Using genomics and population genetics to understand genetic variation in Malawi Plasmodium falciparum clinical isolates

The natural selection imposed by host immunity and antimalarial drugs has driven extensive adaptive evolution in Plasmodium falciparum, leading to an ever-changing landscape of genetic variation. We have carried out whole-genome sequencing of 93 P. falciparum clinical isolates from Malawi and used population genetic methods to investigate the genetic diversity and regions under selection. In addition, by computing XP-EHH, PCA and FST we have compared the Malawi isolates to five dispersed others (Kenya, Mali, Burkina Faso, Cambodia and Thailand), and identified genes potentially under positive directional selection. Geographic stratification of genetic diversity in the populations followed continental lines and small population differences were observed within Africa. Positive directional selection signals were identified at or near pfdhps, pfcrt, pfmdr1 and pfgch1 (known drug targets) and in several merozoite invasion ligands (e.g., msp3.8, trap and ama1). We discuss the role of drug selection in promoting fixation of alleles between populations with differing adaptation to local drug pressure. Analysis of copy number variation in Malawi provides a detailed catalogue of new and previously identified gene deletions and duplications with critical roles in cytoadherence, gametocytogenesis, invasion and drug response. This work provides the first genome-wide scan of selection and CNV in Malawi to guide future studies in investigating parasite evolution, changing malaria epidemiology, and monitoring and evaluating impact of malaria interventions as they are deployed

Evolutionary and population genomic analyses of the Zymoseptoria species complex

Plant pathogenic fungi in agricultural environments have to adapt to rapidly changing environments. Comparative analyses of closely related pathogens adapted to natural or agricultural ecosystems allow gaining more profound knowledge about the evolutionary responses that play a role in the adaptation to these differing environments. The members of the Zymoseptoria species complex comprise an excellent model system for comparative analyses since they either are specialized on wheat (Z. tritici) or associated with wild plant species (Z. ardabiliae, Z. brevis, Z. pseudotritici). Using methods of comparative genomics and molecular genetics this thesis shows that the Zymoseptoria species have unusual genome plasticity, which is characterized by the occurrence of accessory chromosomes and by structural changes associated with repetitive elements. Further, the results of population genomic analyses show that genetic diversity is much higher in the wheat pathogen Z. tritici compared to the wild grass associated pathogens Z. ardabiliae and Z. brevis. The results of this thesis connect the observed differences in genetic diversity levels between the species with differences in demographic events during their evolution. Genome-wide analyses of signatures of selection reveal a much higher number of genes with signatures of positive selection in the wheat pathogen Z. tritici compared to Z. ardabiliae and Z. brevis. Further, an ABC transporter candidate shows signatures of positive directional and positive diversifying selection in Z. tritici. Previous already studies connected ABC transporters with virulence and drug resistance in this species making this ABC transporter candidate an interesting candidate for future analyses. In this thesis, the detection of effector candidates, a class of proteins that are known to be important for modulating the immune system of the host, indicates the importance of species-specific effectors on host adaptation

The evolution of immune genes in tsetse flies (Glossina) and insights into tsetse-symbiont-trypanosome interactions

Tsetse flies (genera Glossina) are the sole biological vectors of African Trypanosoma species, the infectious agents of African Trypanosomiasis. Vector control is a key inhibitor of disease transmission; however, long-term control measures are economically and ecologically unsustainable and therefore, alternatives must be explored. In this thesis we aim to explore the evolution of three important immune genes: attacin-A (AttA), Defensin (Def) and Toll-like receptor 2 (TLR2), in relation to symbionts and parasitic interactions. This could in turn lay the foundations for genetic control methods The successful identification of novel attacin orthologues confirmed the previous descriptions of attacin clusters within the Glossina genome, while a single novel defensin orthologue was identified in each of the six Glossina genomes. A total of six TLRs were confirmed within the Glossina genome, and three additional TLRs were potentially identified, though these are unconfirmed. The evolutionary history of the attacin cluster remains undetermined, however concerted evolution likely impacts the evolution of AttA, while Def and TLRs are governed by strict Darwinian selection. A wild population sample of Glossina morsitans morsitans illustrated differing levels of nucleotide variation in each gene, Def being the least polymorphic (n = 8) and TLR2 being the most (n = 22). All genes indicated a recent population expansion event and deviations from neutrality, indicative of population expansion and balancing selection. Genetic variation in both AttA and TLR2 was found to be maintained via purifying selection, while Def exhibited signs of the Red Queen arms race and balancing section. Trypanosome infection rates were unexpectedly high (69.35%), consisting of mixed species infections. Advantageous Def variants were observed to reduce infection rates within samples, while an observable relationship between TLR2 and symbiont variation, and infection rate requires further research. The results within described the impacts of evolution and population change on immune genes and how the interactions with symbiont populations can influence trypanosome infection rates. This thesis indicates that an understanding of the evolution and interactions of the tsetse-symbiont-trypanosome triplet could be used to inform novel genetic control methods

Population analysis of Hyla arborea and Hyla meridionalis (Amphibia, Anura) in Portugal:a molecular genetic and bioacoustic approach

Tese de doutoramento, Biologia (Biodiversidade), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013The focus of this work is on the species of Hylids (Amphibia, Anura) present in Portugal, Hyla meridionalis and Hyla arborea (=H. molleri), to examine the geographic patterns of genetic and mating calls diversity. The aim is to determine the patterns of variation of genetic and bioacoustic markers between populations, exploring how the current distribution patterns were influenced by the origins, colonization events of both species, and finally their evolutive history. For comparison and biogeographically integrative reasons, information from outside Portugal is used. The genetic and bioacoustic analyses revealed different diversity patterns among the studied populations of both species. Iberian H. arborea is highly divergent from European taxon, supporting the ressurection of H. molleri species. Within Iberia two distinct groups, ‘North’ and ‘South’, were identified, having the southern one higher haplotype diversity, a pattern seen in other Iberian amphibians. A different pattern was however seen at the bioacoustic level. Populations did not cluster into groups, and no significant differences were found between populations. In H. meridionalis COI analysis corroborated previous results, with three well differentiated clades identified, all with little genetic diversity within groups. Tunisia and Algeria specimens were highly divergent from all other, suggesting an ancient split between the two lineages. Advertisement calls showed little diversity between populations. In syntopy, the presence of males of the other species calling apparently has little effect on advertisement calls: only frequencies and call duration of H. meridionalis were significantly smaller in sympatry. Being unlikely the hypothesis of reproductive character displacement of mating calls. This, together with the absence of F1 hybrids in the studied sites (although earlier studies have reported their presence) and of any sign of introgression in adults and tadpoles, suggests a rare occurrence of heterospecific mating, and that advertisement calls are an effective premating barrier.As relas do género Hyla da Europa e do Norte de África pentencentes à família Hylidae, da ordem dos Anuros, repartem-se por duas espécies na Península Ibérica, a rela-europeia, Hyla arborea e a rela-meridional, H. meridionalis. Durante muito tempo estas duas espécies, bem como outras do mesmo género que habitam o continente europeu, eram consideradas meras subspécies de H. arborea. Estudos morfológicos, genéticos e bioacústicos foram contudo determinando a atribuição do seu carácter de espécie a muitas destas formas. Actualmente são 16 reconhecidas espécies repartidas por dois grandes grupos, H. arborea e H. japonica, correspondentes aos extremos da sua área de distribuição global, uma a ocidente da Eurásia e outro no seu extremo Oriental. Considerada uma espécie distinta da sua congénere por critérios morfológicos, imunológicos e bioacústicos (estes últimos salienta-se serviriam de base ao seu reconhecimento original. A H. meridionalis, é peculiarmente o único Hilídeo que ocorre em África. As chamadas de acasalamento dos machos, comparadas com as da H. arborea, são mais longas (aproximadamente cinco vezes para a mesma temperatura ambiental) e mais graves (as suas frequências são relativamente mais baixas). Estudos genéticos recentes baseados na análise de ADN mitocondrial e nuclear, sugerirem que a H. meridionalis se caracteriza por uma baixa diversidade genética patente nas amostras provenientes dos dois clados bem diferenciados: 1) um ocidental que inlcui Marrocos, o Sudoeste da Europa (incluindo a Península Ibérica) e as ilhas Canárias e 2) um oriental que inclui a Tunísia. As amostras pertencentes à Tunísia formariam um clado altamente divergente das restantes, o que sugere ter havido uma separação bastante antiga destas duas linhagens. A presente distribuição da espécie teria resultado de dois grandes eventos de dispersão a partir do Norte de África provavelmente recentes (e a introdução, mediada por humanos ou em ‘jangadas’ naturais arrastadas por correntes, nas Ilhas Canárias e na Madeira). Um primeiro evento de dispersão, mais antigo, teria ocorrido com a colonização do Sul da Península Ibérica por indíviduos vindos originalmente do Sul de Marrocos, que teriam migrado primeiro para o Norte de Marrocos e daí para a Península Ibérica. Num segundo evento, mais recente, como atrás referimos, alguns elementos provenientes do Norte de Marrocos teriam sido introduzidos na costa mediterrânica de França e daí migrado para Norte, Este e Sul, ocupando o Sul de França e o Nordeste de Espanha. As diferenças encontradas entre estes indivíduos e os do primeiro evento de expansão (pertencem a dois grupos distintos), podem ser resultado de uma recolonização do Norte de Marrocos, após a primeira dispersão para o continente europeu, por uma população com algum grau de diferenciação genética em relação aos primeiros. Quanto à H. arborea, os seus estudos são geralmente mais abrangentes do ponto de vista geográfico, uma vez que a distribuição da espécie se estende desde a Europa Central até à Pensínsula Ibérica. Recentemente, a descrição da variabilidade genética ao nível dos ADN mitocondrial e nuclear, de muitas das suas populações europeias, demonstrou a existência de grupos altamente diferenciados e com uma forte associação com a sua distribuição geográfica. Alguns desses grupos correspondem a espécies actualmente aceites como espécies distintas de que falámos, como são os casos da H. sarda (endémica da Sardenha e da Córsega), H. orientalis (presente na Europa do Leste, nomeadamente, Ucrânia, Roménia e Turquia), H. savignyi (Médio Oriente, incluindo Chipre, Turquia, Síria, Irão e Iraque), e da H. intermedia (sul de Itália, na Península Apenina e na Sicília). Um dos resultados concordantes nos vários estudos realizados foi a acentuada diferenciação genética entre H. arborea da Europa Central e a da Península Ibérica, tendo sido, por isso, proposta a ressureição, da antiga sugestão, do carácter de espécie distinta para a forma da Península Ibérica, Hyla molleri Bedriaga 1890. Na Península Ibérica estas duas espécies ocorrem em simpatria numa vasta área das suas distribuições geográficas, e são conhecidas várias situações de sintopia em que indíviduos das duas espécies partilham o mesmo charco (ou outra zona húmida). Através do canto de acasalamento, foram detectados híbridos (machos, dados serem estes os únicos a emitir chamadas) em Portugal e Espanha. Todos os híbridos encontrados apresentavam características intermédias às das espécies parentais relativamente às chamadas de acasalamento, aos padrões de variação de aloenzimas (híbrido encontrado em Portugal). A nível morfológico, a banda lateral em alguns elementos estendia-se até metade dos flancos ou apresentava um ‘escudo’ rudimentar na região inguinal (típico da H. arborea). Todos os indivíduos híbridos capturados, revelaram ser estéreis, com testículos sem células espermatogénicas. Com base nestes conhecimentos prévios, estabelecemos como objectivo central desta tese o aprofundar do estudo sobre a história evolutiva de H. arborea e H. meridionalis, na tentativa de avaliar, confirmando ou infirmando as hipóteses anteriormente formuladas com recurso a uma dupla abordagem genética e bioacústica, acerca dos vários aspectos que poderiam informar o melhor conhecimento do que podemos considerar as suas filogeografias e interrelação no nosso território. Assim, mais especificamente propusemo-nos 1) determinar os padrões biogeográficos da diversidade genética das populações das duas espécies na Pensínsula Ibérica (sobretudo em Portugal), utilizando diferentes marcadores moleculares, fazendo uma re-análise dos padrões filogeográficos, anteriormente propostos, ao nível da Europa e do Norte de África e uma análise a uma escala mais fina dos padrões ibéricos e mais em particular dos de Portugal; 2) paralelamente procurámos investigar quais os padrões geográficos da diversidade bioacústica em Portugal ao nível dos cantos de acasalamento dos machos de ambas as espécies, pelas potencialidades que este tipo de abordagem oferece em termos de contribuições de índole ecológica e evolutiva; e 3) tentar obter informação acerca das relações interespecíficas através da análise integrada de dados genéticos e bioacústicos, explorando aspectos ligados a eventuais processos de hibridação/introgressão das duas espécies e correlativamente da ocorrência de fenómenos de ‘deslocação de caracteres’. Nestas espécies para conseguirmos concretizar os objectivos propostos apostámos numa abordagem dupla e complementar, baseada na análise de dados genético-moleculares e bioacústicos. Para fazer face à parca amostragem, em estudos destas espécies, efectuados em Portugal, o esforço de amostragem (para recolha de tecido e para gravações áudio dos cantos de acasalamento) foi significativamente aumentado, tentando-se cobrir uma área bastante mais abrangente da área de distribuição das espécies. A amostragem de campo decorreu entre 2005-2010. Recolheram-se amostras de tecido de indivíduos adultos e de girinos e foram gravados os cantos de acasalamento dos machos de ambas as espécies. Para completar a cobertura geográfica no que refere a recolha de amostras para ulterior estudos genéticos, foram aproveitadas amostras cedidas por outros investigadores, bem como se usaram as sequências já publicadas em estudos anteriores. O gene escolhido do ADN mitocondrial foi o Citocromo Oxidase I (COI) dado ter já sido utilizado noutros estudos para estas mesmas espécies. No que concerne ao estudo das interacções das espécies, através da técnica de RFLP (do inglês, ‘Restriction Fragment Length Polymorphism’) testaram-se os indivíduos provenientes de locais sintópicos na busca de possíveis híbridos F1 e, paralelamente, compararam-se os pârametros dos cantos de acasalamento de machos de locais sintópicos com os de locais alopátricos (que serviram de referência). No que diz respeito à H. arborea, da análise das sequências de COI obtidas, confirmou-se a grande divergência entre o grupo europeu e ibérico, com um distância genética (p-uncorrected) de 0.125. Da análise destes dados resultou a obetnção de uma árvore filogenética robusta, em que estes dois clados são suportados por elevados valores de bootstrap. Corrobora-se assim a proposta expressa em estudos anteriores de revalidar a espécie Ibérica, H. molleri. Analisando separadamente as sequências obtidas de elementos da Península Ibérica obtiveram-se dois ‘grupos’, aqui denominados por ‘Norte’ e ‘Sul’, mas sem grande suporte ao nível da árvore filogenética. Os haplótipos pertenecentes ao grupo do ‘Norte’ distribuem-se na sua maioria a Norte do rio Mondego e no Noroeste de Espanha; os haplótipos do grupo ‘Sul’ ocupam as áreas a sul do rio Mondego e a costa Atlântica Nordeste da Ibéria. O último grupo apresenta uma diversidade haplotípica mais elevada que o grupo ‘Norte’, contrariando resultados de estudos anteriores efectuados para esta espécie, mas que estão de acordo com estudos efectuados sobre outros anfíbios ibéricos/portugueses. Ao nível da acústica não se observou este padrão com uma divisão Norte-Sul. Pelo contrário os parâmetros dos cantos de acasalamento revelaram-se homogéneos entre os vários locais amostrados, excepção feita ao local amostrado na Serra da Estrela (CFO) cujos valores da duração dos ‘grupos de chamadas’ e o número de chamadas por ‘grupo de chamadas’ são significativamente maiores que os dos demais locais amostrados. Esta diferença, não reflectida ao nível do ADN mitocondrial, poderia ser explicada pela altitude, tratando-se de um local acima dos 1500 m. Seria importante, no entanto, amostrar outros locais a altitudes semelhantes para comparar os cantos. Os padrões de diversidade genética de H. meridionalis estudados através da sequenciação do gene COI, revelaram a existência de dois clados robustos com elevados valores de bootstrap, um incluindo haplótipos da região da Tunísia e Argélia (TA) e outro que se subdivide em três subclados distintos, um de Marrocos Central (CM), e os outros dois subclados que partilham haplótipos com o Norte de África e a Europa. Um deles, denominando por ‘Norte de Marrocos’ (NM) inclui haplótipos de amostras provenientes do Norte de Marrocos e, na Europa, do Nordeste Ibérico, Sul de França e Itália, e também das ilhas Canárias. O outro subclado denominado ‘Sudoeste’ inclui haplótipos do sudoeste de Marrocos e do sudoeste da Península Ibérica. Estes resultados estão de acordo com os obtidos em estudos anteriores, e em conjunto com a baixa diversidade genética encontrada nos grupos Ibéricos quando comparados com os Africanos bem como a presença de haplótipos partilhados dos dois lados do Estreito de Gibraltar, vêm ao encontro da hipótese de ter havido uma colonização recente da Península Ibérica. A divergência entre o clado TA e os demais sugere uma divergência já antiga destes grupos, sendo até possível que se trate de um grupo tão diferenciado que possa pertencer a uma subespécie ou até espécie distinta. No subclado NM a presença de haplótipos partilhados aponta para uma colonização mais recente da Ibéria que a do subclado SW, em que não há partilha de haplótipos entre a Ibéria e África. No entanto, em qualquer dos casos, os baixos valores de diversidades haplotípica suportam a hipótese de uma colonização recente, pós abertura do Estreito de Gibraltar (~5.33 Mya, após a Grande Crise Messiânica durante a qual o Mediterrâneo ocidental secou), levando a supor que ou os animais terão usado ‘jangadas’ naturais ou então teriam sido transportados por humanos. Os cantos de acasalamento dos machos seguem este padrão de baixa diversidade entre populações, observado ao nível do ADN mitocondrial, não se verificando diferenças significativas. No que respeita ao nível do estudo da interacção das duas espécies, ao contrário do esperado, não foram encontrados elementos relevantes, nomeadamente da ocorrência de híbridos na natureza. Apesar do esforço de amostragem efectuado nas zona sintópicas, a análise de RFLP não revelou a presença de nenhum híbrido F1 ou retrocruzamento. Igualmente, da análise dos parâmetros dos cantos de acasalamento não se encontraram quaisquer indicíos que pudessem apontar nesse sentido. No entanto, a análise dos cantos mostrou que quando em simpatria os machos de H. meridionalis alteram alguns dos parâmetros das suas chamadas de acasalamento. Quer a frequência fundamental quer a frequência dominante apresentam valores médios mais baixos em situações de sintopia, assim como na duração das chamadas que foi, em média, inferior. Será difícil justificar com certeza a razão para estas diferenças, sendo que estudos sobre as preferências fonotácticas de fêmeas e experiências de playback com machos poderão ajudar a esclarecer esta matéria. No seu conjunto, os resultados obtidos realçam a importância da utilização de duplas abordagens como utilizámos, em que vias, em princípio, mais ou menos independentes, são usadas de forma complementar para tentar responder às questões referentes à determinação dos padrões espaciais e temporais da estrutura populacional destas espécies (e dos anuros e outros vertebrados em geral). O que fica ainda por esclarecer obriga à realização, idealmente num futuro próximo, de estudos utilizando de forma efectiva vários marcadores moleculares nomeadamente microssatélites, em particular no caso da H. arborea/H. molleri para tentar discernir qual a zona de fronteira entre as espécies e esclarecer melhor a estruturação populacional evidenciada pela existência dos dois grupos, ‘Norte’ e ‘Sul’. O uso de microssatélites e outros marcadores nucleares irá favorecer o estudo ainda mais aprofundado de potenciais casos de hibridação/introgressão, utilizando-se a acústica para explorar o valor que representam os cantos de acasalamento como barreira reprodutiva eficaz entre as espécies.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/16446/2004

Insight into the evolution of a plant pathogen: Comparative genomic analysis of the fungal maize pathogen Colletotrichum graminicola

[ES] Uno de los mayores problemas para el desarrollo de estrategias efectivas frente a hongos fitopatógenos es que, al igual que la mayoría de los microorganismos, presentan una gran plasticidad fenotípica y una extraordinaria capacidad de adaptarse a nuevos ambientes y/o de infectar nuevos huéspedes. En este contexto, resulta imprescindible determinar qué genes (u otras regiones del genoma) muestran evidencias de evolución adaptativa con el objetivo de identificar secuencias involucradas en virulencia. La evolución adaptativa puede ser descripta como la retención de cambios en el genoma que, de alguna manera, confieren ventajas adaptativas los individuos que los poseen. Las evidencias de evolución adaptativa pueden ser de distintos tipos: selección positiva actuando en secuencias homólogas, ganancia y pérdida de genes y/o reordenaciones estructurales en el genoma. Entre las enfermedades vegetales causadas por los hongos, la antracnosis es una de las más destructivas, causando pérdidas significativas en cultivos en los cinco continentes. Los agentes etiológicos mejor conocidos de la enfermedad son ciertas especies del hongo filamentoso Colletotrichum, que infecta prácticamente todas las familias de plantas de interés agronómico u hortícola, con la consecuencia de pérdidas económicas significativas. Además, los hongos del género Colletotrichum representan importantes modelos experimentales en estudios relacionados con diversos aspectos de la fitopatología, como ser enzimas degradadoras de carbohidratos, procesos infectivos, resistencia del hospedador y biología molecular de las interacciones planta-patógeno. Muchas de las especies del género Colletotrichum presentan una forma de nutrición denominada hemibiotrofía, por lo que exhiben características tanto biotróficas como necrotróficas. En la presente Tesis Doctoral se han utilizado numerosas aproximaciones bioinformáticas para atender a diversas hipótesis relativas a la evolución y biología molecular de la patogenicidad en hongos filamentosos, haciendo hincapié en el patosistema C. graminicola-maíz. Para esto, nos hemos basado en el análisis de los genomas de ocho cepas de C. graminicola, una de ellas la recientemente secuenciada M1.001 y las restantes siete resecuenciadas por nuestro grupo. En el primer capítulo de la Tesis (Chapter I) se describen los procedimientos llevados a cabo para la secuenciación, ensamblaje y anotación de los nuevos genomas, como así también las características fenotípicas de dichos aislados. Por otra parte, por medio de análisis de los genomas, se presentan resultados concernientes a cuatro aspectos fundamentales de la genómica comparada de estos organismos: recombinación, relaciones filogenéticas, variaciones estructurales del genoma y ganancia-pérdida de genes. En el segundo capítulo (Chapter II) se analizan los patrones de selección natural actuando sobre secuencias codificantes y no codificantes de proteínas a nivel de todo el genoma. En el tercer capítulo (Chapter III) se detallan los resultados de la aplicación de una metodología bioinformática para la detección y anotación de ARNs no codificantes (ncRNAs) fúngicos a partir de secuencias públicamente disponibles. Finalmente, en el cuarto capítulo (Chapter IV), se analizan los patrones de selección positiva actuando sobre genes que codifican proteínas relacionadas con las defensas de las plantas entre miembros de las Poáceas. En general, la presente Tesis Doctoral ofrece un recurso importante para los fitopatólogos moleculares, ya que podría servir como guía para el análisis bioinformático de genomas de hongos fitopatógenos en busca de dianas para el desarrollo de estrategias de control. A su vez, el presente trabajo contribuye a mejorar nuestros conocimientos acerca de los procesos moleculares y evolutivos que tienen lugar durante las interacciones planta-patógeno

Genomics and spatial surveillance of Chagas disease and American visceral leishmaniasis

The Trypanosomatidae are a family of parasitic protozoa that infect various animals and plants. Several species within the Trypanosoma and Leishmania genera also pose a major threat to human health. Among these are Trypanosoma cruzi and Leishmania infantum, aetiological agents of the highly debilitating and often deadly vector-borne zoonoses Chagas disease and American visceral leishmaniasis. Current treatment options are far from safe, only partially effective and rarely available in the impoverished regions of Latin America where these ‘neglected tropical diseases’ prevail. Wider-reaching, sustainable protection against T. cruzi and L. infantum might best be achieved by intercepting key routes of zoonotic transmission, but this prophylactic approach requires a better understanding of how these parasites disperse and evolve at various spatiotemporal scales. This dissertation addresses key questions around trypanosomatid parasite biology and spatial epidemiology based on high-resolution, geo-referenced DNA sequence datasets constructed from disease foci throughout Latin America: Which forms of genetic exchange occur in T. cruzi, and are exchange events frequent enough to significantly alter the distribution of important epidemiological traits? How do demographic histories, for example, the recent invasive expansion of L. infantum into the Americas, impact parasite population structure, and do structural changes pose a threat to public health? Can environmental variables predict parasite dispersal patterns at the landscape scale? Following the first chapter’s review of population genetic and genomic approaches in the study of trypanosomatid diseases in Latin America, Chapter 2 describes how reproductive polymorphism segregates T. cruzi populations in southern Ecuador. The study is the first to clearly demonstrate meiotic sex in this species, for decades thought to exchange genetic material only very rarely, and only by non-Mendelian means. T. cruzi subpopulations from the Ecuadorian study site exhibit all major hallmarks of sexual reproduction, including genome-wide Hardy-Weinberg allele frequencies, rapid decay of linkage disequilibrium with map distance and genealogies that fluctuate among chromosomes. The presence of sex promotes the transfer and transformation of genotypes underlying important epidemiological traits, posing great challenges to disease surveillance and the development of diagnostics and drugs. Chapter 3 demonstrates that mating events are also pivotal to L. infantum population structure in Brazil, where introduction bottlenecks have led to striking genetic discontinuities between sympatric strains. Genetic hybridization occurs genome-wide, including at a recently identified ‘miltefosine sensitivity locus’ that appears to be deleted from the majority of Brazilian L. infantum genomes. The study combines an array of genomic and phenotypic analyses to determine whether rapid population expansion or strong purifying selection has driven this prominent > 12 kb deletion to high abundance across Brazil. Results expose deletion size differences that covary with phylogenetic structure and suggest that deletion-carrying strains do not form a private monophyletic clade. These observations are inconsistent with the hypothesis that the deletion genotype rose to high prevalence simply as the result of a founder effect. Enzymatic assays show that loss of ecto-3’-nucleotidase gene function within the deleted locus is coupled to increased ecto-ATPase activity, raising the possibility that alternative metabolic strategies enhance L. infantum fitness in its introduced range. The study also uses demographic simulation modelling to determine whether L. infantum populations in the Americas have expanded from just one or multiple introduction events. Comparison of observed vs. simulated summary statistics using random forests suggests a single introduction from the Old World, but better spatial sampling coverage is required to rule out other demographic scenarios in a pattern-process modelling approach. Further sampling is also necessary to substantiate signs of convergent selection introduced above. Chapter 4 therefore develops a ‘genome-wide locus sequence typing’ (GLST) tool to summarize parasite genetic polymorphism at a fraction of genomic sequencing cost. Applied directly to the infection source (e.g., vector or host tissue), the method also avoids bias from cell purification and culturing steps typically involved prior to sequencing of trypanosomatid and other obligate parasite genomes. GLST scans genomic pilot data for hundreds of polymorphic sequence fragments whose thermodynamic properties permit simultaneous PCR amplification in a single reaction tube. For proof of principle, GLST is applied to metagenomic DNA extracts from various Chagas disease vector species collected in Colombia, Venezuela, and Ecuador. Epimastigote DNA from several T. cruzi reference clones is also analyzed. The method distinguishes 387 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in T. cruzi sub-lineage TcI and an additional 393 SNPs in non-TcI clones. Genetic distances calculated from these SNPs correlate with geographic distances among samples but also distinguish parasites from triatomines collected at common collection sites. The method thereby appears suitable for agent-based spatio-genetic (simulation) analyses left wanted by Chapter 3 – and further formulated in Chapter 5. The potential to survey parasite genetic diversity abundantly across landscapes compels deeper, more systematic exploration of how environmental variables influence the spread of disease. As environmental context is only marginally considered in the population genetic analyses of Chapters 2 – 4, Chapter 5 proposes a new, spatially explicit modelling framework to predict vector-borne parasite gene flow through heterogeneous environment. In this framework, remotely sensed environmental raster values are re-coded and merged into a composite ‘resistance surface’ that summarizes hypothesized effects of landscape features on parasite transmission among vectors and hosts. Parasite population genetic differentiation is then simulated on this surface and fitted to observed diversity patterns in order to evaluate original hypotheses on how environmental variables modulate parasite gene flow. The chapter thereby makes a maiden step from standard population genetic to ‘landscape genomic’ approaches in understanding the ecology and evolution of vector-borne disease. In summary, this dissertation first demonstrates the power of population genetics and genomics to understand fundamental biological properties of important protist parasites, then identifies areas where analytical tools are missing and creates new technical and conceptual frameworks to help fill these gaps. The general discussion (Chapter 6) also outlines several follow-up projects on the key finding of meiotic genetic signatures in T. cruzi. Exploiting recently developed T. cruzi genome-editing systems for the detection of meiotic gene expression and heterozygosis will help understand why and in which life cycle stage some parasite populations use sex and others do not. Long-read sequencing of parental and recombinant genomes will help understand the extent to which sex is diversifying T. cruzi phenotypes, especially virulence and drug resistance properties conferred by surface molecules with repetitive genetic bases intractable to short-read analysis. Chapter 6 also provides follow-up plans for all other research chapters. Emphasis is placed on advancing the complementarity, transferability and public health benefit of the many different methods and concepts employed in this work

Culture-free genome-wide locus sequence typing (GLST) provides new perspectives on Trypanosoma cruzi dispersal and infection complexity

El análisis del polimorfismo genético es una poderosa herramienta para la vigilancia epidemiológica y investigar. Sin embargo, la inferencia poderosa de la variación genética del patógeno es a menudo restringido por el acceso limitado al ADN objetivo representativo, especialmente en el estudio de especies parásitas obligadas para las cuales el cultivo ex vivo requiere muchos recursos o es propenso a sesgos. Los métodos modernos de captura de secuencias permiten analizar directamente la variación genética de los patógenos del material del huésped/vector, pero a menudo son demasiado complejos y costosos para entornos de escasos recursos donde prevalecen las enfermedades infecciosas. Este estudio propone un método sencillo y rentable Herramienta de tipificación de secuencias de locus de todo el genoma (GLST) basada en la amplificación paralela masiva de puntos críticos de información en todo el genoma del patógeno objetivo. el multiplexado La reacción en cadena de la polimerasa amplifica cientos de objetivos genéticos diferentes definidos por el usuario en un único tubo de reacción y la posterior limpieza basada en gel de agarosa y código de barras completan la preparación de la biblioteca por menos de 4 USD por muestra. Nuestro estudio genera un modelo flexible Flujo de trabajo de diseño de panel de imprimación GLST para Trypanosoma cruzi, el agente parásito de Chagas enfermedad. Aplicamos con éxito nuestro panel GLST de 203 objetivos a extractos nómicos metagénicos directos y sin cultivo de vectores triatominos que contienen un mínimo de 3,69 pg/μl de ADN de T. cruzi y elaborar más sobre el rendimiento del método mediante la secuenciación de bibliotecas GLST de T. cruzi clones de referencia que representan unidades de tipificación discretas (DTU) TcI, TcIII, TcIV, TcV y TcVI. Los 780 sitios SNP que identificamos en el conjunto de muestras distinguen parásitos de forma repetitiva infectar vectores simpátricos y detectar correlaciones entre distancias genéticas y geográficas a escala regional (< 150 km), así como continental. Los marcadores también separan claramente TcI, TcIII, TcIV y TcV + TcVI y parecen distinguir infecciones multiclonales dentro de TcI. Discutimos las ventajas, limitaciones y perspectivas de nuestro método a través de un espectro de la investigación epidemiológica.Analysis of genetic polymorphism is a powerful tool for epidemiological surveillance and research. Powerful inference from pathogen genetic variation, however, is often restrained by limited access to representative target DNA, especially in the study of obli gate parasitic species for which ex vivo culture is resource-intensive or bias-prone. Mod ern sequence capture methods enable pathogen genetic variation to be analyzed directly from host/vector material but are often too complex and expensive for resource-poor set tings where infectious diseases prevail. This study proposes a simple, cost-effective ‘genome-wide locus sequence typing’ (GLST) tool based on massive parallel amplifica tion of information hotspots throughout the target pathogen genome. The multiplexed polymerase chain reaction amplifies hundreds of different, user-defined genetic targets in a single reaction tube, and subsequent agarose gel-based clean-up and barcoding com pletes library preparation at under 4 USD per sample. Our study generates a flexible GLST primer panel design workflow for Trypanosoma cruzi, the parasitic agent of Chagas disease. We successfully apply our 203-target GLST panel to direct, culture-free metage nomic extracts from triatomine vectors containing a minimum of 3.69 pg/μl T. cruzi DNA and further elaborate on method performance by sequencing GLST libraries from T. cruzi reference clones representing discrete typing units (DTUs) TcI, TcIII, TcIV, TcV and TcVI. The 780 SNP sites we identify in the sample set repeatably distinguish parasites infecting sympatric vectors and detect correlations between genetic and geographic dis tances at regional (< 150 km) as well as continental scales. The markers also clearly sep arate TcI, TcIII, TcIV and TcV + TcVI and appear to distinguish multiclonal infections within TcI. We discuss the advantages, limitations and prospects of our method across a spectrum of epidemiological research

Comparative genomics and epidemiology of the amphibian-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis

The primary aim of this thesis was to study the population structure and epidemiology of the fungal pathogen of amphibians, Batrachochytrium dendrobatidis (Bd). I have addressed these questions by collecting and isolating Bd from multiple infected host species. I have then extracted and sequenced whole nuclear and mitochondrial genomes for 50 isolates of Bd using the ABI SOLiD 3 and Illumina HiSeq 2000 platforms. The first aspect of the analysis was to tailor a new method for identifying variant sites amongst the isolates, as well as verifying the accuracy of the alignment and SNP-calling methods. Next, using a number of phylogenetic methods, I identified a population split into at least three deeply divergent lineages. Two of these lineages were found in multiple continents and are associated with known introductions by anthropogenic means. Isolates belonging to one clade, which we named the Global Panzootic Lineage (BdGPL), have emerged across at least five continents and are associated with the onset of epizootics in all five continents we tested. Dating the divergence between BdGPL isolates suggested a recent common ancestor in the 20th Century, and that the widespread trade of amphibians is an important mechanism of transmission. In contrast, BdGPL diverged from the other two lineages approximately 1000 years ago, clearly refuting a single emergence hypothesis. The two newly identified divergent lineages were the Cape lineage (BdCAPE) that appeared to have originated from the Cape Province in South Africa and a Swiss lineage (BdCH) comprised of a single isolate from a pond in Gamlikon, Switzerland. The secondary aim of this thesis was to identify and compare virulence determinants and other genomic features responsible for known differences in phenotypes. Using a variety of statistical and computational methods, I identified compelling evidence for genetic recombination targeting virulence factors, selection of those and other virulence factors, and rapid changes in ploidy and aneuploidy amongst the isolates of all three lineages. These genomic features shed light on the emergence, patterns of global spread, and modes of evolution in the pathogen(s) responsible for contemporary disease-driven losses in amphibian biodiversity. Finally, I discuss how these findings update our understanding of Bd and the importance for tracking and understanding the dynamics of other current emerging pathogens in an increasingly globalised habitat.Open Acces