultivo in vitro, aunque los mecanismos responsables se desconocen. En el tercer objetivo, se obtuvieron y caracterizaron líneas embriogénicas de olivo que expresan el gen AtNPR1. Este gen está implicado en la respuesta SAR y su sobreexpresión incrementa la resistencia a patógenos en distintas especies. Se obtuvieron 3 líneas de callo embriogénico transgénicas y se regeneraron plantas a partir de ellas. La expresión del transgén no modificó el crecimiento de las plantas, tanto in vitro como en invernadero. Las líneas embriogénicas fueron elicitadas con ácido salicílico y metil jasmonato, cuantificándose la actividad endoquitinasa. El tratamiento con AS no ejerció ningún efecto significativo en la actividad; por el contrario, la exposición a MeJA produjo un incremento de actividad a las 24h de exposición, siendo mayor este incremento en las líneas transgénicas que en el control. Actualmente se está evaluando la resistencia a Verticilosis en las plantas obtenidas. Fecha de Lectura de Tesis: 17 de julio 2018.Biología Vegetal (Botánica y Fisiología Vegetal) Resumen tesis: El objetivo global de esta tesis es el desarrollo de herramientas biotecnológicas para la obtención de plantas de olivo (Olea europaea L.) con mayor resistencia a patógenos fúngicos, en particular, Verticillium dahliae, agente causal de la Verticilosis, y Rosellinia necatrix, causante de la podredumbre blanca radicular, enfermedad emergente en las nuevas plantaciones de olivo. Este objetivo global se ha abordado en tres objetivos parciales. En el primero, se ha establecido un protocolo de regeneración vía embriogénesis somática para material adulto de olivo silvestre. Para la inducción de embriogénesis, se testaron distintos medios de cultivo y tipos de explanto. Se obtuvieron cultivos embriogénicos en los genotipos StopVert y Ac-18, resistentes a Verticilosis, utilizando como explantos ápices caulinares de brotes micropropagados, cultivados durante 4 días en medio líquido MS ½ suplementado con 30 uM TDZ y 0.54 uM NAA, seguido del cultivo en el mismo medio sólido sin reguladores de crecimiento. Las plantas regeneradas a partir de callo embriogénico del genotipo StopVert no mostraron polimorfismos, en comparación con la planta donante, mediante marcadores SSR y RAPDs, así como tampoco variaciones fenotípicas con respecto a brotes micropropagados derivados de yemas laterales. En el segundo objetivo, se evaluó la tolerancia a V. dahliae y R. necatrix en plantas de olivo que expresan el gen antifúngico afp de Aspergillus giganteus. Se transformaron cultivos embriogénicos de olivo, derivados de radícula, con un vector binario conteniendo el gen afp bajo el control del promotor constitutivo CaMV35S. Se obtuvieron 6 líneas transgénicas, 5 de las cuáles integraron el transgén, mientras que una de ellas, línea AFP13, solo incorporó el gen de selección nptII